動物mRNA疫苗生產廠房布局與工藝設計要點探究

劉業兵,吳 濤,夏應菊,陳紫昱,李佳昕,張存帥

(中國獸醫藥品監察所(農業農村部獸藥評審中心) 國家豬瘟參考實驗室,北京 100081)

mRNA疫苗技術是疫苗開發領域的一項重大進展,具備高效、研發周期短、安全性優良、生產技術通用性強的特點[1]。mRNA技術是一種將人工合成的mRNA分子引入細胞內,并利用細胞自身的翻譯機制來將其轉錄成蛋白質的技術,已有幾十年的研究歷史。新冠疫情暴發后,Moderna利用該技術僅用了42天即完成了新冠mRNA候選疫苗mRNA-1273的構建和篩選,并于2020年3月獲得FDA批準正式開始評估安全性和免疫原性的I期臨床試驗,試驗結果顯示該候選株的免疫保護性可達94.1%[2]。2020年12月輝瑞和Moderna分別研制的mRNA疫苗均獲得美國食品安全局的緊急使用授權(EUA),成為疫苗史上最快研制上市的疫苗[3],標志著mRNA技術正式應用到COVID-19臨床預防。隨著mRNA技術的發展以及在新冠疫情防控中的應用,該技術成為生物醫學領域的研究熱點,得到了極大的關注,并獲得了2023年諾貝爾生理學或醫學獎。

作為一種潛力巨大的新型技術,無論是出于預防目的還是治療用途,以及作為新型治療藥物的基礎,諸多國內外企業正快速推進相關mRNA制品的研究與應用[3]。截至2023年12月,美國Moderna Therapeutics公司原研的mRNA疫苗產品數量最多,一共有28個;美國的AlphaVax公司和比利時的Ziphius Vaccines公司原研疫苗各10個;中國的斯微生物(StemiRNA)和蘇州艾博生物(Anbogen Biosciences)公司分別有9個和2個產品在研[4],其中包括艾博生物的ARCoVax疫苗和麗凡達生物旗下的LVRNA009,這兩種疫苗都已經步入了Ⅲ期臨床試驗。沃森生物、石藥集團等研究成功的新冠mRNA疫苗于2023年12月被我國國家藥監局獲批納入緊急使用[5]。

mRNA疫苗是通過合成和轉錄等技術制備得到的核酸制劑,通過特定的遞送系統將外源的目的基因序列導入機體細胞,從而表達目的蛋白并激發機體產生特異性免疫反應,以實現免疫保護[6-7]。mRNA注射進入體內發揮作用,但其本身不進入細胞核,避免了外源性DNA污染的風險,具備較高的安全性[7]。與傳統疫苗相比,mRNA疫苗采用DNA模板并通過無細胞酶促轉錄反應進行生產。這種生產工藝相對簡單,能夠快速實現大規模生產。同時,mRNA疫苗的配方設計和生產步驟具備可復制性,有助于縮短研發生產周期。

當前,國內動物mRNA研發的積極性很高,急需根據mRNA疫苗產業化生產工藝相對穩定的特點,結合相關法規要求,借鑒并參考人mRNA疫苗車間設計理念[8],通過全面分析人mRNA疫苗產業化車間功能區布局、潔凈區域劃分、人流和物流走向、壓差分布以及氣流方向等方面特點要求,在探究動物mRNA疫苗廠房工藝設計的關鍵點與核心要素的基礎上,提出可供參考的方案,以期為國內動物mRNA疫苗生產廠房的建設與管理提供參考。

1 mRNA的生產原理和工藝流程

從人用mRNA疫苗車間看,制造mRNA疫苗的過程一般分為三個關鍵階段:首先是質粒DNA(plasmid DNA,pDNA)模板的制備,接著是mRNA藥物成分(drug substance, DS)的合成,最后是其裝載入傳遞系統并完成制劑的最終灌裝[9]。這一系列步驟中至關重要的是從pDNA模板的生產到mRNA藥物物質的合成等核心工藝的工程設計。

在產業化規模下,pDNA的生產通常采用大腸桿菌為宿主的系統進行。這個流程包括大腸桿菌的發酵作為上游過程,繼而是收集與裂解菌體,最后是下游的pDNA提純和溶液的灌裝。在經過優化構建的pDNA系統中,目標質粒在大腸桿菌中通過發酵過程被表達,接著通過裂解過程釋放到培養上清液中。后續的澄清過濾及色譜純化等步驟將用于去除細胞殘留物、RNA和線性DNA等雜質。目前,pDNA的生產技術相對成熟,并已有詳盡的操作流程。

mRNA DS的生產工藝包含數個關鍵步驟:起始于上游的pDNA線性化,隨后進行體外轉錄(invitrotranscription, IVT),然后進入下游的mRNA純化過程,以及最終的原液灌裝。在這其中,特別需要注意的是,pDNA的生產過程最終產出的是超級螺旋(supercoiled)pDNA,這種形式的pDNA比線性化的pDNA結構更加穩定,更適合長期儲存。盡管如此,如果通過驗證確認線性化pDNA在特定條件下能夠保持穩定性,線性化過程可作為pDNA制造后的一個附加步驟。這樣獲得的線性化pDNA可在凍存之后直接應用于IVT過程。

目前,mRNA藥物成分(DS)的生產過程尚未形成一套通用和標準化的生產流程,市場上已上市或正在開發中的產品采取了不同的生產技術路徑,包括上游合成、下游處理方面,如圖1A所示。目前在人藥有兩種獲得批準的mRNA疫苗生產方法[10-11],其上游合成階段的差異是用于加成5’帽的技術選擇不同,一種是在轉錄過程中同時進行帽的添加(共轉錄加帽,即一步法),而另一種方法則是在轉錄完成后再加帽(轉錄后加帽,即二步法),如圖1B所示。

圖1 pDNA(A) 和 mRNA(B) 生產工藝流程Fig 1 Flow Diagrams of Production of pDNA(A) and mRNA(B)

在制備mRNA疫苗時,一步法是在IVT的同時結合引物,類似于BioNTech公司用于BNT162b2疫苗的技術;二步法[11]則是先進行IVT,隨后加入加帽酶進行結合,這是Moderna公司在生產其mRNA-1273疫苗時所采用的技術。

在純化mRNA的過程中,不同的公司采用的方法不盡相同。一般研究中的純化過程通常采納類似于Moderna公司使用的雙色譜分離技術。純化的第一階段是使用Oligo dT親和色譜法,它依賴于Oligo dT與mRNA的poly A尾端的特異性結合,以實現從合成混合物中分離mRNA,從而有效移除未參與反應的試劑和DNA模板等[12]。但是,這個步驟不能清除大量的雙鏈RNA(dsRNA)。純化的第二階段通常采用疏水色譜或離子交換色譜技術,這些技術有助于除去可能激發人體免疫反應的dsRNA和截短的RNA雜質。去除dsRNA雜質,還可以使用反相離子對色譜法,這種辦法對dsRNA的清除率相對較高,但這種方法大量使用有機溶劑。因此研究應用時,對環境可能造成的影響也需納入考量[12]。

鑒于mRNA疫苗生產過程并沒有完全統一的路線,現階段生產車間的設計必須具備一定的靈活性,以適應后續可能出現的各種不同的制造工藝需求。

2 mRNA疫苗的生產規模和產能

mRNA因其針對的目標和途徑的不同而需要不同的生產規模。例如,在應對全球性流行病時用于預防的COVID-19疫苗需求量可達到數十億劑量。而對于其他種類的傳染病,比如季節性流感或特定類型腫瘤的預防和治療疫苗,雖然它們可能需要適配更多的治療方式,但每個特定應用的人群規模預計將達數百萬。除此之外,還存在著對極為專門化治療需求的個性化療法,這可能涉及到對單個特種病定制的產品,其生產規模相對較小,僅為微克到毫克級別。

參考市場上已獲批準的BioNTech/Pfizer和Moderna的COVID-19 mRNA疫苗的產品信息(見表1),并以每年生產10億劑疫苗的生產規模為案例,深入分析相關工藝設計問題。

表1 已上市 mRNA 疫苗產品信息Tab 1 Information on the Approved mRNA Vaccine Products

2.1 mRNA DS產能分析 根據文獻[8],基于規劃的年度產能目標,設定為mRNA物質每年30 kg。采用反應轉化率為100、以及過程收率為70%的參數進行產能需求計算,得出所需pDNA的年度產能為428.6 g。在每個生產批次中,若投入4.3 g的pDNA,并且按照70%的過程收率計算,每批能收獲的mRNA為301 g?？紤]到mRNA的單批生產周期為3天,一年內可進行約100個生產批次。據此估計,mRNA的年度產能至少達到或超過30.1 kg,從而才能滿足預定的年度產能要求。

2.2 pDNA產能分析 綜合上文分析,pDNA年度產能需求為每年428.6 g。應用體積為50L的發酵罐進行生產時,考慮到pDNA的表達量為0.2 g/L,并且以50%的收率估算,預計每一批次產出約為5 g的pDNA[16]。假設每批pDNA的生產周期為5天,并且批次之間的生產間隔設定為3.5天,那么在一個年度周期內,至少可以完成88個生產批次。據此,年度pDNA產量至少需要達到440 g,才能充分滿足年度產能要求。

在不對現有生產設施進行改進的前提下,通過減少年度生產批次,可將生產班次從三班制調整為兩班制,或是調降mRNA藥物成分(DS)生產過程中單批次的投料量至使得體外轉錄(IVT)過程中藥物濃度維持在2～5 g/L的水平,實現生產線的靈活調整,以支持每年生產最多7500萬劑(每劑100 μg)的疫苗。這樣的產能能夠滿足預防和治療目的mRNA疫苗的目標群覆蓋需求。

3 人mRNA疫苗生產廠房設計示例

根據文獻資料[8]就人用mRNA疫苗生產制造工藝布局、人員與物料流向、潔凈區的劃分、壓力設計和氣流走向等要素進行分析介紹,見圖2。

圖2 mRNA 疫苗廠房工藝平面布置圖Fig 2 Layout Plan of mRNA Vaccine Manufacturing Process

3.1 生產工藝流程的布局 在生產布局規劃中,設置兩個生產區域:一個是50L規模的質粒生產區,另一個是同樣規模的mRNA 藥物成分(DS)生產區。與傳統的抗體制造設備相比,這些設備的規模較小。要求無菌條件下進行的灌裝工作必須在無菌車間內進行,而這一部分的工藝設計已經相當成熟,因此重點關注pDNA和mRNA DS的生產過程的工藝布局。

生產無菌的mRNA DS對環境條件有較高要求,在工藝布局設計時將其與大腸桿菌的生產線徹底隔離,并單獨設置,使用不同的空調系統,防止交叉污染。如圖2展示的,左側區域是pDNA的生產區域,而右側是mRNA DS的生產區域。pDNA DS的生產線包括以下功能間:接種間、發酵和收獲間、純化間以及灌裝間。與此同時,培養基的配制間與上游工段鄰接,而緩沖液的配制間則緊鄰下游工段,以實現物料傳輸的最短距離。其他輔助空間包括清洗和滅菌間,以及微生物廢物滅活間等。

在mRNA DS的生產車間中,關鍵工序操作間主要包括IVT間、純化間,配液間與純化間相鄰,方便使用。此外,還配備了清洗和滅菌間,中間過程的控制室,以及材料暫存間等輔助功能間。傳統工藝布局理念,可以按照類似于實驗室的“大通間”設計思路用在mRNA DS的生產車間設計方面,即把IVT和純化過程安置在同一功能間內。這種布局具有工藝切換靈活、節約空間等優勢,但是需要對潛在的上下游交叉污染問題進行充分的風險評估。

3.2 潔凈區域劃分及人物流流向 生產pDNA時對操作環境潔凈度的設置,遵循GMP要求。在pDNA生產過程中,用于培養大腸桿菌其所在背景環境為C級潔凈區。發酵過程若是封閉操作,所推薦的潔凈級別為D級以上。在純化階段,可在C級環境下進行。

如圖3所描述,人員與物料的出入口設有氣閘間。通過在人員或物料進出時控制空氣流動,盡可能降低微生物及其他污染源的介入。在換穿潔凈服之后,pDNA生產人員進入D級潔凈區的走廊,在前往接種間之前,需更C級潔凈衣。與此類似,純化室的工作人員在進入相關功能間之前,同樣需更C級潔凈衣。物料通過專設的物料氣閘間,經過外清潔后進入潔凈區。廢棄物由專設廢物氣閘間轉出,接著被運送至北側。此類平面布局通過氣閘間將發酵間、純化間等可能產生污染的區域隔離開來,確保D級共用通道的相對潔凈狀態。

圖3 潔凈區域劃分及人物流走向Fig 3 Clean Area Classication and Personnel and Material Flows

在mRNA DS的生產區,由于最終產品需經無菌過濾,因此整個制造區是按照C級潔凈標準而設計的,以控制過程中的生物載量。在其進出口同樣設有供人員及物料專用的氣閘間。在更C級潔凈服后,人員可進入C級潔凈區走廊及其它功能空間。IVT和純化是兩個關鍵的核心功能間,通過設置氣閘間來降低交叉污染的風險。

3.3 壓力梯度與氣流控制 潔凈室入口處的氣閘室設計起著關鍵作用,其遮擋外部的污染空氣并且調整壓力差異。根據空間的特定需要,設置梯度式(cascade)氣閘間、正壓式(bubble)氣閘間和負壓式(sink)氣閘間等多種形式,如圖4所示。梯度式(cascade)氣閘間適用于需要保持一定潔凈等級但無隔離需求的場所,或者有隔離需求但不要求嚴格潔凈度的場所。正壓和負壓風閘適宜用在既有潔凈度要求又需產品隔離的場合。如圖5所示,mRNA DS的更衣空間采取了漸變壓力風閘設計,用以確保合適的潔凈水平。C級通道與各關鍵功能區之間,正壓風閘的設置有助于阻止區域間空氣交叉流通,保持潔凈室內的潔凈等級,并有效避免各操作間的空氣外泄。與此相似,pDNA生產區域以及發酵和收獲間與D級通道之間也采用正壓氣閘設計,以防止潛在的帶菌空氣污染D級潔凈走廊。純化間則涉及pDNA原液的無菌過濾與包裝,因此與D級潔凈走廊之間應用了梯度式氣閘間,確保氣流從純化區向D級潔凈走廊流動,預防走廊內的氣流倒流,避免影響產品的質量。

圖4 壓力式氣閘的分類Fig 4 Types of Pressure Airlock

圖5 壓差分布和氣流流向Fig 5 Pressure Zones and Air Flows

4 人mRNA疫苗車間設計理念對動物mRNA疫苗車間設計的啟示

筆者通過對國內外人藥法規管理以及資料、文獻查詢,結合對國內某公司的mRNA疫苗生產車間進行了調研和學習交流,根據獸藥GMP相關要求,對動物mRNA疫苗生產線的工藝布局進行了探究與思考,提出了供獸藥行業參考的建議。

4.1 關于 mRNA疫苗生產工藝 mRNA疫苗的制造始于以pDNA為模板的過程,通過酶的作用,從pDNA轉錄出mRNA。歐盟法規允許生物技術公司將此類pDNA的制作外包給專業的合同制造機構(contract manufacture organization,CMO),并把這一環節作為原材料監控的一個部分[17-18]。與此不同,《中華人民共和國疫苗管理法》及《新型冠狀病毒預防用疫苗研發技術指導原則(試行)》規定,在中國境內,pDNA模板被歸類為原液生產的一部分[19],要求相關企業必須自行制造pDNA。而我國動物疫苗GMP管理實踐中,也需將其作為生產的一部分。鑒于這些差異以及對技術平臺完善性及將來應用的靈活性的考慮,動物mRNA疫苗的制造流程可從pDNA的制備著手,重點關注pDNA與mRNA原液制備的關鍵工藝流程和與其相應的工藝工程設計細節。

4.2 關于動物mRNA疫苗車間生產線分區 根據目前動物mRNA疫苗的生產工藝,其生產線核心功能區通?？煞譃?個區域(平面布局參見圖6):發酵和收獲區、pDNA純化區、IVT區、LNP區和無菌罐裝區,這5個區域應分別設置且相互獨立,不同區域的人流和物流應分開設置,與mRNA疫苗生產相配套的倉儲區和質檢區可參考常規獸藥GMP的工藝設計。

圖6 動物mRNA疫苗車間平面布局圖Fig 6 Schematic of an animal mRNA vaccine workshop

4.3 關于主要功能區域 發酵和收獲區,主要是采用不同規格的發酵罐對大腸桿菌進行發酵,然后通過碟片離心機或冷凍離心機收集菌體,再對菌體進行裂解,離心后收集上清。

pDNA純化區,主要是通過超濾濃縮-層析-超濾等方式對獲得的pDNA進行逐級純化,在純化區的末端可設置酶切反應罐,對純化后的pDNA進行線性化。

IVT區,主要是對pDNA進行體外轉錄,然后超濾或者層析,進行加帽修飾,親和層析,最后再經過一次超濾后,保存或進入下一道工序。

LNP區,主要是對體外轉錄后的mRNA進行包裝,通常采用微流體動力學技術將mRNA和LNPs混合,使mRNA被脂質顆粒所包裹,根據需要可加入防凍劑等穩定劑。

無菌罐裝區,主要是將制劑灌裝到小瓶或預裝式注射器中。

4.4 關于質量控制及其他功能間 除了生產車間配置之外,mRNA疫苗的生產還需輔以適當的質量控制(quality control,QC)實驗室,以進行原料、中間產物和最終產品的檢測工作。例如,在pDNA生產時對細菌種子的檢測、超螺旋質粒的純度、殘留和微生物限度的質量控制等。同時,車間所使用的部分原料和輔料,比如特定的酶,可能需要在特定溫度下儲存;與此類似,mRNA疫苗的原液和成品也對保存溫度有明確要求。例如,BioNTech/Pfizer的疫苗最終產品需儲存在-80～-60 ℃的條件下,而Moderna的mRNA疫苗最終產品的儲存溫度為-25～-15 ℃。由此,存儲區域需配備相匹配的冷藏設備,比如冰箱或冷庫,工藝布局設計中需包含這一考量。此外,在遞送系統的裝載過程中,可能會使用甲級的乙醇溶液進行稀釋,這就需要考慮防爆的標準和措施。

5 結 語

mRNA疫苗目前正在進入從實驗室研究向產業化生產的轉型期,展現出巨大的市場潛力。然而,它仍須跨越多項技術難關才能成功實現。迄今,人藥物領域國外只有Moderna、BioNTech/Pfizer的COVID-19 mRNA疫苗分別獲得了FDA和EMA等監管機構的緊急使用授權,國內只有沃森生物、石藥集團等研發的新冠mRNA疫苗被國家藥監局批準納入緊急使用。相比之下,動物mRNA疫苗研發大多停留在臨床前研究階段,缺乏在獸用GMP標準下進行產業化生產經驗,同時也缺少相關的質量控制和監管先例作為參照。工廠設計應既具備前瞻性,以應對潛在的生產能力擴張,同時又需避免過度設計,以免造成初期投資過高。這要求對疫苗產品本身的特性及市場未來的發展趨勢有充分的了解和預判。本研究旨在為國內動物mRNA疫苗生產平臺的建設和發展提供思路。