基于生物信息學與分子對接技術探討苦參通過調節免疫相關基因治療潰瘍性結腸炎的分子機制

趙香妍,羅衛華,姚海濤,閆曉媛,王雅麗,劉宇博

(北京市和平里醫院藥劑科,北京 100013)

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC)是炎癥性腸病中的一種慢性長期疾病,發病機制尚不明確,主要癥狀為腹痛、腹瀉甚至血便等,長期的慢性炎癥狀態顯著增加了患者結直腸癌的發病風險[1]。再過去的數十年中,雖然UC的死亡率較低,但在歐美發達國家的發病率和患病率仍然很高,在發展中國家也呈迅速升高趨勢。目前研究發現,UC與腸道黏膜屏障的損傷有關,腸道菌群紊亂、免疫功能失調及炎癥細胞浸潤腸道黏膜層可能是引起嚴重炎癥反應的原因[2]。雖然如5-氨基水楊酸、皮質類固醇、免疫抑制劑和生物制劑等被廣泛應用于臨床治療UC,但這些藥物有限的治療效果、較高的不良反應發生率以及較高的治療費用等問題仍亟待解決[3-4]。

基于傳統中醫藥理論而應用的天然藥物,因其多成分、多靶點以及成本低廉等優勢,是目前治療UC的潛在藥物。傳統中醫理論認為,UC證屬濕熱蘊腸證[5]。而中藥苦參作為經典清熱燥濕的藥物,具有抗菌[6]、抗炎[7]和免疫調節[8]等藥理作用。目前已有報道,苦參對于UC具有潛在的藥物治療效果[9]。但其作用機制尚待闡明。本研究通過生物信息學和分子對接的方法,全面系統地探討了苦參通過調節免疫相關基因(IRGs)治療UC的作用機制,為后續UC治療藥物的開發提供更多理論支撐,進一步開拓了傳統中藥的新視野。

1 資料與方法

1.1 苦參的化學成分及作用靶點篩選

采用中藥系統藥理學數據庫和分析平臺(https://www.tcmsp-e.com)[10]檢索苦參。根據口服利用度(OB)≥50%、類藥性(DL)≥0.18和腸上皮通透性(Caco-2)>-0.4為閾值,初步篩選苦參中活性化合物及相關作用靶點。此外,對已發表文獻進行檢索,對數據庫未收錄的活性成分進行補充合并。使用Cytoscape 3.9.1[11]軟件將苦參-成分-靶點網絡圖可視化。

1.2 UC相關差異基因分析

使用“ulcerative colitis”為檢索關鍵詞,在基因表達綜合數據庫(GEO)[12]中下載UC相關臨床試驗數據集(GSE206285)[13],其中18例健康成年人作為對照組,18例診斷UC的成年患者、使用安慰劑治療作為UC組。利用R語言對芯片原始數據進行二次分析,利用RMA算法進行背景校正和矩陣數據歸一化處理。并以P<0.05,|logFC|≥1為條件對差異表達基因(DEGs)進行篩選,最終確定UC的DEGs。

1.3 苦參調節IRGs治療UC核心靶點網絡構建及功能模塊識別

在免疫基因集數據庫(https://www.immport.org)[14]中獲取IRGs,并與苦參作用靶點和UC相關DEGs取交集,繪制交集靶點韋恩圖。將交集靶點數據導入至STRING數據平臺(https://string-db.org)[15]進行分析處理,隱藏無聯系節點,得到蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網絡圖,將數據導入Cytoscape軟件對PPI網絡進行可視化。分別使用軟件內置插件MCODE和cytohubba,對上述獲得的PPI網絡進行功能模塊識別。通過MCODE插件識別出核心靶點聚類模塊。進一步使用cytohubba插件計算拓撲參數,包括MCC、EPC、Betweenness和Closeness進行篩選,確定交集的hub基因。合并結果后,選擇P<0.05,|logFC|≥1的靶點認定為苦參通過調節IRGs治療UC的核心靶點。

1.4 京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析和基因本體(GO)功能富集分析

通過Metascape數據庫(http://metascape.org)[16]對苦參和UC共同作用得到的交集靶點進行KEGG通路富集分析和GO功能富集分析。以P<0.05為閾值,將其按Pvalue升序進行排序。分別使用R語言繪制通路富集氣泡圖和功能富集柱狀圖進行可視化。

1.5 苦參成分與核心靶點分子對接驗證

從PubChem數據庫[17]獲取苦參活性成分的化學結構,并從PDB數據庫下載核心靶點蛋白結構,利用CB-dock2(https://cadd.labshare.cn/cb-dock2)工具[18],計算分子中心和大小,根據查詢的配體匹配對接盒,并計算結合能評分,其中結合能表示為負數,數值越小表示結合能力越強,結合越穩定。以此對苦參成分與核心靶點的結合能力進行分子對接驗證。

2 結果

2.1 苦參活性成分及作用靶點獲取

獲取苦參所包含化學成分113個,通過OB≥50%、DL≥0.18和Caco-2>-0.4為閾值篩選后最終獲得苦參相關活性成分槲皮素、木犀草素、刺芒柄花素、8-異戊烯基-山柰酚、菜豆素和懷特酮等23個。獲取苦參活性成分相關靶點合計201個?？鄥?成分-靶點網絡圖見圖1。

2.2 苦參活性成分及作用靶點分析

通過GEO芯片分析,UC患者組與健康組對比,發現13 843個DEGs,通過設置|logFC|≥1的閾值進行篩選后,確定其中上調DEGs 1 199個,下調DEGs 905個,相關火山圖見圖2。

圖2 UC差異表達基因火山圖

2.3 苦參調節IRGs分析

通過數據庫共獲取IRGs靶點1 793個,分別與苦參相關靶點、UC疾病上調和下調DEGs取交集后繪制韋恩圖,確定苦參通過調節IRGs治療UC的潛在靶點共計68個(調節上調基因46個,調節下調基因22個),見圖3。

圖3 UC苦參-UC差異表達基因-免疫相關靶點韋恩圖

2.4 PPI網絡構建及核心靶點預測

通過STRING數據庫分析潛在靶點,獲得擴展的PPI網絡數據,通過Cytoscape軟件內置插件進行MCODE聚類分析,獲得3種模塊,數據可視化見圖4。進一步應用Cytohubba插件分別篩選MCC、EPC、Betweenness和Closeness前20位的靶點基因,通過繪制韋恩圖共確定12個hub基因(見圖5),進一步篩選出P<0.05,|logFC|≥1的靶點認定基質金屬蛋白酶(MMP)9、白細胞介素(IL)1β、CXC趨化因子配體8(CXCL8)、過氧化物酶體增生激活受體γ(PPARG)、前列腺素內過氧化物合成酶2(PTGS2)和IL-6為苦參通過調節IRGs治療UC的核心靶點。

圖4 MCODE模塊聚類圖

圖5 hub基因韋恩圖

2.5 KEGG和GO富集分析

KEGG富集分析結果見圖6?？鄥⑼ㄟ^調節IRGs治療UC的相關靶點主要富集于癌癥相關通路、脂質與動脈粥樣硬化通路、晚期糖基化終末產物(AGE)-AGE受體(RAGE)信號通路、IL-17信號通路以及腫瘤壞死因子信號通路。GO富集分析結果見圖7。其中,苦參涉及UC相關靶點的生物過程主要涉及對激素的反應、細胞對脂質的反應、炎癥反應以及對細胞或生物體運動的正向調節等;細胞組成主要定位于細胞膜筏、細胞膜微結構域和受體復合物等;主要影響的分子功能包括信號受體調節和激活活性、受體的配體活性和細胞因子受體結合等。

圖6 KEGG通路富集分析

圖7 GO功能富集分析

2.6 分子對接

根據苦參-成分-靶點分析的結果,獲取Degree值居前10位的化合物結構,分別為槲皮素、木犀草素、刺芒柄花素、8-異戊烯基-山柰酚、菜豆素、懷特酮、大豆抗毒素、高麗槐素、苦參素和苦參堿,分別將之與6個核心靶點進行分子對接。全部分子對接結合能評分圖見圖8(A)。其中結合能評分較低的受體配體:MMP9與懷特酮,結合能為-42.7 kJ/mol;PPARG與菜豆素,結合能為-41.9 kJ/mol;MMP9與木犀草素、PTGS2與木犀草素、PTGS2與菜豆素、PTGS2與大豆抗毒素的結合能均為-40.6 kJ/mol。圖8(B)—圖8(O)為結合能較低的14組分子對接結果。

A.分子對接結合能評分;B.MMP9與懷特酮;C.PPARG與菜豆素;D.MMP9與木犀草素;E.PTGS2與木犀草素;F.PTGS2與菜豆素;G.PTGS2與大豆抗毒素;H.MMP9與槲皮素;I.PPARG與大豆抗毒素;J.PTGS2與槲皮素;K.PTGS2與懷特酮;L.PPARG與高麗槐素;M.MMP9與刺芒柄花素;N.PTGS2與8-異戊烯基-山柰酚;O.PTGS2與高麗槐素。

3 討論

UC作為慢性自身免疫性疾病,在世界范圍內的發病率逐年升高[19]。令人困擾的是,截至目前UC的病因仍不明確。UC的發病可能涉及免疫系統、遺傳學、腸道菌群失調以及環境因素等,而該病在發達國家的發病率更高。UC嚴重程度隨著疾病的進展而逐漸加劇。隨著UC的發展,患者每日排便次數會由<6次發展至>10次,炎癥指標逐漸出現異常并可能出現發熱、寒戰和體重變化等癥狀[19]。除腹瀉和便血等腸道癥狀外,UC還會引發多種并發癥,累及眼睛、骨關節、皮膚和肝臟等,極大地影響了患者的日常生活質量[20]。嚴重的UC患者可能出現結腸穿孔或發展為結腸癌,繼而發生死亡的嚴重不良事件[21]。腸屏障損傷是UC的顯著病理特征,腸屏障能夠被各種炎癥因子或腸固有層中的細胞破壞,繼而發生炎癥級聯反應,導致UC進一步發展。因此,調節炎癥因子或炎癥細胞是臨床治療或緩解UC的可行策略。修復腸屏障損傷、維持腸道穩態、調控中性粒細胞及腸道固有層免疫應答、調節腸道菌群均與免疫相關蛋白水平的變化關聯密切。

苦參作為傳統天然藥物,在中醫藥理論的指導下已沿用數千年,《神農本草經》《本草綱目》中均有記載?？鄥⑺钚猿煞址N類繁多,包含黃酮類、生物堿類、苯丙素類和萜類等多種化學成分,因此,苦參也具有多種藥理作用。多項研究結果表明,苦參具有明確的抗炎和免疫調節作用。張麗華等[22]發現,苦參能夠降低豚鼠血清腫瘤壞死因子α和IL-6水平,提高IL-10水平?？鄥⑦€具有雙向免疫調節作用,桑秀秀等[23]發現,氧化苦參堿能夠顯著提高血清IL-10和IL-27水平,還能夠降低CD4+IL-17A表達,減輕炎癥細胞浸潤程度。杜銳等[24]發現,苦參堿能夠顯著提高化療患者血清CD3+、CD4+和CD8+水平,并降低IL-6水平。以上均表明苦參具有潛在的免疫調節功能,是作為調節機體免疫功能的候選藥物。

本研究基于GEO數據庫UC基因表達芯片數據,應用生物信息學方法獲取正常人與UC患者的結腸組織的DEGs,更加客觀真實地發現了UC對于正常人體的病理改變過程中分子水平的變化。對于UC疾病的分子機制研究,GEO數據的挖掘是一種更加快速且科學的研究方法。本研究中,MMP9、IL-1β、CXCL8、PPARG、PTGS2和IL-6被認定為苦參通過調節IRGs治療UC的核心靶點,且富集于IL-17信號通路上。同時,本研究還發現這些靶點還能夠富集于reactome數據庫[25]中同屬于免疫相關通路的IL-4[26]、IL-13[27]以及IL-10信號通路[28]。IL-17細胞因子家族是由IL-17 A—F組成的細胞因子亞群,能夠促進炎癥免疫反應,在急性和慢性炎癥反應中均起關鍵作用[29]。在IL-17家族細胞因子中,由IL-17A和IL-17E/IL-25激活的信號通路最具特征性。IL-17A與其受體復合物的結合導致核因子激活劑(ACT1)銜接蛋白的募集,該蛋白通過其共有的SEFIR結構域與IL-17受體相互作用。ACT1與IL-17受體復合物的相互作用導致腫瘤壞死因子受體相關因子(TRAF)-6和TRAF-3的募集以及一系列細胞內激酶的激活,包括轉化生長因子激酶1、kappa B抑制因子激酶、胞外信號調節激酶(ERK)、糖原合成酶激酶-3β和p38絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)等。這些激酶共同促進核因子κB(NF-κB)、激活蛋白-1和CCAAT-增強子結合蛋白依賴的促炎細胞因子、趨化因子和抗微生物肽的表達。與IL-17A相似,IL-17E信號傳導需要ACT1,激活p38 MAPK、ERK和NF-κB,并刺激促炎趨化因子和細胞因子如IL-6和IL-8的表達。然而,與IL-17A信號傳導相反,IL-17E誘導的信號傳導主要通過驅動IL-4、IL-5和IL-13的表達以及嗜酸性粒細胞的募集來促進Th2和Th9型免疫應答。此外,IL-17E可通過抑制Th1和Th17細胞發育所需細胞因子的分泌,發揮抗炎細胞因子的作用。因此,筆者推測苦參及其活性成分能夠通過抗炎及調節機體免疫功能,來發揮治療UC的作用。

在初步明確了苦參的作用機制后,本研究更進一步對其活性成分進行了分子對接驗證。分子對接是依據配體與受體作用的鑰匙與鎖的原理,模擬配體小分子與受體生物大分子相互作用的一種技術方法[30]。分子對接是基于結構的藥物設計中最常用的方法之一,能夠預測小分子配體與合適的靶標結合位點的結合構象。結合行為的表征在藥物的合理設計以及闡明基本的生化過程中起著重要的作用[31]。本研究使用分子對接工具,將篩選出的核心靶點與苦參中的活性物質進行空間匹配和能量打分,根據能量排序最終得到分子間的最優結構和結合模式。MMP9與懷特酮、PPARG與菜豆素、MMP9與木犀草素、PTGS2與木犀草素、PTGS2與菜豆素、PTGS2與大豆抗毒素的對接結果表明了它們能夠結合成為更為穩定的空間結構。因此,本研究推測苦參中的活性成分懷特酮、菜豆素、木犀草素以及大豆抗毒素是苦參治療UC的潛在的藥用活性物質。

綜上所述,本研究結果證明了苦參能夠調控多種UC相關分子靶點,進而影響多種信號通路及生物學過程,發現苦參通過調節IRGs治療UC具有一定的科學依據及可行性。本研究為目前臨床治療UC提供了一種新的策略,但本研究仍存在著局限性。(1)UC的疾病過程漫長,臨床表現復雜,僅通過GEO數據庫獲取的信息無法體現UC的全貌,開展的分析也因此較為片面。(2)本研究為基于生物信息學的數據挖掘與分析,對于所得結果尚需要進一步的實際臨床研究或基礎實驗驗證。