HDAC2抑制劑CAY10683通過自噬對急性肝衰竭小鼠的保護作用*

張璐懿 石春霞 張丹眉 龔作炯

武漢大學人民醫院感染科 (湖北 武漢,430061)

急性肝衰竭(ALF)是一種死亡率很高的罕見的臨床疾病[1],其病理變化常表現為廣泛的肝臟壞死和細胞凋亡。在過去的40年里,由于重癥醫學專家醫療管理的改進和緊急肝移植技術的進步,ALF患者的發病率和死亡率都有所下降。此外,人工肝治療可以為自發性肝臟再生或緊急肝移植爭取時間[2]。然而,人工肝治療技術仍待優化,其是否能提高ALF患者的長期生存率仍需進一步驗證[3]。另外,肝移植高額費用和缺乏供體等一系列問題仍然存在。因此,ALF的治療仍然是一個嚴峻的臨床問題。

自噬過程在維持人類健康方面至關重要,最基本作用就是適應新陳代謝的需要。肝臟是人體的一個重要代謝器官,新陳代謝和能量供應在肝臟疾病期間對肝細胞的生存起著重要作用。UNC-51樣激酶1(ULK1)是一種重要的自噬分子,與肝病密切相關。ULK1的磷酸化可以保護細胞免受脂肪毒性的影響[4]。自噬和肝臟疾病的代謝之間存在著密切的聯系。

組蛋白去乙?；?HDACs)是表觀遺傳酶,在基因調控中發揮重要作用[5]。細胞代謝和HDACs之間的相互作用可以影響許多生物過程。組蛋白去乙?；?(HDAC1)和組蛋白去乙?；?(HDAC2)屬于Ⅰ類[6,7]。HDAC1可以對AMP依賴的蛋白激酶(AMPK)進行去乙?；鸵阴；{節,AMPK調節人肝細胞的脂質代謝和能量代謝[8]。HDAC2抑制劑CAY10683可以通過線粒體凋亡途徑在ALF中保護肝臟;抑制HDAC1/2的活性可以誘導自噬,自噬蛋白的功能喪失使HDAC抑制劑失去了其保護作用[9,10]。因此,HDAC2與代謝和自噬之間都有一定的聯系。本研究探討HDAC2抑制劑CAY10683在ALF小鼠模型中對小鼠肝臟自噬和代謝的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 C57BL/6小鼠購自湖南斯萊克景達公司,飼養于武漢大學人民醫院動物實驗中心的無特定病原體級(SPF)環境中。選取6～8周齡且體重20～25 g的雄性小鼠進行實驗。所有動物操作程序均已獲得武漢大學人民醫院實驗動物福利倫理審查委員會的批準。

1.2 藥物與試劑 D-氨基半乳糖(D-Gal)和脂多糖(LPS)購于Sigma公司,CAY10683和MRT68921購于Selleck公司,抗ULK1抗體和抗β-actin抗體購于Cell Signaling Technology公司,抗蘋果酸脫氫酶1(MDH1)購于Proteintech公司,葡萄糖試劑盒購于索萊寶公司,丙酮酸試劑盒和乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒購于Elabscience公司,乳酸試劑盒購于南京建成公司。

1.3 動物模型建立及處理 將C57BL/6小鼠飼養在溫度和濕度適應的SPF環境下,自由飲食,待小鼠適應環境后,選取40只小鼠隨機分為5組,每組8只:正常組、模型組、CAY10683組、MRT68921組和CAY10683/MRT68921聯合組。CAY10683組腹腔注射CAY10683 (3 mg/kg),MRT68921組腹腔注射MRT68921(5 mg/kg),CAY10683/MRT68921聯合組腹腔注射CAY10683(3 mg/kg)和MRT68921(5 mg/kg),2 h后模型組、CAY10683組、MRT68921組和CAY10683/MRT68921聯合組均腹腔注射D-Gal(400 mg/kg)和LPS(100 μg/kg)。24 h后氣體麻醉小鼠,摘除眼球取血,取血后頸椎脫臼法處死小鼠,快速分離肝組織,取一部分肝組織于多聚甲醛和電鏡固定液中固定,另一部分于液氮速凍30～60 s后放入凍存管中立即置于深低溫冰箱保存,用于后續檢測。

1.4 小鼠血清肝功能指標檢測 采用全自動生化分析儀檢測小鼠血清中丙氨酸氨基轉移酶(ALT)和天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)的水平。

1.5 小鼠肝組織蘇木精-伊紅染色(HE)觀察 肝組織固定完成后,包埋于石蠟中,切片,HE染色后封片,于正置顯微鏡下觀察,進行圖像采集。

1.6 小鼠肝組織透射電子顯微鏡觀察 用手術刀將浸在電鏡固定液中的組織切割成1 mm3的小組織塊,再將其轉移至裝有新的電鏡固定液的離心管繼續固定,4%保存,完成電鏡前染色和處理后,于透射電子顯微鏡下觀察,進行圖像采集。

1.7 小鼠肝組織蛋白與生化檢測 清洗并稱重肝組織,充分研磨裂解后4℃離心取上清液,部分用于蛋白質印跡法(Western blot)檢測組織中ULK1和MDH1的相對含量,加蛋白上樣緩沖液后混勻煮沸;另一部分用于生化檢測,按照試劑盒說明書檢測其中的葡萄糖、丙酮酸、乳酸和LDH的含量。

2 結果

2.1 各組小鼠肝組織形態及肝功能情況 正常組小鼠肝組織中的細胞排列整齊,無炎細胞浸潤,而模型組小鼠肝組織中無炎細胞浸潤與淤血,CAY10683降低了肝組織損傷的程度,而MRT68921加重了肝臟損傷,CAY10683對MRT68921有一定的拮抗作用,見圖1A。各組小鼠ALT、AST水平見圖1B、C。與正常組相比,模型組小鼠血清中ALT和AST水平大幅度增加(P<0.05);與模型組相比,CAY10683組小鼠ALT和AST水平較低(P<0.05),MRT68921組小鼠ALT和AST水平較高(P<0.05);CAY10683/MRT68921聯合組小鼠ALT和AST水平低于CAY10683組(P<0.05),高于MRT68921組(P<0.05)。

與正常組比較,#P<0.05;與模型組比較,*P<0.05;與模型組、CAY10683組和MRT68921組比較,&P<0.05

2.2 各組小鼠肝細胞自噬情況 正常組小鼠細胞器清晰,線粒體無腫脹,模型組小鼠線粒體腫脹明顯。在相同視野大小下,正常組小鼠的自噬小體數目較多,模型組的自噬小體數目較少。見圖2。

圖2 小鼠肝組織電鏡下形態(黑色箭頭指向自噬小體)

2.3 各組小鼠肝組織ULK1和MDH1相對表達量及糖代謝相關指標含量 與正常組相比,模型組小鼠肝組織中ULK1和MDH1的蛋白表達水平降低;與模型組相比,CAY10683組和CAY10683/MRT6892組小鼠肝組織ULK1和MDH1的蛋白表達水平升高,MRT68921組小鼠ULK1和MDH1的蛋白表達水平降低,見圖3A。與正常組相比,模型組小鼠肝組織中葡萄糖、丙酮酸、乳酸和LDH的水平升高;與模型組相比,CAY10683組和CAY10683/MRT6892組小鼠葡萄糖、丙酮酸、乳酸和LDH達水平降低,MRT68921組小鼠葡萄糖、丙酮酸、乳酸和LDH的水平升高,見圖3B。

與正常組比較,# P<0.05;與D-Gal/LPS模型組比較,* P<0.05)

3 討論

ALF發病迅速,死亡率高。D-Gal/LPS處理小鼠是一種經典的ALF造模方法。之前的研究發現,HDAC2抑制劑CAY10683對ALF小鼠具有保護作用[11]。在本研究中,HE病理和ALT、AST結果證實了其保護作用。

HDAC2與各種肝臟疾病有關。抑制HDAC2有助于預防非酒精性脂肪性肝炎[12]。HDACs過量表達可導致組蛋白乙?；牟黄胶夂娃D錄因子的改變,導致特定基因的異常抑制,從而參與疾病的發生和發展[13]。HDACs與自噬也有聯系,HDACs抑制劑通過增加組蛋白乙?；鸵阴?CoA的表達來增加機體壽命,細胞質乙酰CoA合成酶2核轉位可最終導致轉錄因子EB的表達,導致溶酶體生物生成和自噬增加[14]。HDACs抑制劑可抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路,導致自噬激活[15]。生物信息學分析發現,ULK1基因表達與HDAC2表達呈負相關[11]。本研究也證明了HDAC2抑制劑CAY10683在ALF小鼠模型中對自噬的激活。

自噬是一個進化上保守的應激反應過程,它將多余的或有潛在危險的細胞內容物,如受損的線粒體或者入侵的病原體運送到自噬體中,并最終將他們送到溶酶體中降解[16]。自噬體可以通過電子顯微鏡進行成像,不同組的肝臟樣本中自噬水平可以通過相同大小視野內的自噬小體數目進行估計。圖2在一定程度上說明了各組小鼠肝臟內的自噬水平情況。ULK1是自噬的起始,其蛋白含量可以說明自噬水平的高低。CAY10683可以提高ALF小鼠中的自噬水平,CAY10683/MRT68921聯合使用也在一定程度上提高了ALF小鼠的自噬水平,但是MRT68921降低了其自噬水平,因此,CAY10683可能可以拮抗MRT68921的作用,提高ALF小鼠中的自噬水平。

自噬最基本的作用是適應代謝的需要,葡萄糖代謝是人體內重要的能量供應途徑。糖酵解和氧化磷酸化(OXPHOS)是葡萄糖代謝的兩個重要過程。糖酵解產生丙酮酸,丙酮酸可被LDH轉化為乳酸,該過程在細胞質內發生,僅能產生少量能量;而當丙酮酸氧化生成乙酰CoA,參與三羧酸循環時,就能在線粒體中產生大量的能量[17]。OXPHOS的功能是實現細胞的能量轉換,OXPHOS的過程是在各種酶的幫助下,從營養物質代謝過程中產生的NADH或FADH2中獲取還原當量,并將其轉移到O2中產生水[18]。MDH1是一種細胞質的蘋果酸脫氫酶,主要催化草酰乙酸鹽氫化還原為蘋果酸鹽,MDH1對OXPHOS是必不可少的,其表達水平與組織中的OXPHOS水平密切相關[19]。之前肝細胞損傷研究中發現,自噬水平的增加可以提高肝細胞內的MDH1水平[20]。本研究中,CAY10683處理后,可能由于自噬水平的提高,ALF小鼠肝組織中MDH1的含量增加,而MRT68921組小鼠MDH1含量則有所下降。一項神經系統疾病的研究指出,當OXPHOS不足以為神經元提供所需的ATP時,增加糖酵解將有助于緩解能量不足,維持神經元的緊急能量需求[21]。在本研究中,ALF模型小鼠中的OXPHOS效率下降,導致糖酵解的能量需求更大。與D-Gal/LPS組相比,用MRT68921處理的小鼠肝組織內有更高的葡萄糖含量,產生更多的丙酮酸,并且由于氧化能力不足,產生更多的乳酸,LDH的活性增加。

雖然糖酵解可以暫時提供一些能量,但最好的解決辦法是恢復細胞的OXPHOS。OXPHOS系統位于線粒體中,線粒體被稱為細胞的動力室,產生細胞所需的大部分能量和ATP[22]。線粒體自噬是保證線粒體質量的一個重要途徑,其本質是一種選擇性的自噬降解,可以清除功能失調和多余的線粒體以維持能量平衡[23]。當自噬水平提高時,線粒體的質量在一定意義上得到改善。線粒體的質量提升一定程度上可恢復OXPHOS,改善能量供應,實現了對受損肝臟的保護作用。在本研究中,與D-Gal/LPS組相比,用CAY10683處理增加了肝組織自噬水平,其葡萄糖含量更低,產生的丙酮酸更少,而且由于氧化效率更高,產生的乳酸更少,LDH的活性也下降了,而用自噬抑制劑MRT68921處理的組則相反,CAY10683拮抗了MRT68921的作用。

在本研究ALF小鼠模型中,HDAC2抑制劑CAY10683提高了肝組織內自噬蛋白ULK1水平和代謝酶MDH1水平,拮抗自噬抑制劑MRT68921的作用,改善了代謝環境,對肝臟起到了一定的保護作用。HDAC2抑制劑CAY10683可能可以通過增強組織內自噬水平,改善組織內代謝環境以提供更好的能量供應,從而對小鼠肝臟起到保護作用。HDAC2抑制劑的作用對ALF的治療提供了一個可行的方向。