基于腸道微生物學及代謝組學研究2型糖尿病患者腸道菌群結構及血清代謝產物的特征

阿孜古麗·買合買提, 米日古麗·吾木哈斯木, 李雪梅, 塞娜瓦爾·阿西木, 穆葉斯爾·哈斯木△

新疆維吾爾自治區婦幼保健院 1呼吸內分泌科, 2冠心病腎病科(新疆烏魯木齊 830000)

糖尿病(DM)作為以脂肪、蛋白質、水、電解質代謝紊亂的一組代謝性綜合征,調查表明[1],我國糖尿病發生率已經從1980年的0.67%升高至2018年的10.9%,患病人數已是全球首位,且發病年輕化趨勢越加明顯。近年來隨著分子生物學技術的不斷發展,人類對腸道微生物的認知有了巨大的進步,腸道菌群與疾病的相關性研究已經成為目前關注的熱點。相關研究顯示[2],腸道菌群與宿主的消化、代謝、免疫等方面密切相關,被許多學者比喻為人類的一個額外“器官”。相關報道表明[3],腸道菌群不但可以從正常食物中獲得額外能量促進肥胖的發生,還能夠通過分泌內毒素導致機體發生內毒素血癥,同時還可調節組織生物活性的脂肪酸合成等一系列過程參與DM等代謝性疾病的發生、發展。在另一領域,代謝組學是一類研究代謝性疾病的重要科學,通過研究機體代謝組學的特征譜能夠幫助人們理解疾病發生發展的機制以及獲得相應的生物學標志物。20世紀末國外有學者就對糖尿病的代謝譜進行分析,得出DM患者與正常人代謝譜之間存在較為明顯的差異[4]。國外有研究發現[5],通過LC-MS和二維GC-MS對兒童血清脂質譜、氨基酸和其他小分子代謝物進行分析,發現腸道菌群與糖尿病的發生有關。本研究擬通過分析2型糖尿病(T2DM)患者的腸道菌群結構多樣性特征和代謝組學差異,為臨床實踐提供參考依據,報告如下。

1 資料與方法

1.1 納入與排除標準 納入2021年6月至2022年12月新疆維吾爾自治區婦幼保健院就診的初發T2DM患者100例,設為DM組;另同期招募健康志愿者100例,設為對照組。年齡20～65歲,同意提供糞便和血清標本,詢問相應病史癥狀,完善相關檢查,研究對象均自愿簽署由我院倫理委員會批準的知情同意書及相關文件。研究經新疆維吾爾自治區婦幼保健院倫理委員會審批通過(K-2021052)。納入標準:(1)病例組:首次診斷為T2DM患者[6];年齡20～65歲;符合其他各項健康體檢指標;(2)對照組:排除糖尿病的健康志愿者;年齡、性別、民族與病例組相匹配;符合各項健康體檢指標。排除標準:(1)血液系統,中樞神經系統疾病、風濕活動、自身免疫性疾病;(2)急、慢性消化道感染,慢性腹瀉、便秘、消化道潰瘍活動期及愈合期、炎癥性腸病、腸易激綜合征、腸結核、消化道腫瘤及其他惡性腫瘤者;(3)伴有嚴重的心、肝、腎功能不全,代謝性疾病以及其他嚴重疾病者;(4)近1個月內使用過抗生素,抑酸、胃動力藥物、微生態調節劑、糖皮質激素及免疫抑制劑使用者;(5)最近1個月內發生過腹瀉,行胃腸道手術或行胃腸鏡檢查者;(6)最近1個月內突然的生活環境和飲食結構的改變;(7)營養不良、免疫系統缺陷或先天性遺傳代謝病;(8)有精神病史,服用鎮靜催眠藥、濫用藥物。兩組患者一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05),見表1。

表1 兩組患者一般資料比較

1.2 方法

1.2.1 糞便樣本獲取 采集糞便樣本前囑患者排空尿液,無菌糞便收集器收集患者新鮮糞便,而后立即放入-80℃冰箱中保存備用。

1.2.2 糞便DNA提取及實時熒光定量PCR檢測 采用16S rRNA測序方法檢測患者的腸道菌群特征,使用E.Z.N.A.?Stool DNA試劑盒(生產廠家:美國Omega公司;貨號: D4015-01)提取微生物DNA,并保存在-20℃,使用以下聚合酶鏈式反應(PCR)引物擴增細菌16S核糖體RNA基因的V3-V4區: 5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′(正向)和5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′(反向)。PCR擴增使用TransStart?FastPfu聚合酶系統,反應混合物(包括5 × FastPfu Buffer 4 μL,dNTPs(2.5 mmol/L)2 μL,每個引物(5 μmol/L) 0.8 μL, FastPfu聚合酶0.4 μL,模板DNA 10 ng)在95℃初始變性2 min,然后進行25個循環,分別為95℃ 30 s, 55℃ 30 s,72℃ 30 s,最終延伸時間為72℃ 10 min。使用Silva 參考數據庫預先訓練的樸素貝葉斯算法分類器對菌群物種進行注釋,去掉注釋為線粒體、古生物、真核生物的序列,在QIIME2平臺計算樣本α多樣性:包括菌群豐度指標(包括Chao1值和ACE值,其值越大表示物種總數越多)和菌群多樣性(包括Shannon值和Simpson指數,Shannon值越大、Simpson指數越小群落表示菌群多樣性越高);計算利用樣本間基于 Bray-Curtis 距離的 β 多樣性指標。

1.3 血液樣本采集及代謝譜分析

1.3.1 血液樣本采集 所有對象采集隔夜空腹外周靜脈血5 mL,置于EDTA抗凝管中,室溫靜置1 h后離心(3 000 r/min,離心15 min),靜置后取上層血清立即放入-80℃冰箱中保存備用。

1.3.2 GC-MS色譜分析 取同一受檢溶液連續進樣6次,進行色譜柱檢測,色譜峰個數和相對峰面積RSD<5%,提示儀器精密度良好。采用脈沖式進樣,溫度為290℃,以氦氣為載體,流速為1 mL/min,進樣量為1 μL,升溫程度設置為初始溫度45℃,維持2 min,然后以9℃/min的梯度升高到180℃,再以40℃/min的梯度升高到240℃,維持12 min,在1 min內升高到280℃,維持2 min。每次分析前均需要等待6 min平衡色譜柱。采用超高效液相色譜-飛行時間質譜聯用技術檢測血清代謝小分子,將原始數據文件導入到Progenesis QI(Version 2.0, Waters, Milford, MA, USA)軟件;經 Progenesis QI預處理的數據矩陣可直接導入具有擴展統計功能的EZInfo3.0軟件(Waters, Milford, MA, USA)進行多元統計分析,從而篩選密切相關的血清差異表達代謝物。

1.4 代謝通路分析 (1)腸道菌群代謝通路分析:分析前先將代謝物濃度進行標準化處理后,將處理后的數據導入SIMCA-P 14.1 軟件進行組間代謝物差異分析,得出有差異的代謝物后基于KEGG數據庫,通過R語言包進行通路分析。(2)血清代謝通路分析:將在正負離子模式下鑒定的血清差異代謝物導入Metabo Analyst軟件進行代謝通路分析。

1.5 統計學方法 計量資料以均數±標準差表示,組間兩兩比較采用t檢驗?；诜诸悓W信息和多變量統計方法可對兩組樣本的菌群結構組成及物種差異等進行分析,采用SPSS 19.0軟件與R軟件進行統計分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組腸道菌群多樣性比較 腸道菌群α多樣性方面,DM組Chao指數、Ace指數、Shannon指數低于對照組,Simpson指數高于對照組,差異有統計學意義(P<0.05);兩組腸道菌群β多樣性差異有統計學意義(P<0.05),見表2、圖1。

圖1 兩組腸道菌群β多樣性比較

表2 兩組腸道菌群α多樣性比較

2.2 兩組腸道菌群結構比較 16S rRNA高通量測序后經過LEfSe分析顯示,DM組患者腸道菌群中以腸球菌屬(Enterococcus)、梭菌屬(Clostridioides)、糞桿菌屬(Faecalibacterium)、放線菌屬(Actinomyces)、埃希菌屬(Escherichia)、伊格爾茲菌屬(Eggerthella)、安德克菌屬(Adlercreutzia)占主要優勢;對照組腸道菌群中以擬桿菌門(Bacteroidetes)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、副桿菌屬(Parabacteroides)、普雷沃菌(Prevotella)、甲烷短桿菌屬(Methanobrevibacter)、二十碳孢梭菌屬(Erysipelatoclostridium)占主要優勢,見圖2。

圖2 兩組患者糞便菌群LDA值分布柱狀圖

2.3 兩組血清代謝標志物比較 基于偏最小二乘法判別分析模型(PLS-DA)模型,鑒別了10個代謝物,進行了相對濃度單維上的變化情況分析,結果顯示:DM組乳酸、亞油酸、棕櫚酸、油酸水平高于對照組,L-丙氨酸、L-纈氨酸、絡氨酸水平低于對照組,差異有統計學意義(P<0.05),見表3。

表3 兩組血清代謝標志物水平比較單維相對濃度

2.4 腸道菌群和代謝標志物的代謝通路分析比較 PICRUSt工具對腸道差異菌群進行基因功能通路預測顯示,差異菌屬可獲得三個代謝通路信息,分別是其他次級代謝產物的合成、脂質代謝、碳水化合物代謝;分析血清差異代謝物涉及的代謝通路顯示,共有9條差異通路,其中涉及脂質代謝的通路最多;比較兩種代謝通路,脂肪酸的生物合成通路為腸道菌群和血清代謝物的共有代謝通路。見圖3。

圖3 腸道菌群和代謝標志物的代謝通路分析比較

3 討論

近年來隨著人們對腸道菌群的認識不斷加深,腸道菌群已經不再被認為是一個“閑置器官”,其復雜的微生態系統對于調節機體能量代謝、免疫功能及腸道黏膜完整性具有重要作用[7]。研究發現[8-9],腸道菌群通過參與膽汁酸代謝、膽堿代謝及生物拮抗作用參與機體糖脂代謝、細胞代謝及抵抗外來微生物定植和增殖。大量研究表明[10-11],腸道菌群功能失調與許多自身免疫性疾病、代謝性疾病、腫瘤及糖尿病并發癥的發生有關。DM作為影響國人身體健康和生命安全的全身綜合代謝性疾病,深入了解DM患者的腸道菌群特征,能夠為DM的預防和干預提供新的治療靶點。

研究顯示[12],T2DM患者腸道菌群濃度更高,且結構及功能也與血糖正常人群不同,DM前期患者在菌屬水平上,梭菌豐度顯著下降,而薩特菌屬及鏈球菌屬豐度顯著增加。本研究結果顯示,DM組腸道菌群豐度和菌群多樣性均優于對照組,且DM組以腸球菌、梭球菌屬為主,對照組以擬桿菌屬、乳桿菌屬和雙歧桿菌屬為主,與目前研究相一致。分析認為:腸道菌群原有的生態平衡一旦被打破,機體的能量代謝、免疫功能及抵抗外來微生物入侵的能力將會受到影響。擬桿菌屬、雙歧桿菌屬在腸道內能夠產生一種名為丁酸的成分,可以為結腸上皮細胞提供能量,提高腸上皮細胞的完整性[13],且擬桿菌水平于體內內毒素水平呈負相關,擬桿菌水平較低的患者機體炎癥反應程度越重[14]。當DM患者擬桿菌水平下降,腸道完整性丟失,炎癥反應加重,而目前研究認為慢性炎癥與DM發生相關[15]。短鏈脂肪酸作為腸道菌群特別是乳酸桿菌的主要代謝產物,被證實具有調節固有免疫和維持腸道黏膜屏障完整性的作用。短鏈脂肪酸能夠通過抑制IL-12的產生,進而抑制促炎因子TNF-α和IL-1β引起的抗炎作用,在減輕DM導致的機體微炎癥狀態具有積極效果。此外,腸球菌水平與DM患者空腹血糖水平呈正相關[16],腸球菌數量的增加與DM血糖水平及DM并發癥的發生存在重疊效應[17],但目前關于此方面的研究尚無明確結論。

在代謝組學方面,DM組與對照組在多項血清代謝指標方面存在差異,表明DM的糖脂代謝、氨基酸代謝途徑進發生了不同程度的紊亂。DM及其并發癥作為代謝組學研究中最重要的疾病之一,近年來有學者對DM的代謝譜做了進一步分析發現,T2DM患者在脂肪酸類代謝譜和血漿磷脂類代謝譜中與正常人群存在顯著差異[18]。在本研究中我們對DM存在差異的代謝指標進行了代謝通路分析并與腸道菌群的代謝通路進行對比后發現,脂肪酸的生物合成通路為腸道菌群和血清代謝物的共有代謝通路。人體的代謝主要是由機體自身基因組和微生物基因組調節的代謝共同組成,腸道菌群中定植的細菌在分解宿主無法分解的物質同時還可參與宿主自身的物質代謝[19]。在DM患者中脂質代謝通路作為腸道菌群代謝和宿主自身代謝的共同通路均發生了不同程度的紊亂,筆者猜想腸道菌群可能通過影響DM患者脂質代謝來干預DM的發生發展。一項研究指出[20],腸道菌群中的某些微生物可以通過其代謝產物來介導某些神經遞質的產生,還可通過調節胃腸激素如血清素、饑餓素、胰高血糖素等的分泌,參與宿主神經系統和內分泌系統的調節。而近期一項研究[21]顯示,紅蕓豆多糖可通過調節腸道菌群及脂質代謝減輕T2DM大鼠血糖及血脂,而腸道菌群參與機體脂質代謝,提示腸道菌群可能通過影響脂質代謝從而影響患者血糖。

綜上所述,T2DM患者存在腸道菌群失調,腸球菌屬、梭菌屬、糞桿菌屬含量增多,擬桿菌屬、乳酸桿菌和雙歧桿菌屬含量減少;且T2DM患者和健康人群的代謝指標存在差異,腸道菌群可能通過影響脂質代謝來影響T2DM的發展。但本研究限于樣本量較小,后期還需增大樣本量進一步論證;另外,本研究對于代謝組學方面的研究還不夠深入,腸道菌群影響T2DM的代謝機制還需進一步深入研究。

利益相關聲明:本文所有作者聲明無利益沖突。

作者貢獻說明:研究設計和論文寫作為阿孜古麗·買合買提,研究方案執行與實施為米日古麗·吾木哈斯木、李雪梅和塞娜瓦爾·阿西木,數據統計分析及論文修改為穆葉斯爾·哈斯木,查文獻和病例資料的整理為阿孜古麗·買合買提和穆葉斯爾·哈斯木。