康復新液對糖尿病難愈合創面中AGEs、RAGE及HIF-1表達水平的影響

徐晶晶, 童世紅, 舒國斌, 周瑜, 戴曉燕, 王斌

寧波市北侖區人民醫院 1皮膚科, 2造口傷口護理門診, 3檢驗科, 4門診輸液室, 5內分泌科(浙江寧波 315800)

糖尿病創面難愈合(糖尿病足)是糖尿病患者的主要并發癥之一,具有發生機制復雜、治療成本高及療效差等特點,容易引發截肢風險。炎性細胞、細胞因子及修復細胞等多種因素都參與糖尿病創面的愈合過程[1-3]。晚期糖基化終末產物(advanced glycation end products, AGEs)是體內部分過剩的葡萄糖與游離氨基結合形成的終末產物[4],主要來源于持續的高血糖。它可以與其受體(receptor for advanced glycation end product, RAGE)相互作用,觸發氧化應激,繼而引發血管炎癥[5]。缺氧誘導因子-1(hypoxia-inducible factor-1, HIF-1)是氧化應激反應中的重要調節因子,能改善組織缺血、缺氧。創面中HIF-1減少伴隨血管內皮生長因子(VEGF)的表達下調,會影響糖尿病足創面的發展[6-7]。多項研究證實,AGEs/RAGE通路和HIF-1都與糖尿病足潰瘍的愈合和新血管的生成密切相關[8-10],但在糖尿病創面難愈合中AGEs/RAGE通路和HIF-1之間的關系尚不明確。因此,本研究通過觀察糖尿病足患者用藥后不同時間創面組織羥脯氨酸含量和AGEs、RAGE、HIF-1α蛋白表達的變化,研究糖尿病難愈合創面中HIF-1α的表達是否與AGEs/RAGE通路相關;通過AGE抑制劑吡哆胺干預人皮膚微血管內皮細胞(human dermal microvascular endothelial cells, HMVECs),初步探討糖尿病難愈合創面中AGEs/RAGE通路與HIF-1是否有關,為臨床精準治療糖尿病難愈合創面提供科學依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020年1—12月寧波市北侖區人民醫院收治的10例糖尿病足患者,年齡40～70歲,均符合《中國2型糖尿病防治指南(2017版)》[11]西醫診斷標準。入組前均在內分泌科接受血糖控制,治療期間監測血糖,達到血糖控制目標(血糖控制目標,空腹≤7.0 mmol/L,餐后2 h≤10.0 mmol/L),糖尿病足分級按照Wagner分級,其中1級2例,2級8例,8例患者均給予哌拉西林他唑巴坦鈉針 4.5 g 靜脈滴注 1次/d,抗炎治療,期間炎癥指標控制達標,相關數據見表1。本研究方案經寧波市北侖區人民醫院倫理委員會審核通過[批件號:2019科審第(22)號],患者及家屬知情同意;排除條件:近1個月內服用研究相關藥物、創面死腔形成、免疫系統疾病、研究藥物過敏、肝腎功能障礙、臨床資料不全等。

表1 入選患者臨床數據

1.2 藥品與試劑 HMVECs(上海致備生物科技有限公司,ZB064)、吡哆胺(Merck,P9380)、人血清白蛋白(Sigma, SRP6182)、Hyp/Hydroxyproline ELISA Kit (LifeSpan BioSciences,LS-F13017)、BCA蛋白定量試劑盒(Solarbio,pc0020)、AGE抗體(Abcam,ab176173)、RAGE抗體(Affinity,DF6405)、HIF-1α抗體(Affinity,DF6405)、β-actin抗體(Affinity,AF7018)。

1.3 主要儀器 酶標儀(MD,CMaxPlus)、低溫高速離心機(美國Thermo,Micro17R)、正置光學顯微鏡(日本尼康,E100)、化學發光儀(上海勤翔,610020-9Q)。

1.4 治療方法及創面難愈的判定 參考《糖尿病足介入綜合診治臨床指南(第五版)》[12]治療所有患者,積極處理創面,對肉眼可見的感染壞死組織及無活力組織進行徹底清創,直至暴露健康、滲血的軟組織,用碘伏消毒后,根據創面大小外用適量康復新液(國藥準字z51021834;四川好醫生攀西制藥有限公司)濕敷并包扎,1次/d,連用4周。在用藥0、7、14、28 d觀察患者創面滲出物、肉芽組織及上皮生長情況,對治療效果進行評估[13]并計算治療有效率。無效:創面縮小< 25%,且肉芽生長很少,臨床癥狀無改善;好轉:創面縮小≥25%,但<75%,肉芽組織較新鮮,臨床癥狀改善;顯效:創面縮小≥75%,肉芽組織新鮮,臨床癥狀緩解;痊愈:創面上皮完全覆蓋,質地堅實,臨床癥狀、體征基本消失。有效率(%)=(n痊愈+n顯效+n好轉) /n總×100%。

1.5 ELISA檢測患者創面肉芽組織中羥脯氨酸的水平的變化 在外用藥0、7、14、28 d時先后用生理鹽水棉球和干棉球輕拭創面,再用眼科剪從創面中央區域取一塊肉芽(深度以創面出血為度,大小約0.3 cm×0.3 cm),存放在-80 ℃冰箱備用。如果創面已經愈合,則不再取材進行測試。取出樣本恢復至室溫,加PBS制成勻漿,以2 000～3 000 r/min的速度離心20 min,嚴格按照ELISA試劑盒說明書的方法步驟,檢測上清液中羥脯氨酸的含量。

1.6 高級糖酵化終產物人血清白蛋白的制備(AGE-HSA) 在無菌條件下,將人血清白蛋白(human serum albumin, HAS, 300 μmol/L)與葡萄糖(165 mmol/L)在含有200 μmol/L吡多胺或不含吡哆胺的磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)孵育。加入疊氮化鈉(0.02%),以避免微生物污染。樣品在37℃下孵育28 d,用無菌的磷酸鹽緩沖液透析24 h,以去除溶液中游離的葡萄糖。制備的AGE-HAS和吡多胺+AGE-HSA儲存在-20℃處備用。

1.7 HMVECs培養及分組 HMVECs常規復蘇培養,待細胞長至90%融合后,無血清培養基饑餓2 h,然后按實驗分組進行給藥,即對照組、AGE-HSA組、吡多胺+AGE-HAS組。具體給藥如下:對照組:用含10%胎牛血清的DMEM正常培養;AGE-HSA組:用220 nmol/L的AGE-HSA處理HMVECs細胞,其他培養條件同對照組;吡多胺+AGE-HSA組:用220 nmol/L的吡多胺+AGE-HSA處理HMVECs細胞,其他培養條件同對照組。

1.8 Western blot檢測患者創面和HMVECs中AGEs、RAGE、HIF-1α蛋白的表達水平 用干凈的剪刀在冰上把創面組織剪碎,取100 mg與1 mL冷Lysis Buffer制成勻漿,冰上靜置裂解 15～30 min(提取細胞蛋白樣本時,加入RIPA裂解液冰上裂解30 min),4 ℃條件以12 000 r/min的速度離心5 min,BCA法測上清液蛋白濃度。樣本蛋白經變性、電泳、轉膜、封閉后,分別加入AGEs、RAGE、HIF-1α和β-actin抗體4 ℃孵育過夜,次日加入二抗室溫下孵育1 h,ECL化學發光儀顯影。利用Image J軟件對蛋白灰度值定量分析。

1.9 統計學方法 采用SPSS 19.0統計軟件進行單因素方差分析,所有數據以均值±標準差表示,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 給藥后不同時間點創面愈合情況的變化 患者在用藥后7、14、28 d,隨著用藥時間的增加,創面愈合情況逐漸改善,藥物治療有效率也呈逐漸升高趨勢。見表2。

表2 給藥后不同時間點患者創面愈合情況 例

2.2 給藥后不同時間點肉芽組織中羥脯氨酸水平的變化 與0 d比較,7、14、28 d患者肉芽組織中羥脯氨酸水平均顯著升高(P<0.01),且肉芽組織中羥脯氨酸水平28 d>14 d>7 d>0 d。見表3。

表3 不同時間患者肉芽組織中羥脯氨酸水平的變化

2.3 不同時間點創面組織中AGEs、RAGE、HIF-1α蛋白表達水平的變化 與0 d比較,用藥后7、14、28 d的創面組織中AGEs、RAGE、HIF-1α蛋白的表達水平均顯著降低(P<0.05,P<0.01)。其中用藥后28 d的創面組織中AGEs、RAGE、HIF-1α蛋白的表達水平最低(P<0.01)。見表4和圖1。

圖1 不同時間點創面組織中AGEs、RAGE、HIF-1α蛋白表達

表4 不同時間創面組織中AGEs、RAGE、HIF-1α蛋白表達水平的變化(n=10)

2.4 HMVECs中AGEs、RAGE、HIF-1α蛋白表達水平的變化 與對照組比較,AGE-HSA組的HMVECs中AGEs、RAGE、HIF-1α蛋白表達均顯著上調(P<0.01);與AGE-HSA組比較,吡多胺+AGE-HSA組HMVECs中AGEs、RAGE、HIF-1α蛋白的表達水平均明顯下調,差異有統計學意義(P<0.05,P<0.01)。見表5和圖2。

注:A:對照組;B:AGE-HAS組;C:吡多胺+AGE-HAS組圖2 HMVECs中AGEs、RAGE、HIF-1α蛋白表達

表5 HMVECs中AGEs、RAGE、HIF-1α蛋白表達水平的變化(n=10)

3 討論

糖尿病難愈合創面是糖尿病最具挑戰性的并發癥之一,致殘、致死率及治療費用都比較高,是國家醫療健康的一項重大挑戰[14]。盡管已有大量學者開展糖尿病創面愈合機制的研究,主要方向有信號通路、血管生成、糖基化終末產物等[15-16],但其具體機制仍不明確。本研究通過觀察糖尿病患者外用康復新液0、7、14、28 d時創面的愈合情況,同時檢測不同用藥時間后其肉芽組織中羥脯氨酸的含量變化及AGEs、RAGE、HIF-1α蛋白的表達情況,發現隨著用藥時間的增加,藥物有效率28 d>14 d>7 d>0 d,創面肉芽組織中羥脯氨酸的含量28 d>14 d>7 d>0 d,創面AGEs、RAGE、HIF-1α蛋白的表達水平0 d>7 d>14 d>28 d;與0 d比較,7、14、28 d的肉芽組織羥脯氨酸含量均顯著升高(P<0.01),7、14、28 d組的AGEs、RAGE、HIF-1α蛋白表達均顯著降低(P<0.01)。這表明創面中AGEs、RAGE、HIF-1α的表達水平和糖尿病難愈合創面的預后密切相關。

HIF-1α是HIF-1的一個亞基,對氧濃度敏感[17]。當脂肪組織形成低氧環境后,機體更容易分泌炎癥因子,引起HIF-1α升高,繼而促進VEGF 的表達,誘導血管生成[18]。動物研究結果顯示,上調HIF-1α表達,促進血管生成,能夠加快糖尿病大鼠模型的傷口愈合[19-20]。為了進一步探究AGEs/RAGE信號通路和HIF-1在糖尿病難愈合創面中的關系,本研究采用體外培養HMVECs,通過AGE抑制劑吡多胺預處理HMVECs。吡哆胺是AGEs的強抑制劑[21],可以通過俘獲低分子量的活性羰基前體,抑制糖基化中間產物轉變形成AGEs[22]。研究結果顯示,與對照組比較,AGE能顯著上調HMVECs中AGEs、RAGE、HIF-1α蛋白的表達(P<0.01),而吡多胺能顯著抑制這種上調作用(P<0.01)。這表明HMVECs中HIF-1α的表達可能與AGEs/RAGE信號通路的活化密切相關。

綜上所述,糖尿病難愈合創面的預后與其AGEs、RAGE、HIF-1α的表達水平密切相關,其中HIF-1α的表達可能與AGEs/RAGE信號通路的活化有關,這為臨床治療糖尿病難愈合創面提供新的思路和方向。但是現階段的研究尚不夠深入,樣本量較少,細胞實驗中未驗證康復新液的作用,未開展動物實驗進行驗證,AGEs/RAGE信號通路與HIF-1之間具體的調控機制仍不明確,我們將在今后的研究中進一步探討。

利益相關聲明:所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻說明:徐晶晶負責實驗設計、開展、論文撰寫;童世紅、舒國斌參與實驗的開展;周瑜、戴曉燕負責數據收集、分析;王斌負責實驗指導、論文修改。全體作者都閱讀并同意最終的論文。