Munc 18-1相互作用蛋白3變化對嚴重肝纖維化患者肝癌發病率和死亡率的影響*

閆會君 齊雙玉 賀紅晶 崔琳琳 許丙輝

1.衡水市人民醫院肝膽胰外科 (河北 衡水,053000) 2.衡水市第四人民醫院 腦電圖科

肝纖維化是一種慢性肝損傷,主要由乙型和丙型肝炎病毒慢性感染、過量飲酒、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、自身免疫性肝病和遺傳性疾病引起,以肝彌漫性纖維化、彌漫性炎癥、再生結節、假小葉等是其主要特征[1]。流行病學研究表明,肝纖維化是發生肝細胞癌(HCC)的最大危險因素,80%～90% HCC患者確診時具有肝纖維化[2],對肝纖維化向HCC進展進行干預可有效降低HCC發生率[3],因此尋找與肝纖維化進展為HCC具有密切相關性的生物標志物是研究重點。Munc18-1相互作用蛋白3(Mint3)是廣泛存在于全身各種組織中的一種參與膜蛋白信號傳導與運輸的多結構域蛋白,被稱為缺氧誘導因子-1(HIF-1)的激活劑[4],其可通過激活癌細胞和巨噬細胞中的HIF-1,促進糖酵解產生ATP[5],且研究證實Mint3可在體外實驗中通過細胞-細胞接觸依賴的方式促進腫瘤細胞增殖和腫瘤生長[6]。但Mint3在肝纖維化向HCC的進展過程中的作用尚未見相關報道。因此本研究通過對肝纖維化患者進行穿刺活檢定期監測其肝組織內Mint3表達,長期隨訪肝纖維化患者HCC發病率與死亡率,旨在為肝纖維化進展為肝癌找到新的阻斷方法。

1 資料與方法

1.1 研究對象 以2018年1月至2019年1月因肝纖維化住院需行肝穿刺活檢的230例患者為研究對象,男性149例,女性81例;年齡45～70歲,平均(46.72±11.30)歲。纖維化分期S0、S1、S2、S3、S4期分別有5、30、98、79、18例。對研究對象定期監測Mint3表達情況,以病理診斷或者兩種增強影像學提示為肝癌,截至2022年12月以是否發生肝癌分為兩組:發生肝癌組(82例)、未發生肝癌組(148例)。其中發生肝癌組根據患者是否死亡分為肝癌死亡組(47例)肝癌存活組(35例)。

1.2 納入及排除標準 納入標準:①符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015 年版)》[7]中肝纖維化診斷標準,包括慢性病毒性肝炎、自身免疫性肝病、酒精性肝病等所致的肝纖維化患者;②入院需進行肝穿刺確定病情進展的患者;③臨床資料完整;④依從性較好;⑤無其他惡性腫瘤;⑥隨訪滿3年。排除標準:①既往診斷為肝癌、肝衰竭或肝移植者;②合并血液系統疾病患者;③合并肝臟血管畸形患者;④合并精神疾病患者;⑤合并自身免疫疾病患者;⑥中途退出研究者及臨床資料不全者。本研究獲得醫院倫理委員會批準(倫理批號:201802025),研究對象及家屬簽署知情同意書。

1.3 研究方法

1.3.1 隨訪方法 基線日期為患者入院診斷為肝纖維化的時間,隨訪3年,觀察終點為確診為肝癌或隨訪時間滿3年及隨訪期間死亡,以患者隨訪結束前或死亡前最后一次血液檢測為截至日期。每6～12個月抽取患者靜脈監測Mint3水平,常規進行肝功能檢查和甲胎蛋白(AFP)檢查。HCC診斷主要依據為活檢病理學檢查,若組織學檢查不具有診斷性,根據AFP>20 μg/L聯合影像學特征進行診斷。

1.3.2 肝組織活檢 檢測患者血小板計數、凝血酶原活動度、凝血酶原時間、血小板計數等指標,確定患者符合肝穿刺活檢適應證后,在超聲定位下通過穿刺槍行肝臟組織穿刺術,取肝組織10 mm×1 mm,10%福爾馬林固定后送病理檢查,確定患者是否發生肝癌。

1.3.3 免疫組化檢測組織內Mint3 肝組織常規脫水處理,石蠟包埋后切片,后進行Mint3免疫組化染色,PBS代替一抗染色作為陰性對照組。免疫組化通過Leica Bond Max自動免疫組化儀完成,多聚賴氨酸處理玻片,步驟如下:二甲苯進行切片脫石蠟處理,梯度乙醇進行脫水處理;0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖液修復Mint3,時長為20 min,后Water buffer進行3次洗滌;切片內加入30 g/L過氧化氫甲醇溶液,避光15 min后用PBS洗滌3次,每次時長為5 min;加入山羊血清工作液(在37℃條件下);添加一抗后孵育過夜,PBS沖洗3次,每次時長為10 min;后加入二抗,孵育30 min(在37℃條件下)。PBS沖洗3次,每次時長為5 min;辣根過氧化物酶標記的鏈親和素滴加,孵育30 min(在37℃條件下),PBS沖洗3次,每次時長為5 min;顯色處理后用蒸餾水沖洗停止染色;蘇木精復染后樹膠密封。每張切片隨機選取10個視野,通過TPP彩色圖像分析軟件測定每一視野中Mint3含量,取10個視野平均值作為本切片陽性染色含量。面密度為彩色圖像分析軟件測定單位。

1.3.4 血清指標檢測 清晨抽取患者空腹血標本5 ml外周靜脈血,3 000 r/min離心處理,時長為10 min,取上清,冰箱保存待測,通過逆轉錄聚合酶鏈反應檢測血清中Mint3水平。磁微?；瘜W發光法檢測肝纖維化4項:透明質酸(HA)、層黏連蛋白(LN)、Ⅲ型前膠原N端肽(PC Ⅲ)和Ⅳ型膠原(Ⅳ-C),通過化學發光儀Autolumo A2000 Plus(鄭州安圖生物工程股份有限公司)以及其配套試劑檢測完成?；瘜W發光法檢測AFP,通過DXI800全自動免疫分析系統及其配套試劑完成。

1.4 觀察指標 ①定期監測比較兩組患者3年內血清Mint3表達水平;②比較發生肝癌組患者死亡與未死亡Mint3相關性;③比較兩組患者肝纖維化4項、AFP等;④分析Mint3表達與肝功能、AFP相關性;⑤分析肝纖維化發生肝癌的影響因素;⑥ROC曲線評價Mint3對肝纖維化發生肝癌的預測價值;⑦Kaplan-Meier曲線比較不同Mint3表達水平肝癌患者生存情況。

2 結果

2.1 發生肝癌組與未發生肝癌組患者血清Mint3含量比較 隨訪期內兩組患者血清Mint3含量比較見表1。將發生肝癌組根據是否死亡分為發生肝癌死亡亞組與肝癌存活亞組,各隨訪節點患者血清Mint3含量比較見表2。

表1 發生肝癌組與未發生肝癌組患者隨訪期內血清Mint3含量比較

表2 肝癌死亡組與肝癌存活組患者隨訪期內血清Mint3含量比較

2.2 免疫組化檢測 對患者肝組織進行免疫組化結果顯示,發生肝癌患者肝組織中Mint3表達顯著高于未發生肝癌患者(P<0.05)。見圖1。

圖1 免疫組化檢測結果(HE染色×200)

2.3 兩組患者入院時肝纖維化4項與AFP比較 見表3。

表3 發生肝癌組與未發生肝癌組入院肝纖維化4項與AFP比較

2.4 入院時Mint3與是否發生肝癌、發生肝癌是否死亡以及臨床指標相關性 見表4。

表4 Mint3與肝癌發生、肝癌死亡、肝纖維化4項、AFP相關性

2.5 肝纖維化發生肝癌多因素分析 以肝纖維化患者最終是否發生肝癌為因變量,以入院時Mint3以及表3中差異有統計學意義的變量為自變量進行多因素分析,結果顯示Mint3、HA、LN、PC-Ⅲ、Ⅳ-C以及AFP是肝纖維化患者發生肝癌的危險因素(P<0.05)。見表5。

表5 肝纖維化發生肝癌多因素分析

2.6 Mint3預測肝纖維化發生肝癌ROC曲線 ROC曲線得出入院Mint3值預測肝纖維化發生肝癌的AUC值為0.828,95%CI=0.720～0.951,P<0.001,靈敏度為0.762,特異度為0.898;預測肝纖維化發生肝癌死亡的AUC值為0.750,95%CI=0.578～0.830,P<0.001,靈敏度為0.693,特異度為0.798。見圖2,3。

圖2 Mint3預測肝纖維化發生肝癌的ROC曲線

2.7 肝纖維化患者發生肝癌后生存曲線 每位患者監測5次Mint3值,取均值計算本研究總Mint3平均值,以≤平均值為低水平,>平均值為高水平,肝纖維化患者發生肝癌后Mint3低水平患者生存率高于高水平患者,差異有統計學意義(χ2=11.272,P<0.001)。見圖4。

圖4 Mint3表達相關生存曲線

3 討論

多項研究表明Mint3在病理條件下可作為癌細胞、巨噬細胞以及癌癥相關成纖維細胞中的HIF-1的激活劑[8],而HIF-1在各種實驗模型中對癌癥發生發展以及治療均具有重要作用[9,10]。同時有研究證實敲除Mint3的小鼠表現出對癌癥的抑制轉移,且Mint3缺失可抑制乳腺癌、肺癌、胰腺癌以及纖維肉瘤等各類型癌癥的腫瘤生長,增強癌細胞的化學敏感性[11-13],但是Mint3在肝癌發生發展中的相關研究目前較少。而本研究通過對肝纖維化患者進行動態監測血清內Mint3含量,發現以發生肝癌為結局的患者隨訪3年內Mint3含量顯著高于未發生肝癌的患者,且發生肝癌組患者隨著肝纖維化的加重Mint3含量隨之增加。同時本研究還發現發生肝癌患者中死亡患者血清中Mint3含量顯著高于存活患者。提示Mint3可能與肝纖維化的發生和發展密切相關,監測Mint3可能對肝纖維化的治療和疾病進展具有重大意義,Mint3有希望作為肝纖維化進展為肝癌的標記物。

肝纖維化是慢性乙型肝炎病變的基礎,肝內炎癥活動造成肝細胞持續損傷以及肝結構遭到破壞,進而進展為肝癌[14]。研究發現Mint3在病毒感染巨噬細胞時被顯著誘導[15]。而Mint3可通過促進K63鏈接的TNF受體相關因子3多泛素化進一步增強使乙型肝炎病毒感染巨噬細胞加重,而Mint3也會被進一步增強誘導,表達率增加[16,17]。也有研究發現Mint3在不同肝纖維化患者中差異化表達的原因可能與其通過與FIH-1結合激活HIF-1,進而干擾FIH-1與HIF-1之間相關作用有關[18]。且已有研究證實Mint3可在某些類型的癌細胞中與FIH-A相互作用[19]。本研究患者穿刺肝組織進行免疫組化結果顯示,Mint3在未發生肝癌患者肝組織中表達顯著高于發生肝癌患者,這說明高Mint3水平肝纖維化患者發生肝癌的概率更高,且高Mint3水平發生死亡的風險也更高。提示Mint3可能對肝纖維化進展為肝癌和肝癌加重死亡具有重要預示意義。另外本研究通過相關性分析發現Mint3含量與肝纖維化患者是否發生肝癌、發生肝癌患者是否死亡、LN、HA、PC-Ⅲ、Ⅳ-C、AFP具有顯著正相關性,進一步證實了Mint3在肝纖維化進展為肝癌過程中發揮重要作用。并且我們通過相關性分析發現Mint3和HA、LN、PC-Ⅳ、Ⅴ-C以及AFP都是肝纖維化患者發生肝癌的危險因素。因此我們推測Mint3有可能是肝纖維化發生肝癌及肝癌死亡的監測標志物,另外本研究ROC曲線結果顯示,Mint3值預測肝纖維化發生肝癌的AUC值、靈敏度和特異度均較高,預測肝纖維化發生肝癌死亡的AUC值、靈敏度和特異度也較高。這進一步提示Mint3對肝纖維化進展為肝癌的潛在診斷價值。最后我們通過生存曲線證實肝纖維化患者發生肝癌后Mint3低水平患者生存率高于高水平患者。提示肝纖維化患者肝組織Mint3水平可能與肝纖維化進展為肝癌以及肝癌患者生存情況有關,但由于本研究樣本量較少,此結果具有一定局限性,有待臨床做進一步研究證實。

綜上所述,在肝纖維化患者病情進展過程中,Mint3水平與肝纖維化進展密切相關,Mint3升高可能能促進肝纖維化進展為肝癌,監測Mint3值有助于肝纖維化進展為肝癌的早期診斷以及預后。