銅死亡相關基因在肝細胞癌中的生物信息學分析*

周 玲 唐梅文 劉文健 鄒起平

1.廣西中醫藥大學第一附屬醫院脾胃肝病科 (廣西 南寧,530000) 2.廣西中醫藥大學研究生院

肝細胞癌(HCC)是全球第五大常見惡性腫瘤,死亡率居第2位。且發病率正在持續增長,無論男性還是女性,發病率都比任何其他癌癥上升得更快。全球疾病負擔研究的一項系統分析表明,HCC的發病率和死亡率均居前10位癌癥之列,成人肝硬化死亡是HCC死亡的主要原因。肝癌的發生是一個多步驟且復雜的生物學過程,其中許多信號級聯發生改變,導致分子譜異質化,并最終導致腫瘤發生、進展和轉移[1]。且超過一半的肝癌患者在確診時已處于晚期,只有15%的患者適合根治性治療,由于缺乏診斷的生物標志物,患者5年生存率仍然很低,不超過20%[2]。近年來,許多研究表明,多種基因和細胞通路參與了HCC的發生和發展[3]。為更好地揭示HCC與銅死亡之間的聯系,本研究旨在對多組數據進行系統研究,通過生物信息學分析確定其對HCC的預后價值和治療意義。HCC數據和臨床信息來自癌癥基因組圖譜(TCGA),我們在癌變樣本和正常樣本之間鑒定HCC相關的差異表達基因(DEG),并先后進行GO富集分析、KEGG通路分析、生存分析和免疫功能相關分析,以探索與HCC密切相關的關鍵基因和通路。為探究HCC發生、發展過程中的分子機制及可用于臨床診療的分子生物學靶點提供可靠的理論依據。

1 材料與方法

1.1 數據的獲取與處理 數據來源從TCGA數據庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)下載HCC的轉錄組數據及相應的患者臨床信息,其中患者的臨床信息主要包括生存時間、生存狀態、年齡、性別、等級、階段、T階段、N階段和M階段。我們初步篩選了424例患者的轉錄組數據,其中正常50例,腫瘤374例。

1.2 銅死亡相關的LncRNAs的篩選 本文通過R軟件構建LncRNAs和銅死亡相關基因之間的共表達,即為銅死亡相關的LncRNAs。其篩選標準為:相關系數r≥0.4,P<0.001,篩選出的結果用?；鶊D進行可視化。

1.3 銅死亡預后相關LncRNA模型的構建 首先通過單因素Cox回歸分析、Kaplan-Meier生存分析和無進展生存期得到與HCC預后相關的銅死亡LncRNA(篩選的標準為P<0.05)。初步篩選與HCC患者預后有關的LncRNA;再次進行LASSO回歸,進一步篩選分析以減少數據的過度擬合,篩選關鍵且與銅死亡相關的LncRNA,LASSO回歸使用交叉驗證進行參數的選擇,并繪制LASSO回歸系數譜,最后進行多因素Cox回歸分析建立對HCC預后有價值的銅死亡相關LncRNA模型并以列線圖形式展示。根據多因素Cox回歸分析構建LncRNA的風險評分公式為:風險評分=∑ (相應系數×LncRNA的表達量)。

1.4 預后模型的驗證 通過Kaplan-Meier分析收集多個數據集中高低分線組之間的生存曲線,并繪制Kaplan-Meier曲線1、3、5 年的受試者操作特征(ROC)曲線、風險熱圖以及風險打分等評估該模型預測患者生存的能力,然后將風險文件與臨床數據合并后進行獨立預后分析,證明該模型是否可以獨立于其他臨床性狀,作為HCC患者的獨立預后因子,最后通過臨床因素的風險評分對臨床數據進行統計分析。

1.5 GO和KEGG富集分析 GO富集分析涵蓋生物學的三個方面:生物過程(BP)、分子功能(MF)和細胞成分(CC)。使用KEGG對交集基因進行信號通路富集分析。在本研究中通過org.Hs.eg.db R語言包獲得每個DEG的Entrez-ID后,進行GO和KEGG分析,并使用clusterprofiler、enrichment plot、ggplot2和circize R語言包對富集結果進行可視化。

1.6 腫瘤突變負荷(TMB)差異分析和生存分析 我們計算了每位患者的TMB,并將總患者按TMB閾值中值分為低TMB組和高TMB組,我們發現低TMB組腫瘤突變負荷高于高TMB組,隨后用R語言包分析HCC患者TMB差異和生存相關在高低風險組之間是否具有差異,進行可視化。

1.7 篩選疾病的潛在藥物 通過“pRRophetic”R語言包計算藥物的敏感性,可以將藥物的敏感性分為高低風險兩組,然后將風險文件與藥物敏感性的結果合并進行藥物敏感性分析,進行可視化。

2 結果

2.1 銅死亡預后相關LncRNA模型的構建 通過基因共表達分析,共得到375個銅死亡相關LncRNA,并以?；鶊D展示(圖1A)。單因素Cox回歸分析(過濾標準P<0.05)初步篩選出50個HCC患者預后相關的LncRNA,并森林圖形式展示(圖1B)。再將初篩變量進行LASSO回歸進一步篩選分析以減少數據的過度擬合,篩選出對預后更有價值的銅死亡相關的LncRNA,并繪制LASSO回歸(圖2C)及交叉驗證(圖2D)。然后進行多因素Cox回歸分析篩選出4個與HCC患者有預后價值的銅死亡相關LncRNA(MKLN1-AS、AC073254.1、WAC-AS1、KDM4A-AS1)。繪制4個與銅死亡相關的LncRNA相關性熱圖(圖2E) 用4個銅死亡相關 LncRNA構建HCC預后預測模型。風險評分方程:風險評分=(MKLN1-AS×1.287 682 473 548 62)+(AC073254.1×1.515 551 816 468 45)+(WAC-AS1×0.482 971 564 313 088)+(KDM4A-AS1×1.300 495 879 398 59)。

圖1 HCC中銅死亡相關LncRNA

圖2 對HCC預后更有價值的銅死亡相關LncRNA

2.2 預后模型的驗證 首先對模型中的50個LncRNA進行單因素回歸分析并繪制生存曲線,其次對高低風險兩組進行生存差異分析。同時為驗證我們構建的模型是否適用于不同臨床分組的患者,我們將患者分為早期(圖3A)和晚期(圖3B),說明我們構建的模型不但適用于早期的患者也適用于晚期的患者。通過Kaplan-Meier生存曲線(圖4A)、風險評分圖(圖4B～D)、生存狀態圖(圖5A～C)、風險熱圖(圖6A～C)結果顯示隨著風險評分的增加,患者的死亡率逐步上升,低風險組的總生存期明顯優于高風險組,高低風險兩組明顯存在生存差異(P<0.001),風險評分對HCC患者的預后有顯著影響。然后患者1、3、5年ROC曲線下面積分別為0.738、0.684、0.640(圖7A、B)。說明該模型具有較好的預測生存能力。為了更好探究預后模型的臨床價值,對風險評分與患者的臨床數據(年齡、性別、分級、分期)進行單因素和多因素獨立預后分析,單因素Cox回歸顯示年齡、性別、分級、分期及總風險評分是獨立預后指標,而多因素獨立預后分析顯示年齡、性別、分級、分期及風險評分以獨立于其他臨床因素,作為HCC患者的獨立預后因子。并且將風險評分納入臨床因素,繪制HCC患者的生存列線圖,綜合評分為527。1、3、5年的校準曲線分別是0.946、0.867、0.794,構建的模型的C-index是最大的(圖9A～C)。最后,使用預后模型LncRNA、銅死亡LncRNA及 銅死亡基因構建的PCA分析表明:參與模型構建的LncRNA可以區分高低風險組的患者(圖10A～D)。

圖3 不同分期HCC患者生存差異分析

圖4 高低風險組HCC患者生存曲線及風險評分分析

圖5 高低風險組HCC患者生存狀態分析

圖6 銅死亡分型患者風險熱圖

圖7 風險評分對HCC患者預后的影響

2.3 GO和KEGG富集分析 為了進一步分析與風險評分相關的生物學功能和途徑,對高低風險兩組間的DEGs進行GO和KEGG分析。GO富集分析結果顯示銅死亡相關基因參與BP中細胞化學應激和氧化應激反應,在CC方面主要參與煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶復合體和次級溶酶體的構成,在MF方面與NADPH氧化酶活性有關(圖8A、B)。KEGG分析顯示高表達基因主要涉及銅死亡、癌細胞碳代謝、5-羥色胺能突觸和VEGF信號通路等(圖9A、B)。

圖8 HCC患者銅死亡相關基因GO富集分析

圖9 HCC患者銅死亡相關基因KEGG分析

2.4 TMB差異分析和生存分析 為了進一步驗證高低風險組患者的生存是否具有差異,將患者分為高風險組和低風險組,對兩組進行生存差異分析,同時我們可以看到低風險組患者TMB更高(圖10A)。通過TMB生存分析比較高低突變負荷組之間患者的生存是否具有差異就可以得到這樣的生存曲線,將TMB與患者的風險進行聯合的生存分析,我們就可以得到聯合的生存曲線(圖10B、C),可以說明高低風險組患者的生存具有差異及TMB與患者的預后相關。

圖10 高低風險組HCC患者TMB差異和生存分析

2.5 篩選疾病的潛在藥物 為驗證高低風險兩組患者之間藥物敏感性是否具有差異及篩選治療HCC的潛在藥物,將患者分為高低風險兩組,通過pRRophetic R語言包對藥物敏感性進行循環,得到藥物的敏感性,結果表明高風險組患者對藥物更敏感,并從93個藥物中篩選出4個最敏感藥物作為潛在治療藥物的選擇(圖11A～D)。

圖11 高低風險組HCC患者藥物敏感性差異分析

3 討論

HCC是目前我國第4位常見惡性腫瘤及第2位腫瘤致死病因,嚴重威脅我國人民的生命和健康。原發性肝癌(PLC)主要包括HCC、肝內膽管癌(ICC)和混合型肝細胞癌-膽管癌(cHCC-CCA)3種不同病理學類型,三者在發病機制、生物學行為、病理組織學、治療方法以及預后等方面差異較大,其中HCC占75%～85%、ICC占10%～15%[4]。HCC是一個重大的全球健康挑戰,全球發病率穩步上升[5],最常見的原因是慢性感染乙型肝炎病毒,世界上超過一半的HCC是由慢性乙型肝炎引起的[6]。HBV與HCC形成的關系很復雜。到目前為止HBV導致HCC的發病機制包括:HBV DNA整合到宿主基因組[7]、HBV編碼蛋白對癌基因的反式激活、HBV誘導的慢性炎癥和肝細胞再生等[8]。而且,每年仍然有都有大量肝硬化患者感染肝炎病毒進展為HCC,這大大縮短了這些患者的壽命。雖然已經進行了許多關于HCC的研究,然而,HCC的早期診斷和及時治療仍然具有挑戰性[9]。所以,仍然需要探索肝癌早期篩查方法和治療的靶點,為HCC治療提供了新的治療方案。

銅死亡的提出,為我們探索銅死亡相關基因對HCC患者的治療增添一種新的治療手段方案。銅死亡是近期新發現的一種細胞死亡形式,其特征是細胞內游離銅積累,蛋白質脂化導致細胞毒性應激,從而誘導細胞死亡[10]。銅穩態的遺傳變異導致危及生命的疾病[11],并且銅離子載體[12]和銅螯合劑[13-15]都被認為是抗癌劑。此外,銅誘導的細胞死亡也可能被天然合成銅離子載體的微生物利用,并且表現出抗菌活性,是銅通過靶向脂?；h蛋白誘導細胞死亡[10]。研究表明,與健康人相比,癌癥患者的血清和腫瘤組織中的銅含量都明顯升高[16,17]。雖然銅平衡失調可能引發細胞毒性,但細胞內銅水平的改變可能影響癌癥的發展和惡化。我們的研究具有多重優勢。首先,這項研究是第一個在銅死亡相關基因的基礎上開發預后模型的研究,細胞死亡是腫瘤研究的一個密集領域,已被證明是癌癥起源和發展的基礎。銅死亡是一種新型的細胞死亡,與任何已知的細胞死亡機制不同,并且依賴于線粒體呼吸。這種不同尋常的機制可能會為癌癥的治療帶來新的解決方案。此外,與大多數主要關注總生存期的預后模型相比,我們的研究還考慮了無進展生存期。無進展生存期增益可能表明腫瘤負荷減輕和癥狀緩解,特別是對于晚期癌癥患者[18,19]。因此,本文針對銅死亡與HCC患者預后相關發病機制的研究進展,并確定更多的預后相關藥物治療。

本研究從TCGA數據庫中得到375個與銅死亡相關LncRNA,根據相關分析結果和獨立預后分析結果進一步篩選出了4個與HCC預后相關的銅死亡LncRNA。通過生存分析將所有患者分為高風險組和低風險組,采用Kaplan-Meier生存曲線分析兩組的生存情況,結果顯示患者的死亡率逐步上升,低風險組的總生存期明顯優于高風險組(P<0.001),風險評分對HCC患者的預后有顯著影響。本文通過ROC曲線分析結果顯示,預后風險模型判斷HCC患者1、3和5年ROC曲線下的面積分別為0.738、0.684、0.640;C-index曲線分析結果顯示,預后風險模型判斷HCC患者1、3和5年校準曲線分別為0.946、0.867、0.794。這表明本研究構建的銅死亡相關LncRNA預后風險模型可較準確地評估HCC患者的預后情況。本研究列線圖分析結果顯示,通過患者臨床特征和風險進行評分,可準確評估患者的總體生存率,這些差異基因在高低風險組的生存期,無進展生存期、免疫相關功能分析、TMB生存率及藥物敏感性是否是有差異的,對HCC患者的臨床管理有一定的參考價值。根據我們的進一步分析,我們發現這4個基因與HCC預后密切相關。關于這4個基因,我們發現它們或多或少與病毒感染、細胞增殖和腫瘤發生有關。MKLN1-AS極大地抑制了HCC細胞在體外和體內的轉移和生長[20]。它通過促進細胞增殖、遷移和侵襲,在體外抑制細胞凋亡,在HCC進展中發揮著致癌作用。此外,MKLN1-AS下調導致體內HCC腫瘤生長減少?？偟膩碚f,目前結果表明,MKLN1-AS作為癌基因在HCC中起著刺激作用[21]。WAC-AS1可以通過在缺氧條件下抑制糖酵解來抑制HCC細胞增殖[22]。它的下調抑制了HBV復制和自噬。它參與其他癌癥的發生,其中包括卵巢癌[23]。KDM4A-AS1通過miR-411-5p/KPNA2/AKT軸促進了肝細胞癌的生長和轉移[24]。AC073254.1目前尚未被研究發現,這將為我們進一步研究提供了新的治療靶點,需要進一步研究證明及其潛在的臨床價值,為HCC患者提供新的治療思路以及有待進一步需要更多研究人員對其進一步探索。這些基因對HBV感染和HCC形成的機制還需要進一步探索。

這項科學研究探索了可以預測和分析HCC的銅死亡生物標志物,有助于癌癥治療探索。首先,我們證明了該特征在癌細胞突變、潛在藥物治療的選擇和預測患者生存時間方面的潛在臨床價值。其次,該特征也可能在其他癌癥中具有良好的預測價值,需要進一步驗證。此外,這項研究有幾個局限性。該預后模型采用了TCGA數據庫的回顧性數據,需要進一步的前瞻性研究來證明其臨床價值。更多的基因表達及其與HCC患者臨床特征的關系有待研究。未來應該揭示銅死亡的潛在機制。通過TCGA數據庫挖掘到與HCC預后相關的4個銅死亡基因并構建了銅死亡相關LncRNA的預后風險模型,可對HCC患者的預后進行準確評估,該模型中的銅死亡基因為HCC靶向治療策略提供了新的治療靶點,這將為HCC患者的治療和預后風險評估提供新的治療思路。