敲除TSP-1對小鼠急性肝損傷保護作用的機制

吳敏, 馮偉珂, 占一姍, 王劍巧, 曾金娣, 李科浩, 張守華, 陶強, 占敏△

1江西省兒童醫院普外科(江西南昌 330038); 2九江學院附屬醫院(江西九江 332000); 3井岡山大學附屬醫院(江西吉安 343000)

急性肝損傷(acute liver injury,ALI)主要是由藥物肝毒性、病毒感染、酒精濫用或肝臟缺血再灌注引起的急性肝功能障礙的重要臨床綜合征,常以肝細胞變性、壞死和凋亡等為病理特征[1]。ALI的惡化可導致急性或慢性肝衰竭、肝硬化和肝細胞癌,如果沒有得到及時有效的治療,嚴重的肝損傷可能是致命的[2]。統計顯示,每年每百萬人中總發病率為1～6例,接近每年2 000例。在美國,ALI每年占肝臟相關死亡的6%,占原位肝移植的7%[3]。血小板反應蛋白(thrombospondin,TSP)是一個由TSP 1～5組成的多功能分泌型蛋白家族,分為A和B兩個亞家族。即A家族由TSP-1和TSP-2組成,它們是具有同源結構的三聚體糖蛋白;B家族由TSP-3、TSP-4、TSP-5組成,它們是同源五聚體[4]。其中,TSP-1是一種450 kD的糖蛋白,由Baenziger等[5]首次從活化的血小板中分離出來。TSP-1的結構由6個不同的結構域組成:1個氨基端域,1個前膠原蛋白同源區,3種類型的重復(Ⅰ型重復,Ⅱ型重復,Ⅲ型重復)和一個羧基端[4]。由于其不同的結構域,它可以與多種受體相互作用,并表現出抗血管生成、促進細胞凋亡和免疫調節等的作用[6]。目前僅發現TSP-1在腎臟、血管、癌癥和代謝性疾病方面的研究最為廣泛[7],但在肝臟疾病方面的研究卻很少。因此,本研究于2021年7月至2023年1月完成實驗,旨在探討敲除TSP-1在小鼠ALI中的作用,并從炎癥反應、氧化應激和細胞凋亡等角度分析分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本研究中所用C57BL/6J雄性小鼠(4～6周齡,體重20～25 g)購買于長沙市天勤生物技術有限公司,許可號SCXK(湘)2019-0014;本研究采用的TSP-1基因敲除雄性小鼠(4～6周齡,體重20～25 g)購買于Jackson實驗室。所有實驗經倫理委員會審查和批準(JXSETYY-YXKY-20220162)。

1.2 主要藥物和器械 四氯化碳(CCl4)、橄欖油購買于西隴科學股份有限公司;RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、qPCR試劑盒購買于Promega生命科學公司;小鼠TSP-1酶聯免疫吸附測定試劑盒、小鼠白細胞介素-6(IL-6)酶聯免疫吸附測定試劑盒、小鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)酶聯免疫吸附測定試劑盒、丙二醛(MDA)比色法測試盒以及谷胱甘肽(GSH)比色法測試盒購買于武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司;TUNEL檢測試劑盒購于賽維爾生物科技有限公司;一抗(兔來源的caspase-3)、二抗(山羊抗兔)以及TSP-1和GAPDH引物購買于福州載基生物科技有限公司;離心機購買于德國艾本德股份有限公司;組織研磨儀購買于上海凈信實業發展有限公司;全自動生化分析儀購買于長沙綜儀生物科技有限公司;光學顯微鏡購買于歐普林光電有限公司;實時熒光定量PCR儀購買于美國伯樂公司;多功能酶標儀購買于上海昆亞醫療器械股份有限公司等。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物模型的建立及分組 選取16只C57BL/6J小鼠,隨機分為WT組(n=8),按照橄欖油10 mL/kg 體重進行腹腔注射;WT+CCl4組(n=8),按照0.5 mL CCl4+9.5 mL橄欖油/kg(n=8),按照0.5 mL CCl4+橄欖油9.5 mL/kg體重進行腹腔注射。實驗終結于禁食不禁水24 h后,在麻醉狀態下采集血液和肝組織,-80℃保存備用。

1.3.2 肝組織HE染色 將肝臟組織依次進行脫水、包埋、切片、脫蠟、水化、染色、分化、脫水、透明、封片,自然晾干,置于顯微鏡下觀察結構并拍照。

1.3.3 肝功能檢測 取小鼠血液50 μL,用生理鹽水稀釋至200 μL,通過全自動生化分析儀測定ALT和AST水平。

1.3.4 RT-qPCR 取小鼠肝臟組織約40 mg,置于EP管中,每管加入1 mL Trizol,放入組織研磨儀5 min,然后按照RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、qPCR試劑盒說明書配置反應體系,在PCR儀上進行反應,用2-ΔΔCt法計算TSP-1的mRNA的相對表達量。所用引物序列見表1。

表1 所用引物序列

1.3.5 ELISA法檢測 取小鼠血清40 mL,用標準品和樣本稀釋液至100 mL,按照ELISA測定試劑盒說明書配置反應液,放入酶標儀上分別檢測TSP-1、IL-6和TNF-α的OD值。

1.3.6 比色法檢測 取小鼠肝臟組織約40 mg,置于EP管中,每管加入0.36 mL PBS液,放入組織研磨儀5 min,配置成10%組織勻漿。分別按照MDA和還原型GSH比色法說明書配置反應液,酶標儀上測OD值。

1.3.7 免疫組化法測定 切片依次進行烤片、脫蠟水化、抗原修復、消除內源性過氧化物酶、封閉、孵育一抗、孵育二抗、顯色、復染、分化、脫水、封片,最后將玻片晾干,顯微鏡下觀察拍照。

1.3.8 TUNEL法檢測細胞凋亡 切片依次進行烤片、脫蠟水化,用末端脫氧核苷酸轉移酶介導的 dUTP 缺口末端標記(TUNEL)檢測肝組織中的凋亡細胞,熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.4 統計學方法 所有數據采用GraphPadPrism8.0及SPSS 22.0軟件進行數據分析,兩組間比較采用t檢驗,多組間比較采用方差分析,P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ALI傷時TSP-1的表達升高 ELISA和RT-qPCR分別檢測WT組和WT+CCl4組血清和肝臟中TSP-1的表達水平。結果顯示,在血清和肝臟組織中,WT+CCl4組小鼠肝臟TSP-1的表達水平均明顯高于WT組小鼠(圖1A、B),表明小鼠ALI與TSP-1表達具有一定相關性。

注:A:ELISA法檢測小鼠血清中TSP-1的表達水平; B:PCR檢測肝臟組織中TSP-1 mRNA的表達水平圖1 小鼠肝臟TSP-1的表達水平

2.2 敲除TSP-1可減輕小鼠CCl4誘導的ALI 通過檢測小鼠血清中ALT和AST的水平以及HE染色法觀察肝臟綜合評估CCl4誘導小鼠ALI情況。生化結果顯示WT+CCl4組小鼠的ALT和AST顯著高于WT組,而相對于WT+CCl4組,TSP-1-/-+CCl4組小鼠血清ALT和AST顯著降低(圖2,P<0.05);HE染色WT+CCl4組小鼠肝細胞氣球樣變,可見大量灶狀壞死,以中央靜脈周圍為主,肝竇內見炎癥細胞浸潤。而相對于WT+CCl4組,TSP-1-/-+CCl4組壞死面積減少,僅見少許炎性細胞浸潤(圖3),提示敲除TSP-1可減輕小鼠受到CCl4誘導的ALI。

注:*P<0.05,**P<0.01圖2 各組小鼠血清中ALT和AST

注:WT組肝細胞以中央靜脈為中心放射狀排列,未見壞死、氣球樣變;WT+CCl4組可見肝細胞呈片狀壞死,肝小葉結構破壞;TSP-1-/-+CCl4組肝細胞點狀壞死,少許炎癥細胞浸潤圖3 各組小鼠肝臟病理組織學HE染色

2.3 敲除TSP-1可通過抑制炎癥反應減輕CCl4所致小鼠ALI 上述3組小鼠血清,通過ELISA測定炎癥因子TNF-α和IL-6水平。結果顯示,與WT對照組小鼠相比,WT+CCl4組的小鼠的TNF-α和IL-6水平顯著升高(P<0.05),而TSP-1-/-+CCl4組能顯著下調CCl4誘導的血清中TNF-α和IL-6的水平(圖4),提示敲除TSP-1可通過抑制炎癥減輕CCl4所致小鼠ALI。

注:*P<0.05,**P<0.01圖4 ELISA法檢測各組小鼠血清中IL-6和TNF-α的水平

2.4 敲除TSP-1可通過抑制氧化應激減輕CCl4所致小鼠ALI 取上述3組小鼠肝臟組織,通過比色法測定氧化應激因子MDA和GSH水平。結果顯示,與WT對照組小鼠相比,WT+CCl4組的小鼠肝臟組織中的MDA表達水平顯著升高,GSH表達水平顯著降低,而TSP-1-/-+CCl4組能顯著下調CCl4誘導的肝臟組織中MDA的表達水平和上調GSH的表達水平(圖5,P<0.05),提示敲除TSP-1可通過抑制氧化應激減輕CCl4所致小鼠ALI。

注:*P<0.05, **P<0.01圖5 3組小鼠肝組織中MDA和GSH的含量

2.5 敲除TSP-1可通過抑制細胞凋亡減輕CCl4所致小鼠ALI 取上述3組肝臟組織切片,采用免疫組化法檢測肝細胞中caspase-3表達水平以及TUNEL法綜合評估肝細胞凋亡情況。結果顯示,WT+CCl4組肝組織中凋亡率較WT組升高,而TSP-1-/-+CCl4組較WT+CCl4組陽性率低(圖6),提示敲除TSP-1可通過抑制細胞凋亡減輕CCl4所致小鼠ALI。

3 討論

肝病仍然是備受世界關注的全球性難題,目前對肝病損傷的病理和發病機制取得重大的研究,其中炎癥、氧化應激和細胞凋亡是ALI發病機制的主要病理特征[8]。

在本研究中,我們首先成功構建了CCl4誘導的ALI小鼠模型,發現與WT小鼠相比,模型組小鼠的TSP-1明顯升高(P<0.05),提示TSP-1可能參與了ALI的過程。為了進一步闡明TSP-1在ALI中的作用及其可能的機制,我們使用了TSP-1敲除小鼠,并觀察到相對于WT+CCl4組小鼠,TSP-1-/-+CCl4組小鼠ALT和AST下降,肝臟損傷明顯減輕,表明敲除TSP-1可減輕CCl4誘導的ALI。

IL-6和TNF-α主要是由組織單核細胞和巨噬細胞產生的促炎癥細胞因子,可以誘導參與各種炎癥反應的基因表達[9]。已有研究表明,TSP-1及其受體在免疫組織和參與抗炎過程的免疫細胞上表達,可以激活單核細胞和內皮細胞分泌促炎癥細胞因子,如IL-6和TNF-α[10]。在本實驗中,腹腔注射CCl4后,IL-6和TNF-α的表達水平明顯升高,而TSP-1基因敲除組則出現下降,說明敲除TSP-1基因可以通過抑制炎癥反應來減輕CCl4誘導的ALI。

活性氧(reactive oxygen species, ROS)是含有氧自由基的生物活性分子,在細胞生理上起著關鍵作用,但在高濃度時也有毒性,并能夠促進病理過程[11]。ROS的毒性在于能夠氧化細胞蛋白質、脂質和核酸,并通過各種信號引起細胞損傷、功能紊亂和誘發細胞死亡[12]。MDA是脂質過氧化的代謝終產物,反映了體內氧化反應的程度并誘發細胞損傷[13]。MDA含量可以間接反映氧自由基的水平,GSH的水平可以反映機體的抗氧化能力[14]。TSP-1可以促進自由基和ROS的過量產生[15]。例如,TSP-1通過激活受體CD47已被證明能刺激血管平滑肌細胞產生ROS,通過誘導氧化應激促進血管功能障礙[16]。本實驗結果顯示,與CCl4模型組相比,TSP-1-/-組的MDA含量明顯下降,GSH含量明顯上升,說明TSP-1的敲除會增加肝臟的抗氧化能力,減少脂質過氧化的形成。

凋亡是肝細胞對各種破壞性因素的第一反應,凋亡后的細胞容易發生壞死[17]。半胱氨酸天門冬氨酸蛋白酶的激活在氧化應激誘導的細胞凋亡過程中反復出現,對細胞凋亡過程有重要影響。半胱氨酸天門冬氨酸蛋白酶是細胞凋亡的關鍵促進因素,在介導細胞凋亡方面發揮著重要作用,并存在于多種細胞凋亡途徑的交叉點[18]。因此,半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶是負責執行細胞凋亡的關鍵因素。此外,半胱氨酸天門冬氨酸蛋白酶的另一種作用機制是通過相互激活進行自我激活,一旦細胞凋亡開始,啟動一連串的效應[19]。有研究表明TSP-1誘導的微血管內皮細胞的凋亡依賴于半胱氨酸天門冬氨酸蛋白酶,并由CD36受體引發的內在凋亡連鎖反應所介導[20]。本實驗結果顯示,WT+CCl4組的肝組織中caspase-3表達上調并且TUNEL顯示凋亡細胞亦顯著增加,而TSP-1-/-+CCl4組的肝組織中caspase-3表達明顯下降,提示TSP-1可能通過抑制caspase-3減弱細胞凋亡,從而減輕肝臟損傷。

因此,敲除TSP-1對CCl4誘導的小鼠ALI具有明顯的保護作用,其機制可能與改善炎癥、降低氧化應激和抑制細胞凋亡有關。未來有望通過檢測TSP-1的表達水平來評估肝損傷的嚴重程度,為早期診斷肝損傷提供參考以及為研發靶向生物制劑精準化治療肝損傷提供新方向。

利益相關聲明:本文所有作者共同認可論文,無利益沖突。

作者貢獻說明:研究設計為占敏;研究方案執行為吳敏、馮偉柯、占一姍、張守華;數據整理為占一姍、王劍巧;統計分析為曾金娣、李科浩;論文撰寫為吳敏,論文評閱為占敏、陶強。