3 種方法檢測禽網狀內皮組織增殖病毒人工感染雞胚孵化雛雞的帶毒比較

徐鳳霞，孫萬里，張亞文，常 爽，王一新，趙 鵬

（山東農業大學動物科技學院，山東泰安 271018）

禽網狀內皮組織增殖?。╮eticuloendotheliosis，RE） 是由禽網狀內皮組織增殖病病毒（reticuloendotheliosis virus，REV）感染引起的一種病毒性腫瘤病和免疫抑制性疾病，臨床主要表現為免疫抑制、致死性網狀細胞瘤以及生成慢性腫瘤等[1]。REV 的自然宿主有雞、火雞、鴨、鵝等禽類，其中火雞最易感染，實驗室常用雞作為研究宿主[2]。REV 極易引起低日齡禽類患病，導致患禽抵抗力下降，繼發其他細菌病或者病毒病。而成年禽類對REV 抵抗能力強，感染后一般不出現癥狀或僅出現一過性病毒血癥[3]。從REV 抗體陽性雞的肝脾組織中分離得到REV-C45 株后，我國研究學者在國內各個地區進行了流行病學調查，結果在多個地區檢測到REV[4-9]。目前，尚未有商品化生物制品或藥物來有效防控RE，同禽白血病等垂直傳播性疾病一樣，可考慮實施種源凈化等措施來控制該病。

REV 感染禽主要表現非特征性臨床癥狀，即便剖檢后肝臟、胸腺或法氏囊等器官出現特征性病變，仍然難以與其他免疫抑制病區分[10]，因此僅通過臨床表現及剖檢實現對REV 感染的鑒別診斷難度較大，需要通過實驗室檢測加以確診。垂直傳播是REV 最重要的傳播方式，通過特定時間和特定檢測技術及時發現并淘汰垂直傳播感染雞是開展REV 凈化的關鍵步驟。為此，本研究通過雞胚卵黃囊接種，人工構建了REV 垂直傳播感染SPF 雛雞模型，分別采集出殼后雞的胎糞/泄殖腔棉拭子和血液，比較病毒分離、RT-PCR 和熒光定量RTPCR 這3 種常用病原檢測技術在不同檢測節點的REV 陽性檢出率，以期為實施REV 種源凈化提供參考數據。

1 材料與方法

1.1 毒株與實驗動物

REV 野毒株LN1201 株，為2012 年山東農業大學實驗室從某父母代種雞場疑似患禽腫瘤病的雞血漿中分離得到，已完成全基因組測序（GenBank登錄號KU641115.1）。SPF 雞胚，購自山東濟南斯帕法斯家禽有限公司。接種REV 的雞胚孵化至21 日胚齡后，雞出殼飼養于山東農業大學SPF 實驗動物房內。

1.2 抗體與檢測試劑盒

REV 特異性單克隆抗體小鼠純化腹水11b118，由山東農業大學家禽腫瘤病和免疫抑制病研究室制備和保存，其效價為1:8 000；FITC 標記的羊抗鼠IgG 抗體（批號Q10328），購自北京全式金生物技術有限公司；病毒RNA 提取試劑盒（批號R68740200000I26V003），購自美國OMEGA 公司；Evo M-MLV 反轉錄試劑盒（批號A4A2926）和SYBR Green ProTaqHS 預混型qPCR 試劑盒II（批號A4A3047），購自湖南艾科瑞生物工程有限公司。

1.3 動物試驗設計

取50 枚SPF 雞胚，待孵化至6 胚齡時，經卵黃囊接種LN1201 株病毒液，接種劑量為1 500 TCID50/枚，作為卵黃囊感染組，代表REV 經雞胚垂直傳播感染；另取同胚齡SPF 雞胚10 枚接種等體積生理鹽水，正常孵化后作為空白對照組。孵化出殼后采集雛雞胎糞/泄殖腔棉拭子和抗凝血，接種DF-1 細胞進行病毒分離或提取核酸進行分子生物學檢測。

1.4 不同日齡雞胎糞/泄殖腔棉拭子及血液樣品的REV 分離

分別于雛雞出殼后1、7、14、21、28、35、42、49、56、63 及70 日齡時，對雞胚卵黃囊感染組和空白對照組無菌采集抗凝血及胎糞/泄殖腔棉拭子，對抗凝血3 000 ×g離心2 min 分離血漿，對胎糞/泄殖腔棉拭子渦旋混勻后取上清液，經0.22 μm 濾器過濾；將上述血漿及濾液無菌操作接種于DF-1細胞，維持7 d后以細胞固定液固定細胞，以REV 特異性單克隆抗體11b118 作為第一抗體，FITC 標記的羊抗鼠IgG 作為第二抗體，通過間接免疫熒光法（IFA）檢測各組的REV 病毒血癥及胎糞/泄殖腔棉拭子REV 分離率，觀察試驗結果并記錄陽性率。

1.5 不同方法檢測各節點REV 核酸

根據GenBank 上已發表的REV 全基因組序列，使用Primer 6.0 軟件設計針對REVpol基因的引物用于檢測樣品的RNA，引物序列見表1。參照OMEGA viral RNA 提取試劑盒使用說明，從胎糞/泄殖腔棉拭子和抗凝血樣品中提取核酸后進行RT-PCR 檢測。熒光定量RT-PCR 檢測，按照艾科瑞生物工程有限公司SYBR Green ProTaqHS 預混型qPCR 試劑盒II 說明書，用優化好的反應條件，在羅氏熒光定量PCR 儀上進行SYBR Green 實時熒光定量PCR 擴增。

表1 用于檢測REV 的引物

2 結果與分析

2.1 不同方法檢測1 日齡雛雞血漿及胎糞REV 陽性檢出率比較

接種REV 的雞胚共孵出雛雞25 只，另外25只雞胚孵化期間出現死胚或雞胚破殼力不足致小雞不出殼且剝開有血，死亡時間集中在17～20 胚齡。如表2 所示，對卵黃囊感染組1 日齡出殼的SPF雞血漿進行檢測，發現熒光定量RT-PCR 檢出率最高（100%，25/25），其他依次為病毒分離（96%，24/25）、RT-PCR（36%，9/25）；對卵黃囊感染組1 日齡出殼的SPF 雞胎糞進行檢測，發現3 種方法的陽性檢出率均低于血漿?？梢钥闯?，對于1日齡雛雞血漿，熒光定量RT-PCR 和病毒分離用于凈化時檢測REV 垂直傳播的效果俱佳。

表2 1 日齡雛雞血漿及胎糞抗原檢測與病毒分離結果

2.2 不同方法對不同日齡雞血漿的REV 動態檢測

各組于7～70 日齡每隔1 周無菌采集抗凝血，分別采用細胞病毒分離、RT-PCR 以及熒光定量RT-PCR 檢測REV，比較不同方法的陽性檢出率。如表3 所示：不管采用何種檢測方法，空白對照組血液中始終未分離到REV 或檢測到REV 核酸，表明空白對照組SPF 雞始終保持REV 陰性，并且各檢測方法特異性良好。卵黃囊感染組血液的病毒分離陽性檢出率從7 日齡時的89%很快升至100%，并且在隨后的監測周期內基本保持100%，表明REV 通過垂直傳播容易形成持續性病毒血癥；熒光定量RT-PCR 的陽性檢出率在監測周期內始終保持100%；普通RT-PCR 的陽性檢出率顯著較低，最高時僅為67%，可能造成漏檢。上述結果與1日齡雛雞血漿及胎糞REV 的檢測總體一致。

表3 不同檢測方法對7～70 日齡雞血漿的REV 動態陽性檢出率 單位：%

2.3 不同方法對不同日齡雞泄殖腔棉拭子的REV動態檢測

如表4 所示：與雛雞血液的動態檢測結果總體一致，空白對照組泄殖腔棉拭子始終未分離到REV 或檢測到REV 核酸，表明空白對照組雞群始終保持陰性，且檢測方法特異性較好。整個試驗期間，卵黃囊感染組試驗雞均持續不斷通過糞便向外排毒，7 日齡時，病毒分離、RT-PCR 以及熒光定量RT-PCR 均能從泄殖腔棉拭子中檢測到REV，但不同時期3 種檢測技術對泄殖腔棉拭子的陽性檢出率動態規律與血液并非完全一致。有時泄殖腔棉拭子REV 陽性檢出率低于同時期血液，如7 日齡時泄殖腔棉拭子和血液經RT-PCR 檢測陽性檢出率分別為21%和32%；有時高于同時期血液，如70日齡時分別為100%和40%。但結合病毒分離及熒光定量RT-PCR 數據，發現血液中的REV 陽性檢出率總體上高于糞便。由此表明，REV 在血液和糞便中的帶毒排毒并非完全一致，因此為提高凈化檢測效率，在進行實際病原監測時不能只依賴一種檢測方法或樣本。

表4 不同檢測方法7～70 日齡雞泄殖腔拭子的REV 動態陽性檢出率 單位：%

3 討論

REV 是雞群中一種常見的垂直傳播性免疫抑制病毒，可引發腫瘤和免疫抑制，嚴重危害養禽業[11-12]。REV 與禽白血病病毒（avian Leukosis virus，ALV）有很多相似性，它們同屬于逆轉錄病毒、免疫抑制性病毒，均可以垂直傳播。目前，對于禽白血病，主要實施種源凈化加以控制。種源禽白血病凈化依賴于摸清ALV 排毒規律，需要通過研究和比較可靠的檢測樣品和方法實施凈化淘汰[13-15]。

在實施禽白血病凈化檢測時，出殼雛雞的胎糞檢測是實施凈化的重要步驟，目前最簡單快速的初篩方法就是采集出殼雛雞胎糞進行ALV 群特異性衣殼蛋白27（p27）抗原檢測，以此首先檢測出經垂直傳播感染帶毒的雛雞，這一檢測步驟對于盡可能早地檢出和淘汰ALV 陽性雛雞，最大程度降低垂直傳播及其帶來的早期水平傳播極為重要[16-17]。參照這一重要步驟，本研究通過雞胚卵黃囊接種人工構建了REV 垂直傳播感染雛雞模型，待雞出殼后分別采集胎糞/泄殖腔棉拭子和血液，使用病毒分離、RT-PCR 和熒光定量RT-PCR 這3 種病原學檢測方法進行檢測，發現不管是檢測胎糞/泄殖腔棉拭子還是血液，3 種方法檢測結果均可很好地顯示出REV 垂直傳播感染的特性，但不同樣品和不同方法陽性檢出率有差異。如：熒光定量RT-PCR檢測1 日齡雛雞血液REV 陽性檢出率達到100%，檢出率最高；細胞病毒分離的陽性檢出率始終較高，不管是胎糞/泄殖腔棉拭子還是血液，檢出率與熒光定量RT-PCR 檢測基本接近。

不管是REV 還是ALV，通過雞胚垂直傳播時容易形成持續性病毒血癥。7～70 日齡連續的抗凝血檢測結果也進一步證實了這一點，熒光定量RTPCR 檢測REV 陽性檢出率始終為100%，多數時間點細胞病毒分離的REV 陽性檢出率也為100%。通過兩種檢測方法檢出率對比，發現各檢測時間點的胎糞/泄殖腔棉拭子REV 檢出規律與雛雞血液總體一致，熒光定量RT-PCR 和病毒分離對胎糞/泄殖腔棉拭子的REV 檢出率始終不高于血液，特別是在前三周齡內。在實施REV 凈化時，熒光定量RT-PCR 比病毒分離具有更為明顯優勢：首先，在試驗人員的操作要求方面，病毒分離試驗中涉及的細胞培養、血漿分離、血漿接種細胞等均需無菌操作，而熒光定量RT-PCR 操作相對簡便，能夠使雞場及時發現隱性感染雞，盡早淘汰患病母雞，從而減少經濟損失；其次，由于REV 接種DF-1 細胞并不能產生明顯的細胞病變，因此需要結合IFA才能完成對REV 的檢測，導致傳統的病毒分離方法容易受到IFA 試驗中單抗及二抗質量的影響，而熒光定量RT-PCR 只需通過特定引物或探針對核酸進行擴增，可明確檢出結果，避免漏檢；最后，熒光定量RT-PCR 可同時檢測多個樣本，極大提高了檢測效率。

試驗結果同時表明，對糞便進行REV 核酸檢測雖然可以簡便而有效檢出感染和攜帶REV的雞，但檢出率低于血液，造成糞便檢出率較低的原因一部分可能是由于血漿從分離到接種一直是無菌操作，而糞便樣本相比于血漿成分復雜，必須使用濾器過濾后才可接種細胞，且溫度對REV 的影響較大，糞便樣本無菌處理極有可能導致部分病毒死亡，因此在實施凈化時要結合血液檢測才能更好地全面檢出所有感染的雛雞。

綜上，本研究在構建了REV 垂直傳播感染模型基礎上，比較了病毒分離、RT-PCR 和熒光定量RT-PCR 對各時間點血液和胎糞/泄殖腔棉拭子樣品的REV 陽性檢出率，這些規律為未來制定科學的種雞REV 凈化程序奠定了基礎。