動物疫病活載體疫苗研究進展

周凱鈺太，潘俊慧，王素春，禹蘭平，楊文靜，梁晚楓，孫福亮，王楷宬

（1. 中國動物衛生與流行病學中心，山東青島 266032；2. 延邊大學，吉林延吉 133000；3. 農業農村部動物生物安全風險預警及防控重點實驗室（南方），山東青島 266032）

人類日益增長的動物產品需求，致使畜禽疫病防控方式更為嚴苛。疫苗接種是預防和控制畜禽疫病最為有效且經濟的方法。畜禽接種的疫苗主要包括滅活疫苗和弱毒疫苗，但二者分別存在保護效力弱和毒力返強的問題。隨著DNA 重組技術以及反向遺傳及基因編輯等技術的不斷進步，研究人員的研究重點開始偏向于基因工程疫苗。其中，活載體疫苗（live vector vaccine，LVV）因生產成本低、保護力強、安全性能佳，可在載體上插入多個外源基因等優點，受到了研究學者的廣泛關注。本文分別對病毒和細菌活載體疫苗進行綜述。

1 病毒活載體疫苗

病毒活載體疫苗，是指將目的基因插入到病毒載體的非必需區，構建能表達相應抗原的重組病毒。目前用于構建病毒活載體疫苗的載體分為兩大類：一是DNA 病毒，如腺病毒（adeno virus，Adv）、 腺相關病毒（adeno-associated virus，AAV）和痘病毒等[1]；二是RNA 病毒，如新城疫病毒（NDV）、流感病毒等[2]。通過敲除病毒載體的非必需基因、突變編碼毒力基因等手段，可以增加病毒載體可插入片段的容量，保證其自身的生長特性、免疫原性及安全性。

1.1 腺病毒載體疫苗

第一代腺病毒載體是將復制基因E1或E3敲除，但在使用時需對其進行純化，否則將誘導機體產生嚴重的炎癥及免疫反應；第二代腺病毒載體是將表達DNA 結合蛋白的E2基因進行突變，使其在不適宜溫度范圍內不表達基因產物，但該方法可使病毒滴度急劇下降，不適用于動物疫病免疫；第三代腺病毒載體需要有輔助病毒和互補細胞系來包裝產生病毒顆粒，其僅保留約500 bp 的順式作用元件。根據能否復制，腺病毒載體還可分為復制型腺病毒和復制缺陷型腺病毒。復制型腺病毒的表達效率和免疫原性較高，而復制缺陷型腺病毒的安全性更高，因此復制缺陷型腺病毒應用范圍較廣。目前已有商品化載體及包裝系統可供選擇，如Ad-Easy 和Ad-Max 包裝系統。也可將流行腺病毒作為載體，將外源基因插入，進行多價苗制備，或在腺病毒載體上融合表達佐劑基因，提高疫苗免疫原性。近年來腺病毒載體疫苗部分相關研究進展情況見表1。

表1 腺病毒載體疫苗研究進展情況

腺病毒能在哺乳動物機體內誘導較強的體液免疫反應。腺病毒載體疫苗在豬病防控方向應用研究較多，如非洲豬瘟（ASF）、豬流行性腹瀉（PED）和豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）等。研究學者將表達非洲豬瘟病毒（ASFV）的B602L、B646L、CP204L、E183L、E199L、EP153R、F317L、MGF505-5R基因的重組腺病毒載體和重組牛痘病毒載體注射至豬體內，攻毒后，與對照組相比，重組腺病毒載體免疫組的胃、肝淋巴結病毒載量降低至1/1 000，而重組牛痘病毒載體免疫組的胃、肝淋巴結病毒載量降低至1/100[13]。研究學者使用Ad-Easy 包裝系統來表達ASFV p72 蛋白的重組腺病毒載體，試驗結果表明Ad5-ASFV-p72 復制缺陷型腺病毒可以有效表達P72 蛋白[14]。上述結果均表明，腺病毒載體具有開發商業化ASFV 疫苗的潛力。腺病毒載體在禽類疫病防控方面應用較少，多為AIV 方向的應用。研究早期多將AIV 的HA基因與腺病毒載體連接，進行病毒包裝?，F多將AIV相對保守的表位融合構建至腺病毒載體上。研究學者選擇AIV 相對保守的表位、M2 胞外結構域及部分HA 基因進行融合構建至腺病毒載體上[15]。關于反芻動物的腺病毒載體疫苗報道較為少見。在腺病毒載體上表達了口蹄疫病毒（FMDV）P1、3C 和VP2 蛋白，動物試驗結果顯示該重組腺病毒載體對口蹄疫具有廣泛保護作用[16]。研究人員利用重組腺病毒載體共表達鼠傷寒沙門氏桿菌鞭毛蛋白及狂犬病病毒的糖蛋白，進一步提高了對狂犬病病毒的保護效果[17]。

1.2 痘病毒載體疫苗

重組痘病毒是最早用于商品化的獸用活載體疫苗。痘病毒基因組大小為180～300 kb，由于其基因組過大且不具備感染性，無法通過反向遺傳的方式來進行重組病毒構建，目前主要通過同源重組的方式構建病毒載體，也有使用CRISPR/Cas9 技術來構建重組病毒。痘病毒載體在一些臨床研究中誘導的免疫應答及自身免疫原性較低，但可通過敲除痘病毒載體抑制宿主免疫應答的免疫調節基因，如細胞因子基因和細胞因子受體基因來解決這一問題。缺失痘苗病毒基因組中的細胞凋亡相關基因F1L、白介素18（IL-18）結合蛋白基因C12L或者Ⅰ型干擾素信號抑制基因C6L等，均能夠增強疫苗誘導的特異性應答水平，提高免疫細胞的數量、功能和持續時間[18]。近年痘病毒載體疫苗部分相關研究進展情況見表2。

表2 痘病毒載體疫苗研究進展情況

重組禽痘病毒疫苗的黏膜遞送能力優于重組DNA 疫苗或重組牛痘病毒疫苗，在接種后96 h 未檢測到活性病毒基因表達，且病毒僅感染初始疫苗接種部位，不會被傳播到脾臟或腸道等。目前，重組禽痘病毒多用于禽類疫病的疫苗開發。如研究人員將IBDVVP2基因插入到重組禽痘病毒載體上，發現該載體可對SPF 雞產生一定水平的保護作用[21]。也有研究將反芻動物外源基因插入禽痘病毒載體中，在小鼠和綿羊中評估了單獨表達VP2或VP2/VP5聯合表達的重組禽痘病毒載體，結果發現其可誘導產生更高水平的中和抗體[26]。還有研究將增強免疫效果的細胞因子基因（IL-18、IL-6、IFN II）與抗原基因同時插入載體中進行表達，以增強載體疫苗免疫效力[27-28]。反芻類動物疫苗研究中山羊痘病毒載體也常被應用，如利用山羊痘病毒載體特異性表達O 型FMDVVP1基因、PPRVF基因[29-30]。研究學者用山羊痘病毒載體表達布魯氏菌外膜蛋白OMP25，發現該重組病毒載體可特異性表達目的基因[31]。豬痘病毒載體也被應用于表達PRRSV 多表位肽、豬鏈球菌2 型保護性抗原[32-33]。

1.3 皰疹病毒活載體疫苗

皰疹病毒基因組大小約150 kb。皰疹病毒載體可持續刺激免疫系統，產生較高水平的保護性抗體，且可脫離細胞以凍干形式保存，實現長時間運輸。早期重組皰疹病毒構建是采用同源重組技術，但該技術不僅基因重組效率低，而且重組毒株和親本毒株難以分離，導致試驗周期長。目前主要通過人工染色體（BAC）感染性克隆構建重組皰疹病毒。也有方法通過構建病毒基因組Fosmid 文庫，在菌體中對病毒基因組進行改造，雖然該方法顯著提高了獲得病毒突變體的效率，但步驟復雜[34]。也可基于CRISPR/CAS9 系統構建重組皰疹病毒載體，從而進行特定位點的缺失或替換，但該方法實際操作困難且基因脫靶率高[35]。近年內皰疹病毒載體疫苗部分相關研究進展情況見表3。

表3 皰疹病毒載體疫苗的研究進展情況

火雞皰疹病毒（herpesvirus of turkey，HVT）是一種天然的非致病性α 皰疹病毒，其可作為最常用的皰疹活載體疫苗來表達外源基因及預防雞馬立克氏病。目前HVT 在禽類疫病方向應用較多，如可融合表達NDVHN、F基因，IBDVVP2、gB、gD基因[44-45]。有研究[46]將IBDV 的VP2基因插入HVT 基因組的4 個不同位點，構建出4 株重組病毒來評估不同位點與病毒誘導抗體能力之間的關系，通過試驗證明rHVT/IBD（UL45-46）具有較低的生長活性，可穩定引發高水平中和抗體，而rHVT/IBD（UL3-4）表現出中等的增殖特性，可誘導產生較高水平抗體。鴨瘟病毒（duck enteritis virus，DEV）常被用作水生家禽疫苗病毒載體。有研究人員通過構建DEV 疫苗株的Fosmid 文庫，在病毒感染性克隆的基礎上將DEV-I 型VP0基因和H5 亞型AIV 基因分別插入DEV 基因組中[47]。在豬病方面，研究學者利用同源重組技術構建共表達PEDV S 蛋白和豬輪狀病毒VP7 蛋白的PRV 三聯基因工程疫苗株，結果發現該重組株外源基因穩定存在；將ASFVCD2V基因插入基因缺失的PRV基因組中，經試驗證明了其遺傳穩定性、毒力、免疫原性和保護能力[48]。

1.4 NDV 載體疫苗

NDV 屬于單股負鏈不分節段的RNA 病毒，常用弱毒NDV 構建重組病毒載體表達外源基因。NDV 在反向遺傳操作系統中外源基因可插入位點靈活，但研究[49]證明外源基因插入位置越接近病毒基因組的3'末端則外源蛋白表達量越高，但對病毒復制的干擾也更強。研究[50]表明，NDVP基因和M基因之間的非編碼區是外源基因的最佳插入位置。NDV 載體疫苗可以通過飲水、滴鼻或點眼等方式進行免疫，與其他種類的病毒活載疫苗相比，免疫方式便利且成本較低。在反向遺傳系統操作中，負鏈RNA 病毒不同于正鏈RNA 病毒，其自身沒有感染性，因此需要NP 蛋白來幫助轉錄和復制。目前，構建成功的反向遺傳系統NDV 毒株有La Sota、V4-C、Beaudette C、Hitchner B1 等。NDV 載體疫苗部分相關研究進展如表4 所示。

表4 NDV 載體疫苗研究進展情況

在我國，2007 年第一個NDV 載體疫苗——禽流感、新城疫重組二聯活疫苗（rL-H5 株）獲得農業部注冊，并在臨床上得到廣泛應用。目前，NDV 載體多被用于禽類疫病防控，大多將AIV 的HA 基因插入NDV 載體上[56]。也有文獻[57]報道，利用NDV 載體表達IBDV VP2 蛋白和ILTV gD 蛋白，可產生一定的免疫原性。對反芻動物也可應用NDV 載體疫苗進行免疫。Liu 等[58]構建了表達中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV）S 蛋白的重組NDV，經在小鼠和雙峰駝中進行免疫原性評估發現，該重組病毒可誘導小鼠和駱駝產生MERSCoV 中和抗體。

1.5 其他動物病毒載體疫苗

有研究[59]構建了IBV 疫苗株反向遺傳系統，將相同血清型致病株M41、beaur 的S基因置換，結果發現該重組疫苗株能同時保護M41、beaur 株對被攻毒動物的攻擊。有研究[60]構建了PRRSV反向遺傳系統，發現所得重組病毒的毒性與親本毒株相似，并可同時表達豬瘟病毒C 株E2基因和PCV-2 ORF2 基因。有研究[61]構建了水泡性口炎病毒反向遺傳系統，并在此基礎上將AIV 的HA基因和艾滋病病毒（HIV）的Gag和Env基因插入該載體中獲得重組病毒，發現該重組病毒能特異性表達目的基因，且表達水平較高。除此之外，麻疹病毒、彈狀病毒、黃病毒等具有在宿主中高效復制的特點，因此在病毒載體疫苗領域中也受到了相應關注。

2 細菌活載體疫苗

細菌活載體是指利用基因編輯方法將細菌的毒力基因致弱或敲除，并將病原體的抗原基因整合到細菌基因組或插入到質粒中，獲得能表達目的基因的重組菌株。根據細菌載體的特性，將細菌載體分為減毒致病菌與非致病菌兩類。細菌活載體疫苗具有保護外源DNA 不被降解、操作流程簡單、培養方便、成本低、可誘導更高水平黏膜免疫等優點，同時也存在免疫效率不足和免疫抗原耐受的問題。用于細菌活載體疫苗的載體包括乳酸菌（Lactic acidbacteria）、沙門氏菌（Salmonella）等[62]。

2.1 乳酸菌活載體疫苗

乳酸菌屬于革蘭氏陽性菌，相比減毒疫苗和滅活疫苗，重組乳酸菌疫苗能夠遞呈抗原并誘導機體產生多種細胞因子，同時能夠在人體腸道中持續定殖，長期釋放特異性抗原蛋白引起機體免疫反應[63]。研究[64]構建的pValac 質粒，提高了乳酸菌向宿主細胞內部傳遞的效率，并能將其傳遞到豬腎細胞系內部。乳酸菌表達外源抗原主要有胞內、分泌和錨定3 種形式，多數研究認為錨定型重組菌能誘導機體產生更高水平的抗體。重組乳酸菌載體疫苗可以充當黏膜佐劑及抗原遞呈劑，可在呈遞目的基因的同時誘導機體產生IL-2 和IL-6，可提高重組載體黏膜給藥能力。但乳酸菌活載體疫苗也存在在機體存活時間短、抗原表達水平有限等問題。乳酸菌活載體疫苗部分相關研究進展見表5。

表5 乳酸菌載體疫苗研究進展情況

目前，乳酸菌載體在動物疫病防控中的應用較多。在豬病方面，有研究[70-71]構建了可特異性表達PEDV 抗原基因的重組乳酸菌載體，并利用蛋白錨定技術將蛋白錨定在菌體表面。大多數傳統的質粒遞送載體使用抗生素基因作為選擇性標記，這容易導致抗生素積累和基因污染。有研究[72]利用丙氨酸消旋酶基因代替抗生素基因進行篩選，并構建了表達PEDV 中和表位抗原基因的重組乳酸菌，將其注射至小鼠體內，發現可誘導小鼠體內IgG 水平升高。Shonela 等[73]構建了一株可特異性表達豬輪狀病毒VP7 抗原的重組乳酸菌，將其注射至小鼠體內，發現可誘導高水平滴度的抗體。有研究[74]構建了可特異性表達鵝細小病毒VP7基因的重組乳酸菌載體，將其注射至小鼠體內，發現可使機體產生免疫反應。在禽病防控方面，乳酸菌更多作為佐劑來增強疫苗效果。有研究[68]構建了可特異性表達雞IL-17B 基因的重組乳酸菌載體，經動物試驗發現，實驗組病毒載量明顯低于對照組。目前，重組乳酸菌載體在反芻動物疫病防控方面的研究較少，可能是由于反芻動物消化系統結構及功能復雜導致重組乳酸菌載體在機體上表達的目的蛋白水平較低。有研究[75]構建了可特異性表達牛流行性腹瀉病毒抗原基因的重組乳酸菌，將其經口遞送至小鼠體內，發現可誘導小鼠產生較高水平的免疫反應。但這兩項研究均未涉及牛的動物實驗，所以未知其實際保護效力。

2.2 沙門氏菌活載體疫苗

沙門氏菌屬于革蘭氏陰性菌。突變型傷寒桿菌和鼠傷寒桿菌自身無法產生毒素且可在宿主腸道內長時間存活，能夠誘導機體產生較高的免疫水平[76]?？诜抽T氏菌減毒活疫苗除可以誘導腸道上皮的局部免疫外，還可誘導全身體液免疫和細胞免疫，同時可減少有害物產生。但在研制口服沙門氏菌減毒活疫苗過程中，必須考慮其在機體中的停留時間，毒力過弱可能導致其在機體定殖時間過短，無法引發免疫反應，故現構建減毒沙門氏菌載體時，更傾向于構建自毀減毒沙門氏菌。乳酸菌活載體疫苗部分相關研究進展見表6。

表6 沙門氏菌載體疫苗研究進展情況

最早通過化學和紫外線照射方式使沙門氏菌毒力基因發生突變從而達到減毒效果，后來發現帶saoA基因的重組減毒腸炎沙門氏菌rSC0016 和rSC0012 株能夠引起機體較強的免疫反應，近幾年通過磷酸轉移酶系統發現ptsI和crr基因突變菌株在誘導黏膜免疫反應方面非常有效[81]。減毒沙門氏菌載體多用于動物細菌病防控。有研究[82]構建了重組減毒沙門氏菌載體，使其表達豬鏈球菌特異性抗原或在沙門氏菌內包裝病毒顆粒，以起到對該病原的保護作用。利用重組減毒沙門氏菌載體向小鼠體內遞送豬肺炎支原體P42 和P97 抗原，發現小鼠體內細胞因子水平升高，并能抵御毒株攻擊[83]。有研究[84]構建了表達布魯氏菌抗原（SodC、Omp19、BLS 和PrpA）的重組減毒沙門氏菌載體，發現其可抵御小鼠和山羊免于布魯氏菌的攻擊。利用減毒沙門氏菌載體表達銅綠假單胞菌外膜蛋白F1I2，將其經皮下接種和口服給藥后，發現皮下注射實現了更高的血清IgG 滴度和IgA 滴度[85]。減毒沙門氏菌載體在病毒病防控方向應用較少。利用重組減毒沙門氏菌載體向仔豬體內遞送豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）和PEDVS基因，可誘導仔豬產生較高水平的免疫應答反應[86]。

2.3 其他細菌活載體疫苗

大腸桿菌（Escherichiacoli）屬于革蘭氏陰性菌，其生長周期短，且重組質粒能穩定遺傳。如今已發現大腸桿菌有多個種類，部分大腸桿菌菌株對機體具有一定的益生效果，同時大腸桿菌能夠在機體腸道中定殖，進而刺激機體產生體液免疫反應[62]。近年來，有研究[87]構建了一株可特異性表達新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）抗原的重組大腸桿菌，可作為SARS-CoV-2 的候選疫苗株。Zhong等[88]證明重組枯草芽孢桿菌可以誘導機體產生局部的黏膜免疫、體液免疫和細胞免疫反應，可用于豬肺炎支原體感染的預防。

3 活載體疫苗抗原呈遞策略

活載體疫苗的載體種類和抗原呈遞方式會決定其外源蛋白的表達水平、安全性和免疫效果?？乖蔬f的途徑主要有MHC Ⅰ類和MHC Ⅱ類限制性抗原呈遞途徑。內抗原蛋白與抗原呈遞細胞結合，并與MHC Ⅰ/Ⅱ分子結合，展示于抗原呈遞細胞表面，誘導機體發生相應的免疫反應[89]?？乖蔬f細胞包括B 淋巴細胞、巨噬細胞、樹突細胞?；钶d體疫苗常用的抗原呈遞策略有載體-宿主平衡致死系統、微生物表面展示系統等。

3.1 載體-宿主平衡致死系統

構建載體-宿主平衡致死系統，首先要將編碼細菌生長繁殖的必需基因敲除，使細菌只能在特定添加某種營養物質的培養基中生存?？赏ㄟ^將含必需基因的質粒轉化進繁殖缺陷菌的方式，使其能夠在基礎培養基上正常繁殖，也可通過使用生長繁殖所需的必需基因代替抗生素基因，以有效避免抗生素污染，使重組細菌載體疫苗在機體中穩定繁殖并產生良好的免疫反應。通常對減毒細菌載體進行改造或敲除的基因為表達必須營養物質基因部分片段。目前，該系統已被應用于開發乳酸菌、沙門氏菌、單核增生李斯特菌、大腸桿菌等多價疫苗中。

3.2 微生物表面展示系統

微生物表面展示系統是將重組蛋白錨定到細菌表面，使外源抗原展示在微生物表面。利用該方法可使抗原呈遞水平比細胞質抗原呈遞水平更高[90]。在疫苗研究領域，應用的微生物表面展示系統主要包括細菌表面展示系統與桿狀病毒表面展示系統。

3.2.1 細菌表面展示系統 細菌表面展示系統是在原核表達系統的基礎上，利用跨膜結構域、脂蛋白錨定、共價連接或非共價連接方式等將外源蛋白與細菌表面蛋白錨定連接[90]。革蘭氏陽性菌的抗原呈遞方式不同于革蘭氏陰性菌。革蘭氏陽性菌細胞壁厚，存在的膜蛋白較少，外源蛋白錨定困難，因此不能直接采用表面呈現方法進行外源蛋白呈遞，而需要通過構建佐劑的方式使革蘭氏陽性菌能夠成功在其表面呈遞抗原。有研究[91]通過處理乳酸菌得到了細菌形狀的肽聚糖聚合體，它也被稱為革蘭氏陽性增強子基質（GEM），該結構缺乏細菌細胞壁成分和細胞質內物質，抗原可通過肽聚糖結合附著在GEM 顆粒表面。革蘭氏陰性菌細胞壁較薄，膜蛋白容易表露在其表面。目前已有研究[92]構建了一株減毒沙門氏菌，發現其外源蛋白可與自身轉運蛋白MisL 融合，因而提高了T 細胞對其免疫性的應答能力。

3.2.2 桿狀病毒表面展示系統 以細菌為載體的表面展示系統采用的是原核表達系統，該系統難以表達結構復雜的生物蛋白。而桿狀病毒表面展示系統屬于真核生物展示系統。該系統允許大片段外源基因插入，因而能有效地在病毒粒子表面展示外源蛋白，而且可以對外源蛋白進行糖基化加工和折疊等翻譯后修飾，尤其適合需進行特異的翻譯后加工才能有效折疊和具有生物活性的高等真核生物細胞表面蛋白和分泌蛋白的展示。在該系統中，桿狀病毒表面膜蛋白gp64 與外源蛋白融合，并在信號肽作用下轉運至質膜從而引起免疫反應[93]。

4 展望

目前，細菌活載體疫苗和病毒活載體疫苗作為主要的活載體疫苗種類，在預防疾病方面均有不同的優缺點，應根據實際情況選擇最優最適合的活載體疫苗種類，將其免疫效果發揮至最佳水平。同時，活載體疫苗抗體呈遞方式的進步，提高了目的抗原在機體中的呈遞效率，使其保護效力增強。盡管活載體疫苗在預防和控制動物疾病方面具有潛力，但仍需要進一步完善相關研究。通過對微生物載體基因組和遺傳特征的深入研究，可以開發出更安全、穩定和高效的活載體疫苗。此外，對抗原呈遞機制的深入研究非常重要。了解活載體疫苗如何誘導免疫反應，以及如何與宿主免疫系統相互作用，將有助于優化其設計，改進其效力。通過持續和完善的研究，不斷改進活載體疫苗的設計和應用，可更有效地預防和控制各種疾病。