氣腫疽梭菌C54-1株的制備與檢定

任小俠,馮 妍,馬 欣,劉 燕,王團結,杜吉革,潘晨帆,劉世博,張一幟

(中國獸醫藥品監察所(農業農村部獸藥評審中心),北京 100081)

氣腫疽梭菌病,俗稱“黑腿病”,是由氣腫疽梭菌(Clostridiumchauvoei)引起的一種急性傳染性疾病[1],多發于牛、羊、鹿、豬等。該病有一定的地方流行性和季節流行性,地勢相對低洼的地區、夏季多發。自20世紀以來,氣腫疽已在國內20多個地區的暴發,給我國畜牧業發展帶來了嚴重的經濟損失。氣腫疽主要為動物采食氣腫疽梭菌感染的飼料或飲水后通過消化道傳播,潛伏期為2～5 d[2],自然感染后病程發展迅速,患病動物通常在1～3 d內出現死亡[3]。該病主要癥狀是肌肉組織水腫、產氣、壞死,體溫出現升高,或伴有敗血癥癥狀,肌肉豐富部位腫脹,按壓緊張且有捻發音,行動障礙等。氣腫疽梭菌通常危害牛、羊等反芻動物的健康,但據近年來的相關報道,日本[4]、美國[5]已出現感染人類并引起高熱、肺炎等細菌感染典型癥狀導致死亡的病例,這說明氣腫疽不僅對養殖業造成危害,也威脅到了人類健康。

氣腫疽梭菌又稱肖氏梭菌,屬細菌綱,芽孢桿菌科,梭菌屬(Clostridium)。氣腫疽梭菌的菌體長度為1.5～8.5 μm,菌體兩端圓滑,無莢膜,因其有周身鞭毛而能夠運動,芽胞通常位于菌體中央,也有可能偏向其中一端[6]。氣腫疽梭菌C54-1株(CVCC60001),由山西省家畜防疫處于1949年自山西省和順縣氣腫疽牛上分離所得,現保存于國家獸醫微生物菌(毒)種保藏中心[7]。氣腫疽梭菌C54-1株屬于強毒株,為氣腫疽梭菌滅活疫苗效力檢驗用強毒菌種,也是氣腫疽梭菌滅活疫苗生產用菌種。該菌為專性厭氧菌,對環境的溫度、濕度等因素有較強的抵抗力,在土壤或者不利生長條件下,可形成芽孢并長期生存,用濃度為3%的甲醛溶液浸泡或高壓20 min以上才能失活[8]。該菌對于青霉素、四環素、土霉素、恩諾沙星、環丙沙星等藥物敏感[9]。由該菌制成的氣腫疽滅活疫苗以及氣腫疽牛出敗二聯干粉菌苗均有良好的防護效果,有報道該菌制成的核酸疫苗也能對小鼠起到良好的免疫效果[10]。

《中華人民共和國獸用生物制品規程》二〇〇〇年版[11](以下簡稱《規程》)中規定該菌種在凍干狀態下2～8 ℃的保存期為15年。新制備的菌種應按照《規程》進行檢定,本文將介紹氣腫疽梭菌C54-1株(CVCC60001)的制備和檢定方法及結果,通過16S rDNA鑒定從分子水平對其進行進一步鑒定,并對其以及對適宜該菌生長的培養基進行比對,將為該菌檢定和相關標準的制修訂提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種 氣腫疽梭菌C54-1株,CVCC60001,1995年7月10日凍干,F4,由國家獸醫微生物菌(毒)種保藏中心提供。

1.2 培養基及試劑 厭氣肉肝湯培養基、普通瓊脂培養基、胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)培養基、普通肉湯培養基、液體硫乙醇酸鹽培養基(TG)、胰酪大豆胨液體培養基(TSB)、生理鹽水、5%蔗糖脫脂牛奶、石蕊牛乳小管、醋酸鉛小管均購自北京中海生物技術有限公司;強化梭菌培養基(RCM)、細菌微量生化鑒定管、氧氣指示劑購自青島海博生物;革蘭氏染色液、無菌脫纖維綿羊血購自北京索萊寶;50%葡萄糖溶液,購自上海源葉生物;新生牛血清,購自VivaCell;甲醛溶液,購自MACKLIN;滅菌10%鉀明礬溶液和25%碳酸鈉溶液,實驗室自制;4%多聚甲醛溶液,購自國藥集團。

1.3 實驗動物 SPF豚鼠購自維通利華實驗動物技術有限公司;實驗用兔購自中國食品藥品檢定研究院;健康黃牛購自新疆某養殖場。

1.4 復壯用菌種的毒力監測 開啟1995年7月10日凍干的氣腫疽梭菌C54-1株1支,用0.6 mL普通肉湯溶解后,各取約0.2 mL接種于厭氣肉肝湯小管(以下簡稱肉肝湯小管)1支、普通瓊脂斜面小管1支、普通肉湯小管1支,37 ℃培養24 h。肉肝湯小管應長菌、產氣旺盛,普通瓊脂斜面小管和普通肉湯小管上不生長。之后吸取肉肝湯小管培養物3.0 mL,接種于厭氣肉肝湯中管,37 ℃培養24 h。將肉肝湯中管培養物混勻后,分別按0.1 mL/只、0.2 mL/只、0.3 mL/只,股內側肌肉注射350～450 g SPF豚鼠,每個滴度1只。

1.5 菌種的牛體復壯 將菌種按照1.4項方法復溶、接種并傳代1次后,取3.0 mL菌液接種于8月齡的健康黃牛臀部肌肉,牛于33.5 h左右死亡,解剖取少量組織(心血、肝臟、肌肉、肌肉滲出液)接種于肉肝湯小管中,37 ℃厭氧培養24 h;并用接種環取心血、肝臟接種于血平板中, 37 ℃厭氧培養48 h。

1.6 菌種的凍干制備 挑取1.5項血平板培養的菌落接種厭氣肉肝湯進行傳代培養,收集菌液,3000 r/min離心30 min,棄去上清,保留菌體,加入5%蔗糖脫脂牛奶作為凍干保護劑,重懸混勻。將菌體懸液分裝安瓿瓶中,入箱,按照厭氧菌凍干曲線進行凍干。凍干結束后,將安瓿瓶抽真空,封口后置2～8 ℃保存。

1.7 菌種的檢定

1.7.1 真空度測定、純粹檢驗及剩余水分檢定 根據2020年版《中國獸藥典》進行檢驗[12]。

1.7.2 培養特性檢定 用接種環刮取少量菌體在含10%綿羊脫纖血葡萄糖普通瓊脂平板上劃線培養,37 ℃厭氧培養48 h,觀察菌落形態。

1.7.3 形態和生化特性檢定 取新鮮培養的血平板上的菌體進行革蘭氏染色,進行判定。使用細菌微量生化鑒定管參照使用說明書進行生化特性檢查。

1.7.4 培養基比對研究 分別使用《規程》中要求的厭氣肉肝湯以及目前商品化培養基——強化梭菌培養基對于C54-1株進行培養,同時進行毒力(豚鼠、家兔)、免疫原性的測定,觀察記錄結果。

1.7.6 毒力檢定 按照1.4項下方法復溶、接種并傳代1次后,分別攻毒黃牛、豚鼠、兔。

1.7.6.1 黃牛 取24 h培養物2.0 mL,接種于8月齡的健康易感黃牛,臀部肌肉注射。規程要求黃牛注射后60 h內死亡[11]。

1.7.6.2 豚鼠 取24 h培養物0.1～0.3 mL,接種于體重350～450 g的豚鼠2只,股內側肌肉注射。規程要求豚鼠注射后16～48 h內死亡[11]。取攻毒后16～48 h內死亡豚鼠的注射部位的肌肉,置于4%多聚甲醛溶液中固定,按常規程序制備石蠟切片,進行HE染色。

1.7.6.3 兔 取48 h培養物1.0 mL,接種于體重1.5～2.0 kg的家兔2只,臀部肌肉注射。規程要求家兔注射后不應死亡。本實驗中家兔注射后,觀察10 d[11]。

1.7.7 免疫原性檢定 按照《規程》制備氣腫疽滅活疫苗(明礬苗)[6],2～8 ℃保存。分別免疫體重350～450 g的豚鼠4只,1 mL/只,免疫21 d后使用C54-1株對免疫組、對照組豚鼠進行攻毒,觀察各組豚鼠狀態持續10 d,記錄結果[11]。取觀察10 d的免疫組豚鼠的注射部位的肌肉,置于4%多聚甲醛溶液中固定,按常規程序制備石蠟切片,進行HE染色。

1.8 16S rDNA鑒定 取C54-1株的24 h培養物2.0 mL置于EP管中,2～8 ℃冷鏈寄送至上海派森諾生物科技有限公司進行測序:對細菌基因組DNA提取、PCR 擴增及產物純化,將菌種純化后的PCR產物用NCBI Blast程序將拼接后的序列文件與NCBI 16S數據庫中的數據進行比對,得到相似性最高的物種信息,即為鑒定結果。

2 結果與分析

2.1 真空度測定、純粹檢驗及剩余水分檢定 對凍干的菌種進行真空度測定,C54-1株300/313支安瓿呈現白色或粉色或紫色輝光,符合規定;將不符合規定的凍干菌種進行無害化處理。

2.2 純粹檢驗 分別各抽取5支真空度測定良好的C54-1株菌種進行純粹檢驗,結果均為5/5符合規定。

2.3 剩余水分測定 分別各抽取4支真空度測定良好的C54-1株菌種進行剩余水分測定,剩余水分測定結果為1.2%、0.8%、1.7%、1.4%,均符合規定。

2.4 培養特性檢定 肉眼觀察培養48 h的C54-1株菌落狀態:灰白色,外圈為不規則圓形,內圈為規則圓形、邊緣不整齊,中間凹陷或凸起的典型紐扣狀菌落,菌落周圍呈透明狀,呈雙環β溶血(圖1),符合培養特性規定。

圖1 C54-1株菌落培養形態Fig 1 Colony culture morphology of strain C54-1

2.5 形態和生化特性檢定

2.5.1 形態檢定 挑取新鮮培養物進行革蘭氏染色,結果為革蘭氏陽性中等大小桿菌,兩端鈍圓,單個散在,偶有雙聯,大小不一(圖2),符合形態檢定規定。

圖2 C54-1株形態特征Fig 2 Morphological characteristics of strain C54-1

2.5.2 生化特性檢定 從平板上挑取1～3個單一菌落接種于細菌微量生化鑒定管,糖發酵管中需加入新生牛血清,100 μL/管。C54-1菌種反應結果具體詳見表1,氣腫疽梭菌發酵半乳糖、麥芽糖、果糖、葡萄糖、蔗糖等,產氣產酸;不發酵棉子糖、水楊素、甘露醇、衛矛醇等;硝酸鹽還原,產硫化氫;石蕊牛乳不定,或微產酸,或沒有變化,還原中性,明膠液化[13]。生化特性檢定結果符合規定。

表1 C54-1菌種生化特性檢定結果Tab 1 Biochemical characteristics results of strain C54-1

2.6 16S rDNA鑒定結果 將測序得到的序列在 NCBI中比對,鑒定結果為氣腫疽梭菌(Clostridiumchauvoei),相似度為99.93%。目前,細菌學家普遍認為,當16S rDNA序列同源性高于97%時,可以認為是屬內的同種[14-15]。說明該菌種為氣腫疽梭菌。

2.7 適宜液體培養基研究 平板挑取單菌落,分別培養于厭氣肉肝湯小管和強化梭菌培養基小管,培養24 h。培養結果可以看到,相同的接種量和培養時間,無論是厭氣肉肝湯還是強化梭菌培養基均產氣、生長良好,說明兩種培養基均可以為氣腫疽梭菌C54-1株生長提供足夠的營養(圖3),而強化梭菌培養基沒有固體成分,其渾濁度與菌液濃度具備相關性,可根據實際需求選擇適宜的培養基。

左到右分別為:接種C54-1株的厭氣肉肝湯小管、未接種C54-1株的厭氣肉肝湯小管、接種C54-1株的強化梭菌培養基小管、未接種C54-1株的強化梭菌培養基小管圖3 C54-1株菌種不同培養基培養結果Fig 3 Bacteria culture results of strain C54-1 with different media

2.8 毒力檢定與比對 將C54-1株的厭氣肉肝湯培養物,分別注射豚鼠、家兔、黃牛,攻毒劑量分別為0.1 mL/只、1.0 mL/只、2.0 mL/頭,在注射后24 h,豚鼠及黃牛全部死亡,注射后觀察10 d,家兔均存活(表2)。C54-1株毒力檢定符合規定。同時用相同試驗方法,將C54-1株24 h強化梭菌培養基培養物進行攻毒,在注射后16～48 h內,豚鼠全部死亡;注射后10 d,家兔均存活(表2)。試驗表明,經過兩種培養基培養的菌液制備的攻毒菌液毒力均符合現行規定。HE染色結果(圖4):與空白對照組(A)相比,可見經厭氣肉肝湯(B)和強化梭菌培養基(C)培養的氣腫疽梭菌均可導致豚鼠肌肉組織出現化膿性肌炎,肌纖維間聚集大量中性粒細胞,部分肌纖維溶解或萎縮。

表2 C54-1菌種毒力檢定試驗結果Tab 2 Virulence test results of strain C54-1 with different media

A:空白對照組;B:厭氣肉肝湯毒力組;C:強化梭菌培養基毒力組圖4 C54-1株毒力豚鼠肌肉HE染色Fig 4 HE staining of guinea pig muscle of strain C54-1

2.9 免疫原性檢定與比對

2.9.1 配制明礬苗 將C54-1株的厭氣肉肝湯24 h培養物,經純粹檢驗合格后,按菌液總量的0.5%加入甲醛溶液充分振蕩混勻并置 37 ℃滅活96 h,滅活檢驗合格后,加入滅菌的25%碳酸鈉溶液,將pH值調至7.9～8.1,然后按照9∶1的體積比將菌液與滅菌的10%鉀明礬溶液混合均勻,經無菌檢驗合格后,置于2～8 ℃保存。

2.9.2免疫程序 取350～450 g體重的豚鼠6只,其中4只設為免疫組,每只股內側肌肉注射接種明礬苗1 mL,另2只不接種,作為對照組。21 d后,用C54-1株的厭氣肉肝湯24 h培養物作為攻毒用菌液,分別對免疫組和對照組進行攻毒,攻毒劑量為規定最小劑量0.3 mL/只。

2.9.3 結果 攻毒后72 h內,C54-1株的厭氣肉肝湯24 h培養物的對照組豚鼠2/2死亡,免疫組豚鼠4/4存活。C54-1株免疫原性檢定符合規定。同時用相同試驗方法,將C54-1株的強化梭菌培養基24 h培養物進行攻毒,對照組2/2死亡,免疫組4/4存活(表3)。試驗表明,經過兩種培養基培養的菌液制備的明礬苗,均可產生良好的保護作用。HE染色結果(圖5):經過厭氣肉肝湯培養的菌液制備的明礬苗免疫21 d后使用厭氣肉肝湯培養的氣腫疽梭菌攻毒的免疫組(B)、經過強化梭菌培養基的菌液制備的明礬苗免疫21 d后使用強化梭菌培養基培養的氣腫疽梭菌攻毒的免疫組(C)與空白對照組(A)相比,兩組豚鼠肌肉組織結構清晰,肌纖維整齊有序,均未見明顯異常;同時,未經免疫并使用厭氣肉肝湯培養的氣腫疽梭菌攻毒的對照組(D)、未經免疫并使用強化梭菌培養基培養的氣腫疽梭菌攻毒的對照組(E)與空白對照組(A)相比,兩組豚鼠肌肉組織出現化膿性肌炎,肌纖維間聚集大量中性粒細胞,部分肌纖維溶解或萎縮。

表3 不同培養基培養C54-1菌種免疫原性檢定試驗結果Tab 3 Immunogenicity test results of strain C54-1 with different media

A:空白對照組;B:厭氣肉肝湯免疫組;C:強化梭菌培養基免疫組;D:厭氣肉肝湯對照組;E:強化梭菌培養基對照組圖5 C54-1株免疫原性豚鼠肌肉HE染色Fig 5 HE staining of immunogenic guinea pig muscle of strain C54-1

3 討論與小結

本研究檢定該批氣腫疽梭菌C54-1株培養特性、形態及生化特性、血清學特性、毒力、免疫原性、純粹、剩余水分及真空度項目,結果均符合《規程》標準的規定。在毒力檢定中顯示C54-1株經培養24 h,對于豚鼠的致死劑量為0.1 mL、對于黃牛的的致死劑量為2.0 mL;經培養48 h后,對家兔進行攻毒,攻毒劑量為1.0 mL時,至觀察結束,家兔均存活。結果表明,氣腫疽梭菌對黃牛、豚鼠敏感且具有較強致病力,而家兔對該菌存在抵抗力,這與目前報道的研究結果相一致。值得注意的是,在《規程》中使用不同培養時間的菌液攻毒不同敏感程度的動物,不能很好的說明毒力效果, 建議通過進一步研究為氣腫疽梭菌菌種的毒力檢定方法修訂提供參考意見。在免疫原性檢定中顯示C54-1株培養物經甲醛滅活后加入鉀明礬制成的滅活疫苗(明礬苗),在攻毒劑量為0.3 mL時仍對豚鼠全部保護,說明其免疫原性良好。在毒力與免疫原性檢定中,通過HE染色方法,能夠更為清晰的觀察和對比攻毒死亡及免疫保護的豚鼠的注射部位的肌肉組織形態變化:肌肉組織作為氣腫疽梭菌的靶器官,在攻毒后肌纖維受損明顯,出現化膿性肌炎,而通過明礬苗的免疫保護,肌肉組織結構保持清晰,肌纖維整齊有序,這也從組織學層面驗證了C54-1株的毒力特性及良好的免疫原性。隨著分子生物學、蛋白組學等技術的發展,對于菌種的功能研究也不斷深入,現已發現氣腫疽梭菌的4種主要抗原和毒力因子與該菌的致病能力密切相關,分別為細胞毒素A(CctA)、鞭毛蛋白(flagella)、神經氨酸酶(NanA)和透明質酸酶(nagH)[16]。對于這4種主要抗原和毒力因子的深入研究,不僅能為優化氣腫疽梭菌菌種檢定的精確性和科學性提供思路,也能為氣腫疽梭菌檢驗檢測方法和新型疫苗的研究提供參考。另外,本研究在《規程》要求檢定項目的基礎上,增加了16S rDNA鑒定,通過分子生物學手段對該菌進行鑒定,不僅能夠更加準確確定細菌的屬種及純凈性,也有利于氣腫疽梭菌菌種資源信息的完善,為該菌種標準的修訂提供了分子水平的檢定依據。

《規程》中規定該菌種培養時使用厭氣肉肝湯進行培養[11]。但在實際檢定和研究過程中,由于厭氣肉肝湯在制備中需要使用牛肉和牛肝等天然性成分,可能會導致這種培養基不同批次的促生長能力出現差異。另外,在培養過程中厭氣肉肝湯培養基底部的肝塊會產生絮狀雜質,對菌體或菌液的收集純化造成一定影響,并且不能用于菌液濃度測定。強化梭菌培養基作為一種商品化厭氧菌培養基,配制簡便,標準明確,質量穩定可控,不僅可以用于梭菌的增菌培養,也對菌液濃度進行測定,能夠在一定程度上更加準確的反映細菌的生長情況并且對在攻毒實驗中控制攻毒劑量提供一定的參考意義。本研究將厭氣肉肝湯與強化梭菌培養基(RAM)對于氣腫疽梭菌C54-1株的促生長情況、毒力、免疫原性進行了比對,兩者均能滿足氣腫疽梭菌生長所需營養并對該菌種的毒力及免疫原性影響差異不大,在氣腫疽梭菌的菌種制備與檢定中,強化梭菌培養基(RAM)能夠替代厭氣肉肝湯,這為相關標準和規程中對于該菌的培養基的優化和修訂提供了參考。