和樞消積方通過調節AsTP3正反饋AKT/GSK-3β/mTOR信號通路對人肝癌細胞增殖及凋亡的影響*

李 玲 汪 靜 朱曉寧 張玉蓉 尹 玥

西南醫科大學附屬中醫醫院肝膽病科 (四川 瀘州,646000)

原發性肝癌(PLC)是世界上第六大最常見的癌癥,發病率位居位世界癌癥第五,死亡率第三(約8.3%)[1]。目前對于PLC的治療手段主要包括手術、介入、放化療及靶向藥物,其中手術為治療早期PLC最常用的方法,但術后5年復發率達70%,且本病起病隱匿,約60%以上的PLC患者發現時已處于中晚期,失去手術治療的機會[2,3],因此,迫切需要探索和發現新的PLC治療藥物。本課題組前期的臨床研究發現,和樞消積方能夠延緩PLC進程,提高PHC患者生存率。預實驗發現和樞消積方可以下調三氧化二砷反式激活蛋白3(AsTP3)表達,結合前期研究,過表達AsTP3可以上調肝癌細胞中蛋白激酶B(AKT)表達,下調AKT可以抑制糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)及雷帕霉素靶蛋白(mTOR)激活,抑制肝癌細胞增殖[4,5]。故推測和樞消積方抗癌作用與AsTP3及AKT/GSK-3β/mTOR信號通路相關,本研究將對其作用機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 和樞消積方(柴胡、黃芩、黃芪等)組方藥物經10倍于藥物總質量的蒸餾水加熱回流提取2次,每次1 h,合并提取的藥液,水浴濃縮,配制成相當于生藥濃度1 μg/ml的藥液,0.22 μm微孔濾器過濾除菌備用,用DMEM培養基稀釋為需要的濃度使用,所有藥物均來自于西南醫科大學附屬中醫醫院藥劑科。人肝癌細胞SMMC-7721細胞株為西南醫科大學藥學院腫瘤藥理實驗室贈予。DMEM培養基購自美國gibco公司,胎牛血清購自德國PAN公司,CCK8試劑盒購自日本同仁化學公司,Martige基質膠購自美國BD公司,Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒BCA蛋白濃度試劑盒購自中國碧云天公司,無氯仿RNA提取試劑盒購自中國百泰克生物技術有限公司,逆轉錄、qRT-PCR試劑盒購自日本TOYOBO公司,Bcl2、Bax、P-GSK-3β、GSK-3β抗體均購自美國CST公司,GAPDH、P-AKT、AKT、P-mTOR、AsTP3抗體均購自美國Santa Cruz公司,mTOR抗體購自美國Abcam公司、goat anti-rabbit IgG、Anti-Mouse IgG均購自美國Proteintech公司,引物由上海生工生物科技有限責任公司合成。

1.2 藥物濃度篩選及細胞增殖活力測定 將SMMC-7721細胞接種于96孔板,24 h后加入和樞消積方干預。按照CCK8試劑盒說明書以每孔10 μl CCK8試劑混合完全培養基加入96孔板中,37℃孵育1 h,酶標儀檢測吸光度(A值)。篩選出最佳藥物濃度(18 μg/ml),并根據最佳藥物濃度的1/2、1/4設置中、低劑量組。測試不同藥物濃度梯度24 h、48 h、72 h細胞活力。

1.3 平板克隆實驗 將SMMC-7721細胞按照3 000～5 000個/孔接種于6孔板中,24 h后予以不同濃度的藥物干預,每2～3 d更換1次培養基,當出現肉眼可見的細胞集落時終止克隆,PBS清洗1次,甲醇固定30 min,0.5%結晶紫溶液染色20 min,拍照記錄。

1.4 細胞劃痕實驗 將SMMC-7721細胞接種于12孔板中,待細胞長滿,不同濃度藥物干預24 h后,細胞內做直線劃痕,PBS清洗,更換無血清培養基,觀察24 h、48 h及72 h細胞愈合情況,并拍照記錄。

1.5 細胞侵襲實驗 按照Matrigel基質膠說明書,將基質膠加入Transwell小室中,放入孵箱中孵育1 h,待基質膠凝固后取出。將經不同濃度藥物干預后的SMMC-7721細胞按照1×105/ml密度,用無血清培養基制成細胞懸液加入上室中,下室加入600 μl含20%胎牛血清的完全培養基,放入孵箱,24 h后取出,熒光倒置顯微鏡拍照、記錄。

1.6 細胞遷移實驗 除未在上室中加入基質膠,余操作同細胞侵襲實驗。

1.7 流式細胞實驗 不同濃度藥物干預SMMC-7721細胞48 h,1 000×g離心5 min,PBS洗滌2次,使用Annexin V-FITC試劑盒,上流式細胞儀對細胞進行分析,每個樣品至少分析1×105個細胞,實驗重復3次。細胞凋亡率(%)=早期細胞凋亡率+晚期細胞凋亡率。

1.8 RT-PCR實驗 根據總RNA試劑盒操作說明書提取細胞RNA并將其逆轉錄為cDNA,按照qRT-PCR試劑盒說明書檢測基因AsTP3的表達,結果用2-ΔΔCt方法分析。引物序列見表1。

表1 引物序列表

1.9 Western-Blot實驗 不同藥物濃度干預SMMC-7721細胞48 h后提取總蛋白,按照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書進行蛋白濃度測定。99℃變性10 min后進行電泳、轉膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、顯影。

2 結果

2.1 和樞消積方對SMMC-7721細胞增殖的影響 隨著和樞消積方藥物濃度增大,SMMC-7721細胞活性逐漸降低,當藥物濃度大于30 μg/ml時,與對照組相比,差異有統計學意義(P<0.01);再次篩選,當藥物濃度為18 μg/ml時,與對照組相比,差異有統計學意義(P<0.05)(圖1)。故本實驗選用18 μg/ml作為后續實驗的藥物濃度。予以和樞消積方分別干預SMMC-7721細胞24、48、72 h,與對照組相比,和樞消積方可以顯著降低SMMC-7721細胞活力,其中24 h、48 h差異有統計學意義(P<0.05),72 h僅高劑量組差異有統計學意義,低劑量及中劑量組差異無統計學意義(P>0.05)。細胞克隆形成實驗顯示,隨著藥物濃度增加,細胞形成的集落顯著減少(圖3);同時,和樞消積方可上調Bax蛋白及下調Bcl2蛋白的表達(圖4)。

與對照組比較,*P<0.05,#P<0.01

與對照組比較,*P<0.05,#P<0.01

圖3 平板克隆形成實驗

與對照組比較,*P<0.05,#P<0.01。

2.2 和樞消積方對SMMC-7721細胞侵襲、遷移的影響 細胞劃痕實驗顯示,隨著藥物濃度增加,SMMC-7721細胞劃痕愈合能力逐漸降低,其中,高劑量組與對照組相比,具有顯著差異見圖5。Transwell實驗顯示,和樞消積方干預SMMC-7721細胞24 h后,與對照組相比均能抑制SMMC-7721細胞的侵襲及遷移能力,且呈劑量依賴性見圖6。

與對照組比較,*P<0.05。

圖6 和樞消積方對SMMC-7721細胞侵襲與遷移的影響(結晶紫染色,200×)

2.3 和樞消積方對SMMC-7721細胞凋亡的影響 流式細胞實驗檢測顯示,和樞消積方能明顯促進SMMC-7721細胞凋亡,其中中劑量組及高劑量組凋亡率差異有統計學意義(P<0.05),且呈濃度依賴性。見圖7。

與對照組比較,*P<0.05,#P<0.01。

2.4 和樞消積方對SMMC-7721細胞內ASTP3基因與蛋白的表達 結果顯示和樞消積方能抑制SMMC-7721細胞AsTP3表達。見圖8。

與對照組比較,*P<0.05,#P<0.01。

2.5 和樞消積方對SMMC-7721細胞AKT/GSK-3β/mTOR蛋白表達影響 不同濃度和樞消積方干預SMMC-7721細胞均能下調其P-AKT、P-GSK-3β、P-mTOR蛋白的表達。見圖9。

與對照組比較,*P<0.05,#P<0.01。

3 討論

肝細胞癌在傳統中醫藥學中名為“積聚”“癥瘕”,中醫認為其主要病機為“肝脾受損,氣機阻滯,瘀血內結”形成腹內結塊,導致積聚。和樞消積方是傳承全國名老中醫孫同郊教授經典思想,由汪靜教授總結得出,其中柴胡疏肝理氣,黃芩清泄邪熱,二者配伍,為小柴胡之意,調和少陽樞機,黃芪健脾益氣,顧護后天之本,諸藥配伍,使氣機調暢,肝胃調和,脾氣得健,濕熱清利,癥積自消?，F代研究發現和樞消積方中柴胡、黃芩發揮抗炎、抗氧化、調節免疫作用,能調控癌細胞凋亡、增殖,達到抗癌目的[6,7]。同時,課題組前期臨床研究發現和樞消積方在延長肝癌患者生存期方面有顯著作用。本研究通過CCK8法、平板克隆、劃痕、侵襲及遷移等實驗表明,和樞消積方可以明顯抑制肝癌細胞的增殖、遷移、侵襲能力,流式細胞實驗檢測顯示和樞消積方能夠促進SMMC-7721細胞凋亡。CCK8實驗中,不同藥物濃度干預SMMC-7721細胞72 h后,低劑量及中劑量組差異無統計學意義,考慮與細胞密度相關。Bax及Bcl2是細胞凋亡的主要調節因子,可以激活線粒體外膜透化,產生半胱天冬酶級聯反應,導致細胞不可逆的死亡[8]。和樞消積方能夠上調SMMC-7721細胞中Bax蛋白、下調Bcl2蛋白表達,提示和樞消積方促進SMMC-7721細胞凋亡可能與介導線粒體外膜透化相關,后期可開展進一步研究。

AsTP3是2004年應用抑制性消減雜交技術克隆并鑒定的新基因,是一種膠原特異性分子伴侶,它在GeneBank中的別名還有SERPINH1、HSP47等,該基因位于人類癌癥中最常擴增的區域之一—11q13.5號染色體上[9,10]。ENCORI(Encyclopedia of RNA Interactomes,RNA相互作用百科全書http://starbase.sysu.edu.cn/)數據庫表明與正常肝組織相比,AsTP3在肝癌組織中呈高表達水平,且AsTP3高表達組生存期較低表達組生存期短,差異有統計學意義(P=0.047)。本研究顯示,和樞消積方干預SMMC-7721細胞能顯著下調AsTP3 mRNA及蛋白水平,故和樞消積方可能通過抑制AsTP3表達促進SMMC-7721細胞凋亡、抑制細胞增殖。

AKT是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,它為磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)的主要下游效應物,磷酸化的AKT與腫瘤細胞增殖、凋亡、自噬等相關,其過表達是抗腫瘤藥物治療靶點之一[11];AKT作為一種致癌蛋白,能被Thr38或Ser473磷酸化激活,從而激活其下游分子,如磷酸化的GSK-3β及Bcl2相關啟動子,導致Bcl2在線粒體膜上解離,繼而抑制細胞凋亡[12,13]。有研究報道指出,AKT對GSK-3β活性的抑制可以調節腫瘤細胞凋亡[14];PI3K/Akt信號通路可以通過調控下游哺乳動物mTOR,促進癌細胞的增殖、遷移和侵襲[15,16],磷酸化的mTOR可以通過Ser473和SGK1(S422)直接激活AKT,調控細胞增殖及凋亡[17]。本實驗結果顯示和樞消積方可下調人SMMC-7721細胞中P-AKT、P-GSK-3β及P-mTOR蛋白水平,故認為和樞消積方促進SMMC-7721細胞凋亡機制與AKT/GSK-3β/mTOR信號通路相關。研究顯示AsTP3在口腔癌中呈高表達,加入PI3K抑制劑能下調AsTP3表達[18],且過表達AsTP3能上調P-Akt、沉默結果與之相反[5]。故認為和樞消積方抗癌及促進細胞凋亡的作用可能與通過靶向AsTP3抑制AKT/GSK-3β/mTOR信號通路有關,但其如何調控AsTP3及具體作用位點尚未明確,不排除還存在其他信號通路協同抗癌。

綜上,本研究為和樞消積方的臨床運用提供了科學的理論基礎,為中醫治療SMMC-7721提供了新思路,但本研究僅從細胞分子層面證明,尚缺乏動物研究論證,仍需進一步探討和樞消積方如何下調AsTP3表達抑制AKT/GSK-3β/mTOR信號通路。已有研究表明,AsTP3與鈣網蛋白及折疊蛋白相結合,可以增加癌細胞的化療藥物抗耐藥性[19],這為我們后續研究提供了新思路。