杧果鐵還原酶（FRO）編碼基因的鑒定與表達模式分析

韓廣棟 孫豐沛 任姿穎 曹晶雯 高愛平 黃建峰 宋志忠

摘??要：鐵（Fe）是植物生長發育的必需微量元素之一，參與植物體內多種生命活動和代謝過程。有關鐵素吸收、轉運和分配吸收的分子機制研究主要體現在一年生模式作物，果樹中鐵吸收與轉運相關基因的生物學功能依然未知。本研究從二倍體杧果桂熱82中克隆并鑒定了11個鐵還原酶（FRO）編碼基因，命名為MiFRO1～MiFRO11；除MiFRO1缺失Motif2～Motif5基序外，其他MiFROs均含有10個典型的Motif基序，除MiFRO3具有獨特的三級結構外，其他MiFROs擁有相近的三級結構；11種不同科、屬植物FRO蛋白的氨基酸水平一致性約為42.07%，MiFROs的氨基酸水平一致性約為62.43%；系統進化樹表明MiFROs傾向于單獨聚集在一起，在系統發育樹上與其他10種植物的同源蛋白進化距離較遠；實時熒光定量PCR表明MiFRO8在杧果樹體中的整體表達水平最高，MiFRO4、MiFRO5、MiFRO8和MiFRO11在成年樹體新生葉片和嫁接苗葉片中的表達量最高，MiFRO6和MiFRO7在成年樹體新生韌皮部和嫁接苗莖部的表達水平最高，MiFRO1和MiFRO10在幼果的表達水平最高，MiFRO2和MiFRO9在嫁接苗根部的表達量最高，而MiFRO3在盛開期花朵中的表達量最高。此外，MiFROs在根部易受缺鐵和NaCl脅迫的誘導而顯著增加；MiFRO3、MiFRO5和MiFRO8受高鐵毒害的抑制，表達量降低；MiFRO2、MiFRO5、MiFRO7受ABA脅迫，其表達量增加；MiFRO1、MiFRO5受PEG脅迫，其表達量增加，MiFRO2、MiFRO6和MiFRO7受低溫（4?℃）抑制，其表達量降低，但MiFROs對熱脅迫（45?℃）不敏感。本研究為明確杧果鐵的吸收與轉運機制提供基因資源，并為解析熱帶作物果樹鐵素營養與高效利用奠定理論基礎。

關鍵詞：杧果；鐵吸收；鐵還原酶；非生物脅迫；表達模式中圖分類號：S667.7??????文獻標識碼：A

Identification?and?Expression?Pattern?Analysis?of?Ferric?Reduction?Oxidase?Encoding?Genes?in?Mango

HAN?Guangdong1*，?SUN?Fengpei1*，?REN?Ziying1，?CAO?Jingwen1，?GAO?Aiping2，?HUANG?Jianfeng2，?SONG?Zhizhong1，3**

1.?Engineering?Research?Institute?of?Agriculture?and?Forestry，?Ludong?University?/?Key?Laboratory?of?Molecular?Module-based?Breeding?of?High?Yield?and?Abiotic?Resistant?Plants?in?Universities?of?Shandong，?Yantai，?Shandong?264025，?China;?2.?Tropical?Crops?Genetic?Resources?Institute，?Chinese?Academy?of?Tropical?Agricultural?Sciences，?Haikou，?Hainan?571101，?China;?3.?Department?of?Plant?Science，?University?of?Cambridge，?Cambridge?CB2?3EA，?England

Abstract：?Iron?（Fe）?is?one?of?the?essential?trace?mineral?elements?in?plants?to?maintain?normal?growth?and?development?that?plays?an?important?role?in?various?life?processes.?Researches?towards?molecular?mechanism?of?Fe?uptake，?transport?and?distribution?are?mainly?focused?on?the?annual?model?plants.?Biological?functions?of?genes?towards?Fe?uptake?and?transport?in?fruit?trees?are?still?unknown.?In?this?study，?11?ferric?reduction?oxidase?encoding?genes?（FROs）?were?isolated?and?identified?from?diploid?mango?Guire?82，?named?by?MiFRO1–MiFRO11.?All?mango?FRO?had?ten?typical?motifs?except?for?MiFRO1?lacking?Motif2–Motif5.?All?mango?FRO?possessed?similar?tertiary?structure，?with?the?exception?that?MiFRO3?exhibited?distinct?tertiary?structure.?The?amino?acid?sequences?of?FRO?from?11?plants?shared?an?overall?identity?of?42.07%，?while?mango?FRO?shared?an?overall?identity?of?62.43%.?Phylogenetic?tree?analysis?showed?that?mango?FRO?were?prone?to?be?closely?clustered?together?lonely，?which?was?far?away?from?the?homologs?of?the?other?ten?plants?in?genetic?distance.?Quantitative?real-time?PCR?（qRT-PCR）?analysis?showed?that?MiFRO3?was?the?most?abundant?expressed?gene?during?different?parts?of?Guire?82?mango?on?the?whole.?In?particular，?MiFRO4，?MiFRO5，?MiFRO8?and?MiFRO11?were?highly?expressed?in?the?leaves?of?both?mature?trees?and?grafted?seedlings.?MiFRO6?and?MiFRO7?were?highly?expressed?in?phloem?or?stem，?MiFRO1?and?MiFRO10?were?highly?expressed?in?young?fruits，?MiFRO2?and?MiFRO9?were?highly?expressed?in?seedling?roots，?while?MiFRO3?was?highly?expressed?in?full?bloom?flowers.?In?addition，?expression?of?FRO?in?mango?roots?were?mainly?induced?under?iron?depletion?and?NaCl?stress，?respectively，?while?MiFRO3，?MiFRO5?and?MiFRO8?were?significantly?reduced?under?iron?toxicity.?Expression?of?MiFRO2，?MiFRO5?and?MiFRO7?were?increased?under?ABA?treatment，?and?MiFRO1?and?MiFRO5?were?enhanced?under?PEG?treatment.?Expression?of?MiFRO2，?MiFRO6?and?MiFRO7?were?decreased?under?low?temperature?（4?℃）.?However，?FRO?changed?little?under?heat?stress?（45?℃）?in?mango?roots.?This?study?would?provide?gene?resources?to?elucidate?the?molecular?mechanisms?of?Fe?uptake?and?transport?in?mango，?and?lay?a?theoretical?foundation?to?reveal?Fe?nutrition?and?high?utilization?in?tropical?fruit?crops.

Keywords：?mango;?Fe?uptake;?ferric?reduction?oxidase;?abiotic?stress;?expression?pattern

DOI：?10.3969/j.issn.1000-2561.2024.02.001

鐵（Fe）是植物細胞中必不可少的微量元素之一，作為鐵硫蛋白和細胞色素的組成成分，參與植物光合作用、呼吸作用、植物激素合成、DNA修復和氨基酸、嘌呤代謝等多種代謝途徑[1-4]。園藝學中，鐵肥施放與果樹的生長、發育、果實品質形成和產量密切相關，土壤缺鐵不利于果樹的生長和發育，特別是石灰性土壤中缺鐵現象更為明顯，直接影響作物產量和品質的降低[5-8]。

土壤中的鐵大多為Fe3+，植物對Fe3+的利用微乎其微[5，?7-9]。植物中，有關鐵吸收、轉運和分配的分子機制研究主要集中在擬南芥（Arabi dopsis?thaliana）、水稻（Oryza?sativa）等模式植物中[5-6，?9]，果樹作物中的研究較少。植物正常生長所需鐵濃度為10–9～10–4?mol/L，然而，在正常pH土壤中Fe2+和Fe3+的濃度通常不超過10–15?mol/L，遠遠不能滿足植物正常生長和發育的需求[6，?9]。ROMHELD等[10]最早提出了2種植物根際的鐵吸收機制：吸收機制Ⅰ，即通過定位于根細胞膜表面的H-ATP酶向根際分泌H+，降低周圍土壤pH，促進Fe3+的溶解，并通過鐵還原酶（ferric?reduction?oxidase，?FRO）將根系周圍的Fe3+被還原為Fe2+，再通過Fe2+轉運蛋白（ferrous?iron?transporter，?IRT）進入根系被植物吸收利用[5-6，?9-10]，多見于雙子葉植物和非禾本科單子葉植物；吸收機制Ⅱ，即通過一系列的酶促反應合成和分泌麥根酸類物質，與根際的Fe3+形成螯合物，由專一的鐵載體吸收途徑被根系吸收利用，常見于禾本科單子葉植物。近期研究表明，水稻中同時存在吸收機制Ⅰ和吸收機制Ⅱ[5-6，?9-11]。

近幾年，國內外學者有關FRO吸收鐵的分子機制研究主要集中在擬南芥[10，?12]和水稻[11]等一年生模式植物。最早在擬南芥根中克隆獲得AtFRO2，將其在鐵還原酶缺陷的突變體fro互補表達后有效緩解了缺鐵脅迫對突變體植株生長的抑制作用，并顯著增強了互補株系根表面的FRO活性[13-14]。水稻OsFRO1和OsFRO7主要在旗葉中高量表達，且在轉錄水平均受NaCl、PEG、高溫、重金屬等非生物脅迫的調控，OsFRO1的RNAi干涉株系生長受抑制，鐵含量、葉綠素含量和活性氧（reactive?oxygen?savaging，?ROS）清除能力均顯著降低[11]。然而，果樹學中鐵吸收與轉運的分子機制未知，僅在資陽香橙（Citrus?junos?cv.?Ziyang?xiangcheng）[15]和小金海棠（Malus?xiao jinensis?cv.?Cheng?et?Jiang）[16]中鑒定出FRO同源基因，熱帶作物中有關鐵營養與高效利用的分子基礎依然空白。

杧果（Mangifera?indica）是全球知名的熱帶果樹作物之一，基因組已完成測序[17]。本研究以桂熱82杧果為材料，克隆杧果FRO基因并鑒定其生物信息學特征，明確杧果FRO基因的組織特異性表達特征及其在轉錄水平對缺鐵、鐵毒害、ABA、NaCl、PEG、低溫和熱脅迫的響應差異，為研究杧果鐵的吸收與利用的分子機制提供基因資源，并為解析杧果鐵素營養動態與高效利用奠定理論依據。

1??材料與方法

1.1??材料

供試材料為5年生桂熱82杧果和1年生嫁接幼苗，由中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所提供。分別采集5年生桂熱82杧果的1年生新葉（2019年4月1日）、新生韌皮部（2019年4月1日）、新生根（2019年4月1日）、盛開期花朵（2019年4月1日）、幼果（2019年5月1日）和成熟果實（2019年8月1日），液氮冷凍后保存于–80?℃超低溫冰箱備用。按照李又歡等[18]、張璐等[19]和SONG等[20]的方法，以1/2?MS液體培養基為對照條件，利用1年生桂熱82嫁接幼苗進行缺鐵（0?μmol/L?FeNa-EDTA）、高鐵（500?μmol/L?FeNa-EDTA）、ABA（200??mol/L）、10%?PEG?6000（w/V）、NaCl（200?mmol/L）、低溫（4?℃）和高溫（45?℃）脅迫，處理48?h后[17-21]，采集根部和葉片材料用于轉錄水平的表達差異分析。

1.2??方法

1.2.1??杧果FRO家族基因克隆??以擬南芥8個FRO蛋白的氨基酸序列為參考[10，?12]，在杧果基因組數據庫[17]中檢索潛在的杧果FRO家族蛋白，下載氨基酸序列及其編碼基因的CDS（coding?sequence）序列，檢索結果在Pfam（http：//pfam.?xfam.org/search）在線軟件預測功能結構域。根據杧果FRO基因的CDS序列設計上下游引物，提取1年生桂熱82嫁接幼苗的RNA，通過Prime-?ScriptTM?RT?reagent?Kit反轉錄試劑盒（TaKaRa，大連）合成第一鏈cDNA作為模板，利用Prime?STARTM?HS?DNA聚合酶（TaKaRa，大連）擴增杧果FRO基因，送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序驗證。

1.2.2??生物信息學分析??通過李又歡等[18]和GAO等[21]描述的方法，利用ProtParam（http：//?expasy.org/tools/protparam.html）在線軟件分析杧果FRO蛋白的氨基酸數目、等電點、脂肪系數、總親水平均數GRAVY（grand?average?of?hydropathicity）、不穩定指數等理化性質；運用SignalP?4.0?（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/）在線軟件分析杧果FRO蛋白的信號肽存在情況；利用Phyre?2（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/?html/page.cgi？id=index）在線軟件預測杧果FRO蛋白的三級結構。

1.2.3??系統發育樹分析??根據GAO等[21]和ZHANG等[22]的方法，下載杧果（漆樹科）、擬南芥（十字花科）、番茄（Solanum?lycopersicum，茄科）、玉米（Zea?mays，禾本科）、水稻（禾本科）、蒺藜苜蓿（Medicago?truncatula，豆科）、落花生（Arachis?hypogaea，豆科）、大豆（Glycine?max，豆科）、葡萄（Vitis?vinifera，葡萄科）、資陽香橙（蕓香科）和小金海棠（薔薇科）11種植物FRO同源蛋白的氨基酸序列，利用ClustalX?2.0軟件對其進行氨基酸序列一致性比對分析，利用MEGA?13.0軟件中的鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構建11種植物FRO同源蛋白的系統發育樹，分析不同植物FRO同源蛋白的遺傳進化關系。

1.2.4??實時熒光定量PCR分析??參考文獻[18-23]的方法，利用NCBI/Primer-BLAST在線軟件設計杧果FRO家族基因的特異性表達引物（表1），以杧果Actin為內參，通過ABI?7500實時熒光定量PCR儀檢測杧果FRO家族基因在不同組織部位的特異性表達特征及其在轉錄水平上對缺鐵、高鐵、ABA、PEG?6000、NaCl、低溫和高溫等非生物脅迫的響應差異。借助SYBR?Green（TaKaRa，大連）熒光染料進行PCR反應。反應程序為：95?℃預變性30?s；95?℃變性5?s，58?℃退火34?s，40個循環；最后72?℃延伸10?s。由實時熒光定量PCR儀獲得的Ct值經內參基因Actin均一化處理，采用2–ΔΔCT法計算相對表達量，通過Log2法計算脅迫處理前后表達倍數的變化，并通過HemI軟件繪制表達倍數變化的熱圖。

1.3??數據處理

利用SPSS?13.0軟件（SPSS?Chicago，美國）對本研究的數據進行顯著性分析，杧果幼苗在脅迫處理與對照條件2個獨立樣品間進行t-檢驗。

2??結果與分析

2.1??杧果FRO家族基因的鑒定與克隆

通過BLAST同源比對法，在杧果數據庫里

檢索到11個潛在的鐵還原酶蛋白，Pfam注釋為Ferric?reductase，功能結構域包括NADPH?oxi dase、FAD-binding?domain和Oxidoreductase?sig nature?domain等，均屬于典型的鐵還原酶的保守功能域（圖1）。GO生物學功能注釋為deto xification（GO：0098754），證實均為鐵還原酶編碼基因，命名為MiFRO1～MiFRO11。下載MiFROs的CDS電子序列，設計上下游引物進行PCR擴增，測序驗證后提交NCBI獲得Genbank登錄號（表2）。

2.2??植物FRO同源蛋白系統發育樹分析

多重序列比對結果表明，11種植物FRO蛋白之間具有較高的同源性，氨基酸水平具有42.07%的一致性，11個杧果FRO蛋白在氨基酸水平具有62.43%的一致性（圖1），核苷酸水平具有57.78%的一致性。下載杧果、擬南芥、番茄、水稻、玉米、大豆、蒺藜苜蓿、落花生、葡萄、資陽香橙和小金海棠等11種植物FRO同源蛋白的氨基酸序列[5-16]進行系統發育樹分析，結果表明，MiFROs集中聚集在一起，且與其他10種植物同源蛋白在系統發育樹上距離較遠，大豆、蒺藜苜蓿和落花生3種豆科植物的FRO同源蛋白在遺傳進化距離最近，葡萄、資陽香橙和小金海棠3種果樹作物FRO同源蛋白聚在一起，水稻和玉米2種禾本科植物FRO同源蛋白在遺傳距離上更為相近（圖2）。

2.3??MiFROs的理化性質與高級結構分析

理化性質分析結果詳見表2，所有MiFROs的等電點（pI）>7.00，含有的堿性氨基酸較多；MiFROs的脂肪系數均小于100，且GRAVY親水指數均小于0，均為親水蛋白；信號肽分析表明MiFROs均不具有信號肽。穩定性分析表明MiFRO2和MiFRO9的不穩定指數小于40，為穩定蛋白，其他MiFROs的不穩定性指數大于40，均為不穩定蛋白（表2）

Motif分析結果表明，MiFROs含有10個不同的典型Motif基序，其中，MiFRO1僅含有6個（Motif1、Motif6～Motif10）基序，缺失4個（Motif2～Motif5）基序，而其他MiFROs擁有全部10個Motif基序（圖3A）。除Motif10含有32個特征氨基酸數目外，其他10個Motif均含有50個特征氨基酸數目（圖3B）；

蛋白質高級結構預測結果表明，MiFROs三級結構存在差異，其中，MiFRO1、MiFRO2、MiFRO6和MiFRO7具有相似的三級結構，MiFRO4、MiFRO5、MiFRO8、MiFRO9、MiFRO10和MiFRO11具有相似的三級結構，而MiFRO3具有獨特的三級結構，與其他MiFRO成員的三級結構差異較大（圖4）。

2.4??MiFRO家族基因組織特異性表達分析

實時熒光定量PCR分析結果表明，MiFRO

家族基因在5年生桂熱82杧果的新生葉片、新生韌皮部、盛開期花朵、幼果、熟果和1年生嫁接苗的葉片、莖部和根部等多種組織中均有表達，且表達量差異顯著（圖5）。MiFRO8在所有檢測組織中的整體表達水平最高，其次是MiFRO11和MiFRO6，而MiFRO1和MiFRO2的整體表達水平相對最低。此外，4個基因（MiFRO4、MiFRO5、MiFRO8和MiFRO11）在杧果不同檢測組織中的表達趨勢相似，均在成年樹體新生葉片和嫁接苗葉片中的表達量最高，遠高于其他檢測組織中的表達量，2個基因（MiFRO6和MiFRO7）在成年樹體新生韌皮部和嫁接苗莖部的表達量最高，2個基因（MiFRO1和MiFRO10）在幼果的表達水平最高，2個基因（MiFRO2和MiFRO9）在嫁接苗根部的表達量最高，而MiFRO3在盛開期花朵中的表達量最高。

2.5??幼苗MiFROs對不同非生物脅迫的差異響應

以1年生桂熱82嫁接苗為材料，通過實時熒光定量PCR分析MiFROs在杧果根部對缺鐵、鐵毒害、ABA、PEG?6000、NaCl、低溫和熱脅迫等非生物脅迫的響應特征。結果表明：MiFRO家族基因對缺鐵和NaCl脅迫最為敏感，其中，8個基因（MiFRO1、MiFRO2、MiFRO3、MiFRO4、MiFRO5、MiFRO7、MiFRO8和MiFRO10）受缺鐵脅迫的影響，在根部的表達水平顯著增加，7個基因在根部對NaCl脅迫有響應，其中5個基因（MiFRO1、MiFRO2、MiFRO5、MiFRO7和MiFRO10）被顯著誘導，其表達水平增加，2個基因（MiFRO6和MiFRO11）被顯著抑制，其表達水平降低；3個基因（MiFRO3、MiFRO5和MiFRO8）受鐵毒害抑制，在根部的表達水平顯著

降低；3個基因（MiFRO2、MiFRO5和MiFRO7）和2個基因（MiFRO1和MiFRO5）分別受ABA和PEG脅迫的誘導，其表達水平顯著增加；此外，MiFRO2、MiFRO6和MiFRO7在根部受低溫（4?℃）脅迫抑制，其表達表達水平降低，然而，MiFROs在根部對熱脅迫（45?℃）無響應，其表達水平均無顯著變化。4個基因（MiFRO1、MiFRO2、MiFRO5和MiFRO7）在根部至少對3種非生物脅迫有響應，其中，盡管MiFRO5在杧果中的整體表達水平相對較低，但其對5種脅迫處理有響應，MiFRO2和MiFRO7在杧果根部的表達量極低，但對4種非生物脅迫有響應；MiFRO9在嫁接苗根部的表達量相對較高，且最為穩定，對本研究所設置的7種非生物脅迫均無響應（圖6）。

3??討論

鐵元素與果實品質和產量密切相關[1-4]。然而，相關研究集中在生理生化層面，有關果樹鐵素營養和高效利用的分子機制研究較少。杧果作為雙子葉植物，其根際對鐵的吸收屬于機制Ⅰ[5-10]，然而，杧果有關鐵吸收與轉運的分子機制依然未知。本研究從杧果中克隆并鑒定了11個MiFROs，數量遠多于擬南芥（8個）和葡萄（6個）中同源基因的數量[9，?20]，表明在不同植物之間的FRO同源家族基因的數目存在差異。此外，不同科屬植物的FRO同源蛋白在遺傳進化關系上存在差異，同屬于禾本科或豆科的植物FRO同源蛋白傾向于緊密聚在一起，然而，相較于本研究所選的多種禾本科、豆科、茄科和十字花科植物，MiFROs

傾向于單獨聚集在一起，在系統發育樹上與其他植物的同源蛋白距離較遠，表明木本果樹鐵還原酶可能具有與常見的一年生植物中同源蛋白的生物學功能有所差異。除了MiFRO1缺失4個特征Motif基序和MiFRO3具有獨特的三級結構外，其他MiFROs具有相同的Motif基序和相近的三級蛋白結構，表明特征Motif、蛋白三級結構和進化關系上相近的鐵還原酶（如MiFRO8、MiFRO9、MiFRO10和MiFRO11）可能具有相似的生物學功能，但仍需進一步的分子生物學實驗證實。

前人研究表明玉米ZmFRO2[24]、水稻OsFRO1和OsFRO7[11]、資陽香橙CjFRO1[15]、小金海棠MxFRO4和MxFRO6[16]均在葉片中高量表達，與之相一致的是，本研究發現MiFRO4、MiFRO5、MiFRO8和MiFRO11均在成年杧果樹體新生葉片和嫁接苗葉片中高量表達，再次表明FRO基因可能在植物葉片中鐵素的吸收與轉運過程中發揮重要作用。此外，本研究發現MiFRO3在盛開期花朵中的表達量最高，表明該基因可能直接參與杧果花朵中鐵素轉運或利用過程，而MiFRO1和MiFRO10在杧果的幼果中高量表達（遠高于其他檢測的組織），表明這2個基因可能在杧果發育初期這一關鍵時期維持果實中的鐵素動態與平衡，但需進一步的生物學功能驗證。這些發現充分表明MiFROs具有典型的組織特異性表達特征，分別在不同組織/器官中各司其職、發揮鐵還原酶的作用。

本研究表明MiFROs在轉錄水平的表達易受缺鐵處理的調控，8個基因在嫁接苗根部受缺鐵脅迫，其表達水平顯著增加，推測MiFRO在缺鐵脅迫下更傾向于被誘導激活，以便最大程度地發揮根中鐵還原酶的生物功能，進而調動和富集更多的鐵元素，以便維持或保障杧果樹體中依賴于鐵的基本的生命活動的運作。因此，FRO基因表達水平的增高可能是杧果響應環境缺鐵的關鍵信號之一。此外，受鐵毒害抑制，MiFRO3、MiFRO5和MiFRO8基因在杧果根部的表達量顯著降低，但受缺鐵脅迫誘導而增加，表明這3個基因可能是杧果樹體中具有活性的鐵還原酶蛋白，其活性直接受外界鐵素供應水平的調控，這些結果與擬南芥[21]、玉米[14]、資陽香橙[15]和小金海棠[16]中有關FRO基因響應鐵素供應水平的報道相一致。NaCl和ABA為典型的滲透脅迫物質，已有研究表明小金海棠MxFRO4和MxFRO6的表達易受NaCl脅迫的影響[16]，而水稻OsFRO1和OsFRO7在轉錄水平極易受NaCl和PEG的調控，且OsFRO7在轉錄水平易受ABA脅迫誘導，而OsFRO1在轉錄水平對ABA無響應[11]。與之相類似的是，本研究發現MiFRO1、MiFRO2、MiFRO5、MiFRO7和MiFRO10受NaCl脅迫顯著誘導而增加，而MiFRO6和MiFRO11受NaCl脅迫顯著抑制而降低，與此同時，MiFRO2、MiFRO5和MiFRO7在根部受ABA處理誘導而顯著增高，再次表明MiFRO2、MiFRO5和MiFRO7這3個基因可能在杧果響應和調節滲透脅迫方面發揮關鍵作用，為進一步研究MiFRO的功能與調控機理奠定了理論基礎。此外，MiFRO1和MiFRO5在根部受PEG顯著誘導而增加，初步表明了這2個基因傾向于參與杧果對干旱脅迫的響應機制，但仍需進一步的生物學功能驗證。

杧果是典型的熱帶果樹作物，其在溫帶和寒冷地區的生長適應性很差，本研究發現杧果FRO在根部的表達均不受熱處理（45?℃）的影響，表明，杧果鐵還原酶的活性不易受高溫天氣的影響，在45?℃極端環境條件下依然可以穩定的發揮功能，進而保障杧果樹體中一些需鐵的代謝途徑或生命活動，在一定程度上解釋了杧果之所以作為典型的熱帶果樹作物在熱帶和亞熱帶地區廣泛分布和栽培的事實。此外，MiFRO2、MiFRO6和MiFRO7在根部的表達量受低溫（4?℃）抑制而降低，表明，在低溫脅迫條件下杧果的生命活力下降，特別依賴于鐵元素的代謝活動可能直接受到抑制，這幾個MiFROs通過降低自身的活性進而適應或耐受低溫脅迫對杧果生長的影響。值得注意的是，MiFRO9在杧果樹體中的整體表達水平較為適中，其在根部的表達量最高（遠高于其他檢測的組織），且不受本研究設定的7種非生物脅迫的調控，表明該鐵還原酶蛋白可能持續穩定地地發揮自身活性，進而有效地參與杧果樹體中鐵元素的吸收和轉運過程。

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