羊鏈球菌CVCC55001、CVCC55002株對昆明小鼠的致病性研究

張一幟,任小俠,辛凌翔,朱良全,孫 淼,李 建,張 媛,馮 妍,王秀麗,劉元杰,劉 燕

(中國獸醫藥品監察所(農業農村部獸藥評審中心),北京 100081)

羊鏈球菌病是由溶血性鏈球菌所引起的一種急性熱性傳染病,屬鏈球菌馬鏈球菌獸疫亞種(Streptococcusequisubspecieszooepidemicus)[1]。該病原為革蘭氏陽性球菌,多呈鏈條狀。羊通常于氣候寒冷時出現發病,幼齡羊及母羊的發病率較高。發病多為急性型,發病羊出現體溫升高(大于41 ℃)、精神萎靡、行動不便、眼結膜充血、咽喉腫脹,剖檢可見膽囊腫大以及纖維素性肺炎[2]。

我國目前發現的羊鏈球菌由國家獸醫微生物菌(毒)種保藏中心保藏并編號為CVCC55001、CVCC55002。此兩種菌為羊鏈球菌滅活疫苗效力檢驗用的強毒菌種,也是羊鏈球菌病疫苗的生產用菌種,最早由青海牧醫所于青海省貴南縣分離所得。CVCC55001、CVCC55002血清型均為蘭氏C型,能水解淀粉,不發酵水楊苷[3]。紅霉素、四環素、青霉素、金霉素等抗生素類以及磺胺類藥物都能夠對該菌起到良好的殺傷作用[4]。目前對于該菌的感染及致病機理方面的研究較為欠缺,建立一種穩定可靠的感染動物模型對于羊鏈球菌病的研究至關重要。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 羊鏈球菌CVCC55001、CVCC55002 株,2016年3月22日,由國家獸醫微生物菌(毒)種保藏中心提供。鏈球菌馬獸疫亞種CVCC55138,2014年2月25日,由國家獸醫微生物菌(毒)種保藏中心提供。

1.1.2 培養基及試劑 馬丁瓊脂培養基、胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)培養基、緩沖肉湯培養基、生理鹽水、均購自北京中海生物技術有限公司;莢膜染色試劑盒購自Solarbio公司、ATB 鏈球菌快速鑒定試劑盒、哥倫比亞血瓊脂平板購自Bio Mérieux公司;新生牛血清購自四季青生物;革蘭氏染色液購自海博生物;莢膜染色液購自源葉生物;鏈球菌分型試劑盒購自Oxoid公司。

1.1.3 實驗動物 18～22 g SPF級昆明小鼠,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌液培養 開啟凍干羊鏈球菌CVCC55001、CVCC55002株各一支,用0.5 mL馬丁肉湯溶解后,分別接種含10%綿羊脫纖血馬丁瓊脂平板(以下簡稱血平板)2付,37 ℃培養18 h。之后挑取該平板上的典型菌落,分別接種含10%綿羊脫纖血瓊脂斜面2支,37 ℃培養24 h,血斜培養物呈灰色、半透明、濕潤、粘稠。將血斜培養物劃取少量接種含10%新生牛血清的馬丁肉湯,37 ℃靜置培養24 h后,肉湯培養物一致混濁,無菌膜。

1.2.3 菌液凍存與定量 將培養好的羊鏈球菌緩沖肉湯培養物加入滅菌甘油(終濃度為20%),3 mL/支分裝于15 mL離心管中,置于冰箱(-70 ℃以下)凍存。凍存3 d后進行活菌計數,分別取出CVCC55001、CVCC55002株各一支,使用緩沖肉湯進行105倍稀釋后,再進行3倍稀釋,之后吸取0.1 mL加至含10%新生牛血清的TSA培養基中,37 ℃培養24 h計數。之后分別于凍存后7 d、21 d、49 d、63 d進行活菌計數,評價羊鏈球菌的凍存保存期。

1.2.4 小鼠測毒 購買18～22 g SPF級昆明小鼠于ABSL-2級負壓動物舍獨立通氣籠具內飼養,按照活菌計數預數結果分別將CVCC55001、CVCC55002菌液稀釋至5、15、25、35、45、55 CFU/mL。0.2 mL/只腹腔注射昆明小鼠,每組10只。每日觀察統計小鼠狀態,無菌狀態下剖檢死亡小鼠,采集心血,收集心、肝、脾、肺、淋巴組織固定后進行H&E染色,對比各組小鼠病變情況。

1.2.5 細菌形態和生化鑒定 無菌環境采集死亡小鼠心血,劃線接種哥倫比亞血瓊脂平板,37 ℃培養24 h,挑取典型單菌落進行莢膜染色,使用ATB鏈球菌快速鑒定試劑盒參照使用說明書對于心血培養菌進行生化特性鑒定。

1.2.6 PCR鑒定 根據GenBank中馬鏈球菌獸疫亞種16S rDNA基因序列(定位號:EU784820.1)設計引物(上游引物:TATCTGTGAGTCGCGAACGG;下游引物:GCCGTCCCTTTCTGGTTAGT),目的片段大小為424 bp,引物由華大基因合成。反應體系為25 μL(詳見表1)。反應條件為預變性94 ℃ 5 min;變性94 ℃ 30 s,退火55 ℃ 30 s,延伸72 ℃ 30 s,循環35次;終延伸72 ℃ 10 min。結束后將擴增產物進行核酸電泳檢測。

表1 PCR反應體系Tab 1 PCR reaction system

1.2.7 ANI檢測 將菌種液體培養物加入甘油(20%終體積),委托南京派森諾基因科技有限公司進行ANI檢測分析,選用參考基因組為Streptococcusequisubsp.zooepidemicus(NCBI編號:ASM1568945v1),使用OAT軟件分析結果。

2 結果與分析

2.1 羊鏈球菌CVCC55001、CVCC55002的凍存保存期評價 由于活菌計數需要培養一定時間,其結果的延后性導致無法實時明確攻毒菌液的活菌含量。目前一般采用培養及保存條件相同的菌液,以預實驗活菌計數結果確定正式實驗的菌液濃度,本研究通過對羊鏈球菌CVCC55001、CVCC55002的凍存菌液的活菌數進行評測,確定其活菌數相對穩定的期限。將新鮮羊鏈球菌CVCC55001、CVCC 55002緩沖肉湯培養物加入滅菌甘油至甘油終濃度為20%(W/V),使用15 mL離心管進行分裝,3 mL/支,標記后放入-70 ℃以下冰柜進行凍存。分別于凍存后3 d、7 d、21 d、35 d、49 d、63 d、77 d各取出一支羊鏈球菌CVCC55001、CVCC 55002凍存菌液,進行活菌計數,結果如表2所示,說明本方法保存的菌液在35 d內細菌濃度相對穩定,以預數濃度作為實際濃度進行使用偏差小于10%,保存超過5周后菌數下降較快,保存77 d后分別下降了45.9%、51.2%。

表2 CVCC55001、CVCC55002菌液凍存保存期評價結果Tab 2 Evaluation results of freezing storage period of strain CVCC55001 and CVCC55002 bacterial liquid

2.2 羊鏈球菌CVCC55001、CVCC55002平均核苷酸一致性分析檢測(ANI) 之前的研究已經利用經典生化反應鑒定及16S rDNA測序鑒定CVCC55001、CVCC55002均屬鏈球菌馬鏈球菌獸疫亞種(Streptococcusequisubspecieszooepidemicus)[1]。本研究使用平均核苷酸一致性分析(ANI)對于CVCC55001、CVCC55002與鏈球菌馬鏈球菌獸疫亞種進行驗證性比對。ANI是基于物種全基因組序列,通過分析比較同源基因序列來判定物種間的遺傳關聯性的重要參數,可以直觀表示物種間的親緣關系遠近。ANI與16S rDNA相比,其親緣關系計算中并不受單個基因或者少數基因變化的遺傳速率和基因水平轉移影響。屬間、種間及亞種間兩兩菌株間ANI與其分類地位相關,具有明顯的屬種特異性,一般屬間的ANI 值分布于50%～65%,種間的ANI 值分布65%～90%,亞種間的ANI 值分布于90%～96%。將CVCC55001與CVCC55002菌種制備為甘油菌后送至公司測序,使用參考基因組Streptococcusequisubsp.zooepidemicus進行比對,使用直系同源修正得到OrthoANI值[5](表3),結果顯示,CVCC55001、CVCC55002與鏈球菌馬鏈球菌獸疫亞種應屬同一亞種,且CVCC55001與CVCC55002之間相似度非常高。

表3 CVCC55001、CVCC55002平均核苷酸一致性分析結果Tab 3 Average Nucleotide Identity Test Results of Strain CVCC55001 and CVCC55002

2.3 兩株羊鏈球菌對昆明小鼠毒力測定 將稀釋好的CVCC55001、CVCC55002腹腔注射18～22 g昆明小鼠,記錄小鼠死亡情況(表4)。結果顯示CVCC55001對于昆明小鼠的最小致死劑量為9 CFU;CVCC55002對于昆明小鼠的最小致死劑量為11 CFU。

表4 CVCC55001、CVCC55002菌種毒力測定結果Tab 4 Toxicity test results of strain CVCC55001 and CVCC55002

2.4 羊鏈球菌對昆明小鼠攻毒后臨床及剖檢癥狀攻毒后每日觀察小鼠臨床表現,攻毒12 h后部分小鼠開始出現萎靡厭食、呼吸急促的狀況,部分組(5 CFU～11 CFU組)小鼠開始出現死亡,1 CFU組小鼠基本正常。攻毒24 h至72 h為死亡高峰期,大部分小鼠在出現顫抖、站立困難、背毛凌亂等情況后的12 h內死亡,至攻毒96 h后不再出現新增死亡小鼠?？瞻讓φ战M小鼠均表現正常。

對于兩株菌攻毒死亡小鼠進行剖檢時發現,CVCC55001株及CVCC55002株攻毒死亡小鼠均出現胸腔積液,肝臟出血,邊緣泛白,腸道液化性壞死,脾臟腫大、出血(圖1、圖2)。

圖1 CVCC55001株(左上)、CVCC55002株(左下)攻毒后小鼠剖檢情況Fig 1 Autopsy of mice after strain CVCC55001(top left)and CVCC55002(bottom left)challenge

圖2 CVCC55001株、CVCC55002株攻毒后小鼠脾臟、肺、肝臟病變情況Fig 2 Pathological changes of spleen, lung and liver in mice after strain CVCC55001 and CVCC55002 challenge

2.5 羊鏈球菌攻毒昆明小鼠的病理變化 對于小鼠進行剖檢,分別取下攻毒組和空白組小鼠的心、肝、脾、肺、腸道組織放入4%多聚甲醛溶液中固定,之后進行H&E染色,結果如圖3所示,羊鏈球菌感染后腸道黏膜層廣泛自溶,呈無結構的嗜酸性物,腸絨毛及腸腺結構消失,而對照組黏膜層上皮完整,腸絨毛豐富均勻,固有層腸腺排列緊密,肌層肌細胞形態正常;羊鏈球菌感染小鼠肺臟肺泡壁輕度增厚,肺泡間距增寬,并伴有少量的粒細胞浸潤,多見血管淤血,部分支氣管腔內及周圍肺泡腔內見少量紅細胞;對照組小鼠肝細胞排列規則、整齊,肝竇無明顯擴張或擠壓,未見明顯壞死、增生及炎性改變,羊鏈球菌感染組與對照相比,肝竇輕度淤血、擴張,肝細胞出現大量壞死,胞核固縮深染、碎裂或溶解,多見血管結構消失,與周圍組織融合呈無結構的嗜酸性物質;對照組視野內心肌纖維著色均勻,細胞分界清楚,走形一致,間質未見異常,羊鏈球菌感染組間質輕度水腫,結締組織排列疏松,同時伴有少量的淋巴細胞浸潤,心肌細胞間距增寬;對照組脾臟視野內白髓與紅髓分布分界清晰,細胞數量豐富,排列緊密。羊鏈球菌感染組小鼠脾臟組織廣泛壞死、出血,組織原有結構消失,廣泛可見壞死的細胞碎片、大量的紅細胞,可見大量的粒細胞呈彌散性浸潤。

圖3 羊鏈球菌CVCC55001株、CVCC55002株攻毒昆明小鼠的病理變化(200×)Fig 3 Pathological changes in KM mice after strain CVCC55001 and CVCC55002 challenge(200×)

2.6 羊鏈球菌形態和生化特性鑒定 將攻毒小鼠進行剖檢,分別取感染小鼠心血進行劃線,37 ℃培養24 h后,挑取典型單菌落進行莢膜染色,結果中圍繞著色菌體(藍紫色)外的一層透明物質即為莢膜(圖4紅色箭頭),結果顯示CVCC55001和CVCC55002株羊鏈球菌均具有莢膜。將羊鏈球菌哥倫比亞血瓊脂平板培養物收集后,按照ATB鏈球菌快速鑒定試劑盒說明書制備菌懸液后進行生化特性鑒定,CVCC55001和CVCC55002株羊鏈球菌結果均符合馬鏈球菌獸疫亞種生化特性(表5)。

圖4 羊鏈球菌CVCC55001株、CVCC55002株攻毒昆明小鼠分離菌莢膜染色(100×)Fig 4 Capsule staining of bacteria isolated from infected mice after strain CVCC55001 and CVCC55002 challenge(100×)

表5 CVCC55001、CVCC55002菌種生化特性檢定結果Tab 5 Biochemical characteristics results of strain CVCC55001 and CVCC55002

2.7 羊鏈球菌PCR鑒定 選取攻毒小鼠分離菌平板上的典型單菌落加入TSB(含5%血清)中,靜置過夜培養后進行PCR鑒定,同時分別取CVCC55001標準菌、大腸桿菌BL21的新鮮菌液作為陽性對照和陰性對照,結果顯示擴增到長度約424 bp 的目的條帶(圖5),與陽性對照片段大小一致。

1: BM2000分子量標準;2: 鏈球菌馬獸疫亞種CVCC55138;3: 大腸桿菌BL21株;4: CVCC55001株攻毒小鼠分離菌; 5: CVCC55002株攻毒小鼠分離菌;6:空白對照1: BM2000 Marker;2: CVCC55001 Standard Strain;3: E. coli BL21 Strain;4: CVCC55001 strain isolated from mice;5: CVCC55002 strain isolated from mice;6:Blank control圖5 羊鏈球菌CVCC55001株、CVCC55002株攻毒昆明小鼠分離菌PCR鑒定結果Fig 5 PCR identification of bacteria isolated from infectedmice after strain CVCC55001 and CVCC55002 challenge

3 討 論

羊鏈球菌CVCC55001和CVCC55002株經鑒定為蘭氏C群,屬于鏈球菌馬鏈球菌獸疫亞種[1]。它作為機會病原體在一定條件下引起馬呼吸道及生殖道感染。人感染該病原體會導致嚴重或潛在的致命疾病,包括菌血癥、心內膜炎、關節炎、腎小球腎炎、壞死性肌炎和腦膜炎[6]。該菌宿主廣泛,經報道證實能夠感染人、馬、牛、羊、豬、驢、狐貍、兔、豚鼠、狗、貓和猴等并引起嚴重病癥[7-8]。

本研究以昆明小鼠為實驗動物模型,測定CVCC55001和CVCC55002對于昆明小鼠的最小致死量,并將死亡小鼠的臨床癥狀、剖檢癥狀及病理變化進行全面梳理。值得注意的是從不同宿主體內分離得到的菌種對于不同物種的感染能力也存在差異,Hau等使用兩株鏈球菌馬鏈球菌獸疫亞種感染5月齡豬,結果證實由豬體內分離強毒株能夠引起豬嚴重的敗血癥,而從豚鼠中分離得到的鏈球菌馬鏈球菌獸疫亞種對于豬毒性顯著降低,只引起部分系統性癥狀,未導致豬死亡[9]。Bin T等使用豬源馬獸疫亞種鏈球菌CVCC55138攻毒BALB/c小鼠,測得BALB/c小鼠對該菌的致死劑量為2×105CFU[10]。本研究中小鼠對于羊源CVCC55001和CVCC55002的致死劑量分別為9 CFU和11 CFU,可見不同小鼠品系、不同菌株以及菌株來源等對于小鼠模型及毒力均有一定程度的影響。

關于馬鏈球菌獸疫亞種表面蛋白的研究顯示多種細菌表面蛋白在宿主和病原體的互作中發揮著重要作用,這些蛋白作為豬源血清學驗證的生物標記抑或亞單位疫苗組分[11]。其中C5a肽酶作為鏈球菌入侵宿主上皮細胞的重要分子,經驗證能夠有效保護小鼠免于馬鏈球菌獸疫亞種致死劑量攻毒導致的死亡[12]。馬鏈球菌獸疫亞種表面典型LPxTG基序細胞膜錨定結構域MAP具備良好的免疫原性,是亞單位疫苗的潛力候選抗原。此外,Wei等證實馬鏈球菌獸疫亞種的莢膜多糖對于其致病性至關重要,而缺失株在降低了對于小鼠的毒力之外提供了對于馬鏈球菌獸疫亞種強毒株的有效保護作用,為該菌減毒活疫苗的研制提供了思路和方向[13]。

目前我國市場可售的羊鏈球菌疫苗包括羊敗血性鏈球菌滅活疫苗和羊敗血性鏈球菌活疫苗兩種。這兩種疫苗的檢驗強毒菌種為CVCC55001和CVCC55002,根據質量標準規定,羊敗血性鏈球菌滅活疫苗和羊敗血性鏈球菌活疫苗在進行效力檢驗時,需要使用本動物進行強毒攻毒[14]。目前該產品在實際檢驗中存在新鮮菌液菌數差異大、試驗重復性差和生物安全風險高等問題,且使用本動物進行檢驗存在健康狀態不可控、篩選困難、操作繁瑣、人力物力耗費高等問題。因此,針對上述疫苗產品開展效力檢驗替代方法研究尤為必要,本研究建立了羊鏈球菌檢驗用強毒株CVCC55001、CVCC55002株的昆明小鼠攻毒感染模型,確定了最小致死劑量,并對其感染和致病性研究展開初步探索,為該菌種毒力、致病機制及疫苗研究評價提供了平臺支撐。