納米孔測序技術對一份禽流感病毒陽性樣品的分子溯源

高志強，汪 琳，劉 環，白子龍，趙相鵬，蒲 靜，張 偉

（中國海關科學技術研究中心，北京 100026）

禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）屬于正黏病毒科A 型流感病毒屬，是唯一能感染禽鳥的正黏病毒。A 型流感病毒可感染多種禽鳥，而水禽是其主要貯存宿主。目前已發現AIV 有18種血凝素（haemagglutinin，HA）亞型和9 種神經氨酸酶（neuraminidase，NA）亞型。迄今為止，自然發生的高致病性禽流感疫情均由H5 或H7 亞型AIV 引起。而禽類中廣泛存在的低致病性H5 或H7 亞型AIV 可因基因突變而轉變為高致病性毒株，而且很可能發生外溢，跨種感染人類和哺乳動物，一直備受關注[1]。

在對AIV 進行檢測和分子流行病學調查時，檢測的時效性和準確性缺一不可，特別是在疫情暴發時進行分子溯源和快速全基因組測序，對于疫情控制起著至關重要的作用。常規的禽流感分子流行病學調查需要進行病毒分離鑒定，通過RT-PCR擴增各基因片段并進行Sanger 測序，或者通過以Illumina 平臺為主的二代建庫測序[2-3]?；诓《痉蛛x后進行的全基因組測序，對生物安全條件要求較高，往往需要生物安全三級以上條件；同時一、二代測序技術讀長短，測序時間長，文庫制備和數據處理復雜，因此測序時間較長，常常需要2～3 周甚至更長時間。近年來，納米孔測序技術憑借其操作簡便、長讀長，以及快速和實時讀取測序數據的優勢，在病原測序領域廣受青睞[4-5]。針對樣品中的病原體，采用“疊瓦式”靶向富集技術，可實現低豐度病毒的快速全基因組測序[6]；進一步采用滅活型采樣技術，可以降低AIV 分子溯源的生物安全風險，極大提高AIV 分子溯源的便利性。

本研究選取實驗室保存的AIV 核酸陽性滅活拭子樣品，提取病毒基因組，應用靶向引物池對病毒全基因組進行富集后，使用納米孔測序技術進行快速測序，在6 h 內獲得了樣品中病毒的全基因組序列，經序列分析比對，表明其為H5N5 亞型AIV，序列覆蓋度為96.44%，是一種基因重配病毒。本研究首次采用靶向納米孔測序技術直接進行拭子樣品中AIV 的全基因組測序，為口岸動物及產品的精準檢測提供了新的可靠方法。

1 材料和方法

1.1 被檢樣品

滅活AIV 核酸陽性鴨泄殖腔拭子樣品，來自某鴨場送檢，由本實驗室保存。

1.2 主要試劑

病毒基因組DNA/RNA 提取試劑盒（DP3165），購自天根生化科技有限公司；A 型流感病毒全基因組靶向捕獲試劑盒（BK-WIFA024），連接法測序多樣本DNA 建庫輔助試劑盒（BK-AUX024），購自杭州柏熠科技有限公司；連接測序試劑盒（SQK-LSK110）、無擴增條形碼擴展試劑盒（EXP-NBD104），芯片清洗試劑盒（EXP-WSH004），Spot-ON Flow Cell 測序芯片（FLO-MIN106D），均購自NANOPORE 公司；M-MLV 反轉錄酶、RNA 酶抑制劑，購自Promega 公司；HSTaqDNA聚合酶、dNTP 等，購自TaKaRa 公司；引物及雙標記探針，均委托生工生物工程（上海）股份有限公合成。

1.3 主要設備

Qubit Flex 熒光計、QuantStudio 5 熒光定量PCR 儀，為Thermo Fisher 公司產品；GridIONx5納米孔測序儀，為NANOPORE 公司產品。

1.4 核酸提取

測序當天，充分振蕩拭子樣品，然后吸取200 μL 使用商品化病毒基因組DNA/RNA 提取試劑盒提取核酸，洗脫于60 μL 無核酸酶水中，4 ℃保存備用。

1.5 熒光RT-PCR 檢測

依據國家標準GB/T 27539—2011[7]合成引物探針，配制反應體系，進行A 型流感病毒通用熒光RT-PCR 檢測，確定Ct 值范圍。

1.6 A 型流感病毒全基因組靶向捕獲

使用Qubit Flex 熒光計測定核酸濃度后，應用A 型流感病毒全基因組靶向捕獲試劑盒，按照操作說明進行全基因組序列的靶向捕獲。

1.7 AIV Nanopore 文庫構建

首先將約300 ng 捕獲產物使用連接法測序多樣本DNA 建庫輔助試劑盒，按照說明進行末端修復，修復后使用試劑盒中的配套磁珠純化試劑純化產物，應用無擴增條形碼擴展試劑盒中的NB01 和NB02 條形碼，按照說明分別對純化產物進行條形碼連接；連接結束后，使用試劑盒中配套磁珠純化試劑純化產物，將NB01 和NB02 兩管產物混合后連接Adapter，反應結束后再次使用試劑盒中配套磁珠純化試劑純化產物，即為構建的文庫。

1.8 測序及芯片清洗

按照操作說明將試劑盒中Flush Tether 和Flush Buffer 混合均勻，制備成測序芯片緩沖液，將測序芯片排氣后，將緩沖液從Priming port 勻速推入管路；將構建的文庫與試劑盒中適當體積的測序Buffer 及Loading Beads 混勻后，勻速滴入芯片SpotON sample port 孔中；關閉各個閥門，將芯片裝載到GridIONx5測序儀上進行測序。測序結束后，使用芯片清洗試劑盒，按照說明對測序后的芯片進行清洗，清洗后加入Buffer 置于4 ℃正向密封保存。

1.9 數據處理與分析

測序過程中可實時進行堿基識別（basecalling），運行1 h 后，將輸出文件夾中的barcode01 和barcode02 文件夾中的*. fastq 文件整合到一個文件夾中，導入BAIYITECH 流感病毒全基因組分析模塊進行序列拼接和初步分析，初步確定測序覆蓋率和毒株亞型。

1.10 進化分析

在GISAID 網站通過BLAST 分析拼接到的序列，確定各片段最大核苷酸相似性最大的毒株，并下載相應參考毒株HA和NA基因片段核苷酸序列進行系統進化分析。用MAFFT 7.52 軟件進行序列比對，采用 Geneious 9.0 軟件的UPGMA 方法構建病毒序列系統進化樹。

2 結果

2.1 熒光RT-PCR 檢測與核酸質量濃度定量

該陽性樣品經熒光RT-PCR 檢測，結果Ct 值為21.97（圖1），陽性對照為AIVM基因體外轉錄RNA。經Qubit Flex 熒光計定量，核酸質量濃度為4.54 ng/μL，吸取10 μL 提取的RNA 進行靶向捕獲和后續的文庫構建和序列測定。

圖1 陽性樣品熒光RT-PCR 擴增結果

2.2 樣品中AIV 測序

將序列數據導入BAIYITECH 流感病毒全基因組分析模塊進行序列組裝和初步分析。序列鑒定結果顯示，樣本中的病毒為H5N5 亞型AIV，序列覆蓋度為96.44%。鑒定?；鶊D見圖2，產生數據堿基數與讀長分布見圖3，測序覆蓋度匯總見表1。

表1 測序覆蓋度匯總

圖2 序列鑒定?；鶊D

圖3 堿基數與讀長分布

2.3 樣品中毒株分子特征分析

本研究采用納米孔測序獲得樣品中AIV 的8個基因片段序列基本信息見表2（包括各基因長度、編碼氨基酸序列長度及相似性最高毒株），其中PB1基因中有約480 bp 的序列未被測出，未能對其氨基酸序列長度進行推導；各基因片段序列Blast 分析均顯示，樣品中的病毒為鴨源H5N5 亞型AIV，與樣品已知信息相符。HA 氨基酸裂解位點分析結果顯示，序列為PLREKRRKR/GLF，具有5 個連續的堿性氨基酸，為高致病性AIV 分子特征[1]，未發現向SAα2-6Gal 轉變的氨基酸突變[8]。

表2 各個基因片段序列基本信息

2.4 進化分析

根據GISAID 網站Blast 比對結果以及該網站公布的H5 亞型病毒相關不同譜系毒株序列，經MAFFT 比對后，采用Geneious 內置UPGMA方法，分別針對HA和NA基因繪制進化樹。結果顯示，該病毒HA和NA基因分別與A/duck/Eastern China/031/2009（H5N5）和A/duck/Eastern China/008/2008（H5N5）親緣關系最近，位于同一分支。HA譜系劃分為2.3.4，NA為歐亞譜系。HA和NA基因進化分析結果分別見圖4 和圖5。

圖4 樣品中病毒（A/duck/BJHK/22）HA 基因進化分析結果

圖5 樣品中病毒（A/duck/BJHK/22）NA 基因進化分析結果

3 討論

隨著候鳥遷徙和人類活動，高致病性禽流感在全球范圍內時有發生，給養殖業和人類健康帶來嚴重挑戰。高致病性禽流感不僅可對養禽業造成致命打擊，而且一些毒株經過不斷變異累積，遺傳特征可發生演變，進而突破種間屏障傳播給人和其他哺乳動物，甚至發生人際傳播。因此聯合國糧農組織（FAO）、世界動物衛生組織（WOAH）以及世界衛生組織（WHO）均將禽流感監測作為三方聯盟的優先事項之一，呼吁世界各國加強監測[9]。

由于高致病性AIV 生物安全等級較高，常規的血清學以及基于核酸擴增的方法盡管可以對禽流感作出確診，但由于AIV 的高變異特性，難以對其進行精確亞型鑒別以及致病性分子特征分析。盡管目前涌現了很多針對HA 或NA 亞型鑒別的熒光RT-PCR 方法，但由于AIV 同一亞型不同株型序列差異大，因此這些方法僅適用于一定時間和地域范圍內的流行株檢測[10-12]。此外，對于檢測到的病毒陽性樣品，及時開展分子溯源意義重大，不僅可以推測病毒來源，還可以對HA 氨基酸裂解位點序列以及HA 蛋白的受體結合特性進行評估，這對于疫情擴散風險研判與防控策略制定都具有重要指導意義。對病毒基因進行測序無疑是最直接有效的分子溯源方法，而常規非靶向測序方法往往需要較高的病毒濃度，需要進行病毒分離后再測序，生物安全風險較大。而基于靶向富集的納米孔測序技術，不僅簡單、快速，而且無需病毒培養，可顯著降低生物安全防護水平。當然，盡管納米孔測序技術有許多優勢，但仍然存在設備價格高，測序完成需要配套數據庫進行序列拼裝，生物信息學分析能力要求高門檻等問題，因而限制了本技術的推廣應用。

本研究以實驗室保藏的1 份AIV 滅活拭子樣品作為研究對象，結合靶向富集技術，對樣品中的病毒全基因組核酸序列進行了測定和序列分析，發現10×序列覆蓋度達到96.44%，僅PB1基因約480 bp 序列未被有效測出，推測可能是該區域靶向引物擴增效率不高所致，提示富集方法需進一步優化。測到的序列覆蓋所有關鍵序列和位點信息，因此可有效對該病毒進行分子溯源。溯源信息顯示，該毒株是源自我國南方的鴨源病毒，其HA基因為2.3.4 譜系。H5N1 亞型的2.3.4 譜系早在2005 年就在國內傳播，而N5 為歐亞譜系，因此本次測定到的H5N5 亞型毒株譜系可溯源至2009 年我國東部檢測到的基因重排毒株。氨基酸裂解位點分析顯示，樣品中的病毒具有高致病性AIV 分子特征，但仍保持SAα2-3 Gal 受體結合位點特征，未發現向SAα2-6 Gal 轉變的氨基酸突變，提示該樣品中的病毒不具備向人傳播的能力[8]。另一方面，基于納米孔測序的靶向富集技術一般采用 “疊瓦式” PCR方法進行靶核酸富集，由于富集體系中至少含有幾十條引物，不同引物擴增效率存在差異，因此根據樣品中病毒核酸質量濃度的不同，采用不同的循環擴增次數，對于含量相對較高的模板（Ct ＜30），往往采取低于30 次的循環次數，以避免部分擴增產物占比過高，影響測序結果的覆蓋度。本研究測序樣品中的病毒核酸質量濃度較高，Ct ＜30，因此富集循環次數設定在25，取得了較為滿意的測序覆蓋度。

4 結論

本研究對滅活拭子樣品中的病毒核酸進行靶向富集后，采用納米孔技術進行了全基因組序列測定，確定樣品中病毒為H5N5 亞型高致病性AIV，其HA基因為2.3.4 譜系，NA基因為歐亞譜系，表明靶向納米孔測序技術可直接用于拭子樣品中流感病毒的全基因組測序，其快速、便捷，適用于動物流感病毒的快速分子鑒定與溯源。