血清長鏈非編碼RNA肌動蛋白纖維相關蛋白1-反義RNA1水平與鈣化性主動脈瓣狹窄病人左心室功能的相關性研究

許國磊，吳寶，吳欣芳，王吉元，姜北，侯瑋瓊

作者單位：中國中醫科學院廣安門醫院南區內一科，北京 102600

鈣化性主動脈瓣狹窄（CAS）是繼冠狀動脈疾病和高血壓之后心血管疾病的第三大原因。CAS特征為瓣葉緩慢進行性纖維鈣化重塑，導致血流阻塞［1］。CAS發病率與年齡相關，由于老齡化現狀，CAS發病率將增加，導致全球CAS 疾病負擔加重［2］。CAS 需要及時有效診斷和治療，若治療不及時將導致心臟肥大，并將進展為心力衰竭。臨床上治療重度狹窄者依賴于主動脈瓣置換術，但該方式需要永久使用抗凝劑，且人工瓣膜使用壽命有限仍面臨再次手術問題，且由于病人多為高齡，并多有合并癥，導致晚期CAS預后仍較差［3］。因此，準確評價左心室射血分數（LVEF）保留的CAS病人心臟病變情況，對左心室功能評價、制定治療策略以及評估預后有重要意義。目前，已有研究證實長鏈非編碼RNA（lncRNA）中的長鏈非編碼RNA 肺腺癌轉移相關轉錄本1（MALAT1）、lncRNA HOX 轉錄反義（HOTAIR）與CAS 進展中的主動脈瓣鈣化相關［4］。lncRNA 肌動蛋白纖維相關蛋白1-反義RNA1（AFAP1-AS1）是一種反義lncRNA，位于人4 號染色體，有6 810 個核苷酸，并已證實在多種惡性腫瘤中發揮促癌作用［5］。近期研究顯示，lncRNA AFAP1-AS1 在鈣化的主動脈瓣中和人瓣膜間質細胞（VIC）的成骨誘導后表達水平增加；lncRNA AFAP1-AS1 的過表達或敲除可分別促進或抑制VIC 的成骨分化［6］。從機制上講，lncRNA AFAP1-AS1 通過海綿化微RNA（miR）-155上調SMAD 家族成員5（SMAD5）表達，最終導致VIC的成骨分化［7］。此外，VIC 的成骨分化與主動脈瓣鈣化密切相關［8］。但目前針對lncRNA AFAP1-AS1與CAS 病人左心室收縮及舒張功能研究尚不清楚。因此本研究分析了lncRNA AFAP1-AS1 與CAS 病人臨床參數以及左心室收縮及舒張功能指標相關性，以期為CAS 病人臨床診斷以及左心室損傷功能機制分析提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料以2020 年1 月至2021 年12 月因CAS 就診于中國中醫科學院廣安門醫院的129 例病人作為CAS 組（LVEF≥50%），其中男、女分別為73、56 例，年齡（65.16±6.82）歲，身體質量指數（BMI）（22.59±2.30）kg/m2。同期該院健康志愿者130 例作為對照組，排除心臟疾病，均為竇性心律，其中男、女分別為65、65 例，年齡（64.49±6.25）歲，BMI（22.16±2.08）kg/m2。本研究經中國中醫科學院廣安門醫院倫理委員會批準（批號2019-01-76）。

根據2014 年美國心臟病學會（ACC）/美國心臟協會（AHA）中［9］建議，結合主動脈瓣口面積（AVA）、主動脈瓣峰值流速（Vmax）、主動脈瓣平均壓差（PGmean）將CAS 病人分為：輕度狹窄病人（42 例）：AVA＞1.5 cm2、Vmax 2.6～2.9 m/s、PGmean＜20 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），中度狹窄病人（48 例）：AVA 1.0～1.5 cm2、Vmax 3.0～4.0 m/s、PGmean 20～40 mmHg，重度狹窄病人（39例）：AVA＜1.0 cm2、Vmax≥4.0 m/s、PGmean≥4.0 mmHg。

納入標準：（1）經常規超聲心動圖證實主動脈瓣狹窄（AS）程度為輕度及以上；（2）入組者均簽署知情同意書；（3）LVEF≥50%；（4）竇性心律；（5）甲狀腺功能正常。排除標準：（1）冠心病、感染性心內膜炎、肺源性心臟病、急性心肌梗死、主動脈瘤、心律失常、糖尿病、主動脈夾層、馬方綜合征、風濕性AS、痛風、高脂血癥等；（2）腎功能不全；（3）經胸超聲心動圖聲窗不佳；（4）瓣膜置換史；（5）合并惡性腫瘤；（6）急性或慢性炎癥性疾病。

1.2 方法

1.2.1 血清lncRNA AFAP1-AS1 表達水平檢測CAS組在入院后次日（對照組在體檢當天）采集空腹外周血，離心取上層血清，利用愛必信公司的RNA提取試劑盒（貨號abs60276）得到總RNA，然后在超微量分光光度計（型號nanodropone/one c，賽默飛公司）上檢測RNA質量與濃度，并取RNA質檢參數在1.8～2.0的樣品，按照First-strand cDNA Synthesis Mix With gDNA Remover 試劑盒（貨號abs601510）得到互補DNA（cDNA）；然后按照定量預混液（貨號abs601511）配制反應體系，在BIO-Rad 定量儀（型號CFX96 Touch）上采集信號。反應程序：95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 25 s、72 ℃ 30 s 循環40 次。以2-ΔΔCt法計算lncRNA AFAP1-AS1相對表達量，引物序列見表1。

表1 qRT-PCR檢測血清lncRNA AFAP1-AS1表達水平引物序列

1.2.2 一般資料收集記錄入院時病人年齡、性別、體表面積（BSA）、心率、BMI、現病史、舒張壓、吸煙史、飲酒史、收縮壓等；收集實驗室生化檢驗指標：超敏C 反應蛋白（hs-CRP）、脂蛋白（a）［Lp（a）］、低密度脂蛋白（LDL）、氨基末端B 型利鈉肽原（NT-proBNP）、白細胞計數、總膽固醇（TC）、肌酐。

1.2.3 常規超聲心動圖檢查彩色多普勒超聲診斷儀Aloka Prosound F75，進行超聲心動圖檢查，探頭為UST-52105，頻率1.5～5.0 MHz，按照美國超聲心動圖協會指南標準測量［10］，包括LVEF、Vmax、左室舒張末期內徑（LVEDD）、左房前后徑（LAD）、二尖瓣口舒張早期及晚期血流速度峰值（E、A 峰）、左室收縮末期內徑（LVESD）、室間隔厚度（IVST）、左室舒張末期容積（LVEDV）、左室后壁厚度（LVPWT）。連續多普勒測量PGmean、Vmax。連續性方程法測量主動脈瓣口面積AVA［11］。

1.3 統計學方法采用SPSS 23.0 進行統計。計數資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。符合正態分布的計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，采用LSD 法對兩組間差異做進一步分析；兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；Pearson 法分析lncRNA AFAP1-AS1 與LVEF、LVPWT 等左心室功能指標的相關性。采用受試者操作特征曲線（ROC 曲線）分析血清lncRNA AFAP1-AS1 診斷CAS的效能。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CAS 組與對照組一般資料及血清lncRNA AFAP1-AS1表達水平比較CAS組與對照組年齡、性別、BMI、吸煙史、飲酒史、BSA、舒張壓、心率、TC、LDL 水平差異無統計學意義（P＞0.05）。CAS 組收縮壓、hs-CRP、白細胞計數、NT-proBNP、肌酐、Lp（a）及lncRNA AFAP1-AS1 表達水平高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 健康志愿者130例與鈣化性主動脈瓣狹窄（CAS）129例一般資料及血清lncRNA AFAP1-AS1表達水平比較

2.2 血清lncRNA AFAP1-AS1 表達與CAS 組病人臨床參數關系結果顯示，lncRNA AFAP1-AS1 表達與性別、年齡、BMI、吸煙史、飲酒史無關（P＞0.05），而與狹窄嚴重程度有關，其中輕度狹窄病人血清lncRNA AFAP1-AS1 表達水平低于中、重度狹窄者，而中度狹窄者lncRNA AFAP1-AS1 表達水平低于重度狹窄者，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 血清lncRNA AFAP1-AS1表達與CAS組病人臨床參數關系/

表3 血清lncRNA AFAP1-AS1表達與CAS組病人臨床參數關系/

注：lncRNA AFAP1-AS1為長鏈非編碼RNA肌動蛋白纖維相關蛋白1-反義RNA1，CAS為鈣化性主動脈瓣狹窄，BMI為身體質量指數。

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2.3 血清lncRNA AFAP1-AS1 診斷CAS 的ROC曲線ROC 結果顯示，血清lncRNA AFAP1-AS1 診斷CAS 的曲線下面積（AUC）為0.86［95%CI：（0.82，0.91）］，靈敏度為79.10%，特異度為81.50%，最大約登指數為0.606，截斷值為1.26。血清lncRNA AFAP1-AS1 診斷重度狹窄的AUC 為0.88［95%CI：（0.82，0.94）］，靈敏度為89.70%，特異度為70.00%，最大約登指數為0.597，截斷值為1.54。

2.4 CAS 組與對照組超聲資料比較CAS 組LVEDD、LVEDV、IVST、LVPWT、LAD、PGmean、Vmax水平高于對照組（P＜0.05），AVA水平低于對照組（P＜0.05）；兩組間LVEF、LVESD、E 峰、A 峰水平相比差異無統計學意義（P＞0.05）。見表4。

表4 健康志愿者130例與鈣化性主動脈瓣狹窄（CAS）129例常規超聲心動圖參數比較/

表4 健康志愿者130例與鈣化性主動脈瓣狹窄（CAS）129例常規超聲心動圖參數比較/

注：LVEF 為左心室射血分數，LVEDD 為左室舒張末期內徑，LVESD 為左室收縮末期內徑，LVEDV 為左室舒張末期容積，IVST 為室間隔厚度，LVPWT 為左室后壁厚度，LAD 為左房前后徑，E峰為二尖瓣口舒張早期血流速度峰值，A 峰為二尖瓣口舒張晚期血流速度峰值，PGmean 為主動脈瓣平均壓差，AVA 為主動脈瓣口面積，Vmax為主動脈瓣峰值流速。

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2.5 血清lncRNA AFAP1-AS1 表達與超聲指標的相關性分析相關性分析顯示，血清lncRNA AFAP1-AS1 與LVEDD、LVEDV、LVESD、E 峰、A 峰、PGmean、Vmax 呈正相關，與LVEF、AVA 呈負相關（P＜0.05）。見表5。

表5 鈣化性主動脈瓣狹窄129例血清lncRNA AFAP1-AS1表達與超聲指標的相關性分析

3 討論

CAS 是一種與年齡增長相關的進行性疾病，其特點是細胞外基質（ECM）重塑導致主動脈瓣葉初始增厚，并在進展階段有鈣化沉積［12-13］。CAS 病情較輕時無明顯癥狀，病人難以察覺，隨病變進展，將影響瓣膜口的啟閉，導致AS，同時病人還會伴有暈厥、呼吸困難等臨床癥狀［14］。目前，CAS尚無有效治療藥物，臨床上依賴于瓣膜置換術，然而經導管主動脈置換術及外科主動脈瓣置換術均伴隨較高的不良事件風險［3，15］。研究顯示，VIC 是主動脈瓣膜中最豐富的細胞類型，它會積極促進鈣化形成［16-17］。研究證實，部分lncRNA 家族成員與主動脈瓣鈣化過程中的成骨細胞分化相關［4，18］。因此，需要探索CAS 的左心室功能異常相關分子機制，對于尋找早期病情診斷血清標志物以及藥物研發有重要意義。

lncRNA AFAP1-AS1 是lncRNA 中重要一員，屬于促癌因子，已證實能夠促進腫瘤細胞侵襲、遷移等惡性活動［19］。近期研究證實，lncRNA AFAP1-AS1與主動脈瓣鈣化有關。過表達lncRNA AFAP1-AS1會促進脂多糖和干擾素處理的THP-1 細胞中M1 極化，但抑制M2 極化，并增強VIC 成骨分化；而沉默lncRNA AFAP1-AS1 則導致M2 極化增加，并抑制VIC 成骨分化［6］。這說明lncRNA AFAP1-AS1 可以促進M1 巨噬細胞極化，從而加劇VIC 成骨分化，在主動脈瓣鈣化中發揮作用。本研究結果顯示，與對照組相比，CAS 組lncRNA AFAP1-AS1 表達水平明顯升高，提示lncRNA AFAP1-AS1 表達水平上調可能與CAS病理過程中的VIC成骨分化異常相關。另有研究顯示，退行性鈣化性主動脈瓣疾病病人鈣化主動脈瓣和人VIC 成骨誘導后lncRNA AFAP1-AS1表達水平均增加，lncRNA AFAP1-AS1 通過海綿miR-155，間接誘導SMAD5 水平增加，促進VIC 成骨分化［7］。推測lncRNA AFAP1-AS1 通過調節巨噬細胞，或靶向miRNA/mRNA 表達，誘導VIC 成骨分化，導致主動脈瓣鈣化，進而推動CAS。

本研究結果顯示，血清lncRNA AFAP1-AS1 表達水平與性別、年齡、BMI、吸煙史、飲酒史無關，而與狹窄嚴重程度有關，其中輕度狹窄病人血清lncRNA AFAP1-AS1 表達水平顯著低于中、重度狹窄者，中度又低于重度狹窄者，說明血清lncRNA AFAP1-AS1 與CAS 狹窄程度密切相關，其持續異常高表達將大量誘導VIC成骨分化，推動鈣化形成，促進病情進展。因而這提示可以通過檢測CAS 病人血清lncRNA AFAP1-AS1 水平變化為CAS 診斷和病情嚴重程度評估提供依據。ROC 結果顯示，血清lncRNA AFAP1-AS1 診斷CAS 的AUC 為0.86，靈敏度為79.10%，特異度為81.50%；其診斷重度狹窄的AUC為0.88，靈敏度為89.70%，特異度為70.00%，提示可以將血清lncRNA AFAP1-AS1 作為臨床診斷CAS 及區分病人病情的輔助指標，以便于盡早制定治療策略，但后續應納入更大樣本量進一步驗證。

超聲資料比較結果發現，CAS 組與對照組LVEF、LVESD、E峰、A峰水平比較差異無顯著性，而CAS 組LVEDD、LVEDV、IVST、LVPWT、LAD 水平較高，這與張計青等［20］研究一致，說明CAS 病人心肌舒張、收縮功能均損傷。經Pearson 相關性分析，血清lncRNA AFAP1-AS1與LVEF呈負相關，與LVESD呈正相關，說明其可以反映CAS 病人左心室收縮功能；血清lncRNA AFAP1-AS1 與LVEDD、LVEDV、E峰、A 峰呈正相關，說明lncRNA AFAP1-AS1 與CAS病人的左心室舒張功能有關；血清lncRNA AFAP1-AS1與PGmean、Vmax、AVA 存在明顯相關性，再次證實血清lncRNA AFAP1-AS1 能夠用來評估CAS 嚴重程度。以上結果說明CAS病人血清lncRNA AFAP1-AS1水平變化與超聲心動圖相關參數具有一定相關性，說明lncRNA AFAP1-AS1與左心室功能及CAS病情嚴重程度密切相關，但尚不能證實lncRNA AFAP1-AS1與以上指標具有因果關系，同時仍未明確lncRNA AFAP1-AS1在CAS左心室功能變化中的具體機制，接下來我們將通過細胞實驗等探究lncRNA AFAP1-AS1參與左心室功能調節的具體機制，以期為臨床治療提供依據。

綜上所述，CAS 血清lncRNA AFAP1-AS1 表達水平升高，與狹窄嚴重程度有關，且其異常程度與左心室舒張、收縮功能有關，血清lncRNA AFAP1-AS1可能成為診斷CAS 及病情嚴重程度的潛在生物標志物，但具體作用機制仍有待研究。