極小種群植物川柿葉綠體基因組特征與系統發育分析

楊楠 王奧 張子晨 趙良成

摘 要： ???川柿（Diospyros sutchuensis）為極小種群和國家重點保護野生植物，分布范圍狹窄，種群數量極少。目前，川柿基因組信息缺乏，在柿屬（Diospyros）中的系統親緣關系不明確。該研究通過Illumina平臺對川柿葉綠體基因組進行測序，應用Getorganellev1.7.3.4和PGA軟件對基因組進行組裝和注釋，使用DnaSP6.12.03軟件進行多序列對比分析，并使用REPuter、Tandem Reapeats Finder和MISA軟件進行重復序列分析，使用CodonW1.4和EasyCodemL軟件分別進行密碼子偏好性和選擇壓力分析。同時，基于4個不同的葉綠體基因組序列數據集，使用IQtree軟件分析川柿與11個柿屬物種的系統發育關系。結果表明：（1）川柿葉綠體基因組全長157 917 bp，包含1對26 111 bp的反向重復區、大單拷貝區（87 303 bp）和小單拷貝區（18 392 bp），GC堿基含量為37.4%。（2）川柿葉綠體基因組共注釋到113個基因，包括79個蛋白編碼基因、30個tRNA基因和4個rRNA基因；共檢測到49個長重復序列、27個串聯重復序列和34個簡單重復序列；蛋白編碼基因中高頻密碼子31個，多數密碼子末位堿基為A或U，編碼亮氨酸的密碼子使用最多；基因組編碼區比非編碼區更為保守，10個高變熱點區域可作為潛在的分子標記；蛋白編碼基因中有8個基因（ndhB、ndhG、ndhI、rbcL、rpoB、petB、petD、rps12）受到正選擇壓力。（3）系統發育分析顯示，川柿與老鴉柿（D. rhombifolia）和烏柿（D. cathayensis）親緣關系最為密切，它們與海南柿（D. hainanensis）共同形成一個單系分支。該研究結果既為川柿及柿屬種質資源鑒定、遺傳多樣性保護以及種群恢復等提供了葉綠體基因組資源，也為闡明川柿的系統進化提供了重要的分子信息。

關鍵詞： ?川柿， 葉綠體基因組， 重復序列， 選擇壓力， 系統發育

中圖分類號： ??Q943

文獻標識碼： ???A

文章編號： ??1000-3142（2024）01-0015-15

Characteristics of chloroplast genome and phylogenetic

analysis of Diospyros sutchuensis with

extremely small populations

YANG Nan1 ， WANG Ao1 ， ZHANG Zichen1 ， ZHAO Liangcheng2*

（ 1. School of Ecology and Nature Conservation， Beijing Forestry University， Beijing 100083， China;

2. Museum of Beijing Forestry University， Beijing 100083， China ）

Abstract： ??Diospyros sutchuensis is a national protected wild plant species with narrow distribution and extremely small population in southwestern China. At present， the genomic information of this species is lacking and its phylogenetic relationships among Diospyros remain unclear. In this study， the ?chloroplast genome of D. sutchuensis was sequenced by Illumina platform， assembled and annotated by Getorganelle v1.7.3.4 and PGA， and analyzed by DnaSP 6.12.03 for sequence comparison， REPuter， Tandem Reapeats Finder， MISA for repetitive sequences， CodonW1.4 for codon usage bias， and EasyCodemL for selection pressure. Meanwhile， based on four different chloroplast genome sequence datasets， the phylogenetic relationships between D. sutchuensis and 11 Diospyros species were analyzed using IQtree. The results were as follows： （1） The chloroplast genome of D. sutchuensis was 157 917 bp in length， including two inverted repeats （IRs） of 26 111 bp， which was separated by large single copy （LSC） and short single copy （SSC） of 87 303 bp and 18 392 bp， respectively. The GC content was 37.4%. （2） The genome contained 113 genes， including 79 protein-coding genes， 30 tRNA genes， and 4 rRNA genes. A total of 49 long repeats， 27 tandem repeats， and 34 simple sequence repeats were identified. There were 31 high-frequency codons in protein-coding genes， most of them ended in A or U， and the most used codons were the ones encoding leucine. The coding regions were more conserved than the non-coding ones， and 10 regions were identified as most divergent hotspots for potential molecular markers. There had been positive selection on ndhB， ndhG， ndhI， rbcL， rpoB， petB， petD and rps12 among protein-coding genes. （3） Phylogenetic analyses showed that D. sutchuensis was closely related to D. rhombifolia and D. cathayensis. Together with D. hainanensis， these four species formed a monophyletic group. The phylogenetic tree constructed from the ?chloroplast genomes had the highest support values， indicating that the ?chloroplast genomes with most variable and informative sites are more suitable for phylogenetic studies of Diospyros. The results provide useful chloroplast genomic resources for germplasm identification， genetic diversity conservation， repopulation， and phylogenetic analysis of D. sutchuensis as well as Diospyros.

Key words： ?Diospyros sutchuensis， chloroplast genome， repeat sequence， selection pressure， phylogenetic analysis

柿科（Ebenaceae）是一個主要分布于熱帶和亞熱帶的木本植物科，包含3～4個屬（Wallnfer， 2001; Duangjai et al.， 2006）。柿屬（Diospyros）是柿科內種類最多、分布最廣的屬，也是柿科在中國唯一的屬。同時，柿屬很多種類也是重要的經濟樹種，在食用、藥用、木材、園藝等方面用途廣泛（左大勛等， 1984; Rauf et al.， 2017）。柿屬的系統分類研究主要集中在形態學和孢粉學（Utsunomiya et al.， 1998; Venkatasamy et al.， 2006; Akinsulire et al.， 2018; 胡超瓊等， 2018; 鄒璞等， 2022）。近年來，有學者陸續對柿屬不同類群開展了分子系統學和基因組學研究（Yonemori et al.， 2008; Turner et al.， 2013; 梁晉軍， 2014; 傅建敏等， 2015; 傅建敏等， 2017）。在國內，柿屬包含的物種數量一直存有爭議，很多種類的系統地位也不明確（左大勛等， 1984; 吳征鎰和崔鴻賓， 1987; Li et al.， 1996）。Tang等（2019）通過資料分析、標本查閱和實地調查，確認了45種中國特有的柿屬種類，其中18種分布極為狹窄，川柿（Diospyros sutchuensis ）即為分布范圍狹窄的種類之一。

川柿由森林植物學家楊銜晉于1945年在《華西邊疆研究學會雜志》上命名發表，模式標本于1941年采自四川盆地東部華鎣山海拔1 300 m的雜木林中（Yang， 1945）。但是，自川柿發表后，幾十年來一直未在野外見到。研究人員曾去模式原產地調查，也未采到（方文培， 1985）。2017年，科研人員在重慶市江津區四面山林區再次調查到川柿，目前共發現6株個體，分散在3個分布點（劉燕琴等， 2021a，b）。川柿在野外分布范圍狹窄，種群數量極少，生境受威脅嚴重，根據極小種群野生植物（PSESP）的定義（孫衛邦等， 2015; 楊文忠等， 2015），該種應屬于極小種群野生植物。在2021年公布的《國家重點保護野生植物名錄》中（http：//www.gov.cn/zhengce/zhengceku/2021-09/09/content_5636409.htm），柿科共有2種被列為國家二級保護植物，分別為川柿和小萼柿（D. minutisepala）。目前，僅有劉燕琴等（2021a，b）對川柿的生物學特性和種子萌發進行了初步研究。在柿屬已有的系統分類學研究中，由于所涉及的類群均沒有包含川柿，因此該物種的系統親緣關系尚不明確。

葉綠體作為植物細胞特有的細胞器，擁有一套半自主性遺傳的基因組。與核基因相比，葉綠體基因組具有高度的保守性以及進化相對獨立、基因組小、結構穩定、突變率低等特點，已被越來越多用于植物分子進化、系統發育以及物種鑒定等研究中（Dong et al.， 2012; Daniell et al.， 2016）。同時，葉綠體基因組還可為重要經濟植物及珍稀瀕危植物的保育提供分子信息（陸奇豐等， 2021）。在柿屬中，目前共報道了11個物種的葉綠體基因組（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）。其中，Fu 等（2016）首次對4種和1品種柿屬植物，即柿（Diospyros kaki）、君遷子（D. lotus）、油柿（D. oleifera）、粉葉柿（D. glaucifolia）和金棗柿（Diospyros‘Jinzaoshi）進行了葉綠體基因組測序和系統發育分析，結果顯示柿與油柿的親緣關系較近，而君遷子則與粉葉柿較近。Liu 等（2018）報道了瓊島柿（D. maclurei）和海南柿（D. hainanensis）兩個海南特有種的葉綠體基因組序列，發現兩者基因組特征相近，但親緣關系卻較遠。

本文依托“中國西南地區極小種群野生植物調查與種質保存”項目對重慶市四面山川柿的調查結果，以川柿葉片為研究材料，通過葉綠體基因組高通量測序、組裝和基因注釋，結合已經報道的其他11種柿屬植物葉綠體基因組數據進行系統發育分析，擬探討：（1）川柿的葉綠體基因組特征，包括基因重復序列、變異位點、密碼子偏好性和進化選擇壓力；（2）川柿與部分柿屬種類的系統發育關系以及不同葉綠體基因組序列建立系統發育樹的比較。本研究結果有助于增加對川柿系統發生關系的理解，并為后續開展川柿及柿屬種質資源鑒定、遺傳育種、遺傳多樣性保護以及種群恢復等研究提供分子信息。

1 材料與方法

1.1 植物材料與DNA提取

川柿的葉片材料采自重慶市江津區四面山大窩鋪林場（28°34′34.48″ E、106°21′4.48″ N），用硅膠干燥保存，憑證標本（BJFUZLC022）存放于北京林業大學植物標本館（BJFC）。利用改良CTAB法（Pahlich & Gerlitz， 1980）提取川柿葉片總DNA，試劑盒采用新型植物基因組DNA提取試劑盒（北京美吉桑格生物醫藥科技有限公司）。

1.2 葉綠體基因組拼裝與注釋

葉綠體全基因組的測序分為五步，即基因組DNA質檢、DNA片段化、文庫構建、橋式PCR、Illumina Hiseq 4000 測序儀進行雙端測序。共得到5.44 Gb原始數據（raw data），去除其中測序質量較低的序列后得到clean data，利用Getorganelle v1.7.3.4軟件（Jin et al.， 2020），以柿的葉綠體全基因組作為參考，對所獲得的clean data進行從頭拼接。

將所獲得的川柿葉綠體全基因組序列使用軟件PGA（Plastid Genome Annotator）進行注釋，參照柿的葉綠體全基因組注釋信息，得到注釋結果。注釋結果經過NCBI中Blast比對，比對正確后提交至GenBank，得到基因序列號OK641590。使用在線網站OG DRAW （https：//chlorobox.mpimp-golm.mpg.de /OGDraw.html），參數為默認值，繪制川柿葉綠體全基因組圖譜。

1.3 多序列對比分析

使用DnaSP6.12.03軟件（Librado & Rozas， 2009）對11個柿屬物種的葉綠體基因組進行滑動窗口分析，計算核苷酸多樣性（Pi）。步長設定為100 bp，窗口長度為300 bp。使用MAFFT 7軟件（Katoh & Standley， 2013）分別對編碼區與非編碼區進行同源位點比對，計算每段序列的變異位點百分比。

1.4 重復序列與SSR分析

使用REPuter軟件（Kurtz et al.， 2001）查找川柿葉綠體全基因組中的散在重復序列 （dispersed repeats），海明距離（Hamming distance）設置為3。串聯重復序列（tandem repeats）通過Tandem Reapeats Finder（Benson， 1999）進行分析。簡單重復序列（simple sequence repeats， SSR）的檢測利用MISA軟件（Beier et al.， 2017），參數設置為單核苷酸重復≥10，二核苷酸重復≥6，三核苷酸重復≥5，四核苷酸重復≥4，五和六核苷酸重復≥3。

1.5 密碼子偏好分析

使用CodonW1.4軟件分析川柿葉綠體基因組中蛋白編碼基因同義密碼子的相對使用度（relative synonymous codon usage， RSCU），通過RSCU值判斷密碼子使用偏好。當RSCU＞1時，說明該密碼子被高頻使用；當RSCU=1時，說明密碼子沒有使用偏好；當RSCU＜1時，說明該密碼子使用頻率較低。軟件參數設置為默認，并根據所獲得的參數繪制相關堆積柱形圖。

1.6 選擇壓力分析

選擇川柿以及與川柿親緣關系較近的老鴉柿（D. rhombifolia）、烏柿（D. cathayensis）、海南柿，對其葉綠體全基因組的78個共有蛋白編碼基因進行選擇壓力計算與分析。利用EasyCodemL軟件（Gao et al.， 2019），選擇預置模式（preset mode）與位點模型（site model），對這些基因的非同義突變率（dN）與同義突變率（dS）及其比值（ω=dN/dS）進行計算。為了檢驗統計的顯著性，進行LRT檢驗（liklihood ratio tests）。此外，選取PamlX 軟件（Xu & Yang， 2013）中的YN00模塊計算4個物種兩兩對比后每個蛋白編碼基因的dN、dS及ω值，所得結果與EasyCodeml所得結果進行比較，以確認結果的準確性。

1.7 系統發育分析

在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數據庫中下載柿屬已經過驗證的11個物種的葉綠體全基因組序列，包括分布于中國的柿（NC_030789.1）、君遷子（NC_030786.1）、烏柿（NC_039554.1）、粉葉柿（NC_030784.1）、油柿（NC_030787.1）、海南柿（NC_042160.1）、瓊島柿（NC_042161.1）、老鴉柿 （NC_039556.1），以及分布于東南亞的D. blancoi （NC_033502.1）、D. celebica（NC_046040.1）和分布于北美的美洲柿（D. virginiana）（NC_039555.1），與本研究川柿的葉綠體全基因組序列一起進行系統發育分析。由于安息香科與柿科存在較近的親緣關系，選用中華安息香（Styrax chinensis）（MT648752.1）作為外類群。使用Phylosuite 軟件（Zhang et al.， 2020）篩選出編碼區序列與非編碼區序列，并進行序列串聯，用于后續系統發育關系分析。

為比較不同基因組序列，本研究對川柿的系統發育關系分析采用了4個不同的數據集：（1）葉綠體全基因組序列；（2）編碼區序列；（3）非編碼區序列；（4）非編碼區20個變異熱點區域的一致性序列。使用MEGA X軟件（Kumar et al.， 2018）對序列進行比對，每個數據集的最適模型選擇采用Model-Finder（Kalyaanamoorthy et al.， 2017）進行計算。利用IQtree （Nguyen et al.， 2015）構建基于最大似然法（maximum-likelihood）的系統發育樹。5 000 次自展分析檢驗，計算各節點的靴帶支持率（bootstrap values， BS），同時采用貝葉斯方法（Bayesian inference）（Posada et al.， 2004），重復1 000次，通過貝葉斯后驗概率（Bayesian posterior probabilities， PP）對系統發育樹進行檢驗。

2 結果與分析

2.1 川柿葉綠體全基因組基本特征

川柿葉綠體全基因組呈現閉合環狀四分體結構，包含一個大單拷貝區（LSC）、一個小單拷貝區（SSC）和一對反向重復區IR（IRa、IRb）（圖1）?；蚪M序列全長157 917 bp，其中LSC區、SSC區、IR區長度分別為87 303、18 392、26 111 bp?；蚪M總GC堿基含量為37.4%，LSC區、SSC區、IR區GC含量分別為35.4%、30.9%、43.0%。

川柿葉綠體全基因組中共注釋到113個基因，包括79個蛋白編碼基因、30個tRNA基因和4個rRNA基因。IR區重復的基因分別為7個蛋白編碼基因（rpl2、rpl23、ycf15、ndhB、rps7、rps12、ycf2），7個tRNA （trnV-GAC、trnI-GAU、trnA-UGC、trnR-ACG、trnN-GUU、trnI-CAU、trnL-CAA）、4個rRNA（rrn16、rrn4.5、rrn23、rrn5）。含有1個內含子的基因有15個（rpl16、rpl2、ndhB、rps16、atpF、rpoC1、trnA-UGC、trnI-GAU、trnK-UUU、trnL-UAA、trnV-UAC、rps12、trnG-UCC、petB、petD），含有2個內含子的基因有2個（ycf3、clpP）。根據基因功能的不同，川柿葉綠體基因組基因可分為與表達有關的基因（59個）、光合作用相關基因（46個）以及其他基因（8個）（表1）。川柿與已報道的其他11個柿屬物種葉綠體全基因組特征比較見附表1。

2.2 重復序列和SSR分析

通過鑒定得到川柿葉綠體基因組中的長重復序列共49個，長度在18～30 bp之間，包括正向重復序列（forward）18個、反向重復序列（reverse）7個、回文重復（palindromic）24個，未檢測到互補序列（complement）。共檢測到串聯重復序列27個，長度在4～32 bp之間，其中19個序列重復了2次、3個序列重復了3次、2個序列重復了6次、2個序列重復了4次、1個序列重復了12次、1個序列重復了5次。17個串聯重復發生在基因間隔區（IGS）、7個發生在基因ycf2上、1個位于基因ndhF、其余2個分布在基因ndhA的內含子上。在川柿葉綠體基因組共檢測到34個簡單重復序列SSR，其中33個為單核苷酸重復序列，另外1個為復合SSR（表2）。單核苷酸重復序列的重復單元大部分為堿基A或堿基T，只在LSC區出現了一個G堿基的重復單元。五核苷酸重復序列1個，重復單元為AGTTT。

2.3 序列變異分析

通過計算比較了12個柿屬物種葉綠體全基因組序列間的核苷酸多樣性 （Pi）。圖2結果顯示，Pi值區間為0～0.053 59，平均值為0.006 99。各分區中，LSC區Pi值為0～0.053 59，SSC區Pi值0～0.038 63，IR區Pi值為0～0.015 7。LSC區的高變區域（Pi＞0.03）包括trnH-GUG-psbA、trnT-UGU-trnL-UAA、petA-psbJ、psbE-petL、ycf2，SSC區的高變區域（Pi＞0.02）為ndhF-rpl32、rpl32-trnL-UAG、ccsA-ndhD、ycf1，IR區的高變區域（Pi＞0.01）為rpl2。

此外，還分別統計了12個柿屬物種葉綠體全基因組、編碼區、非編碼區，以及LSC區、SSC區、IR區變異位點的數量和百分比。葉綠體全基因組共發現3 980個變異位點，占比2.43%；編碼區變異位點1 141個，占比1.23%；非編碼區變異位點2 444個，占比3.09%。在4個分區中，LSC區變異位點數量最多，為1 588個，占比1.78%；其次是SSC區，為863個，占比4.60%；IR區變異位點最少，僅有119個，占比0.45%。

在12種柿屬植物葉綠體基因組中，編碼區共發現含有變異位點的基因21個，不同基因變異位點從高到低占比為25.94%～1.15%（附表2）。其中，psbK變異位點百分比最高，為25.94%。在21個基因中，16個位于LSC區、3個位于IR區、2個位于SSC區。非編碼區共發現含變異位點的基因序列118條，不同序列變異位點從高到低占比為49.30%～0.18%。其中，rps12-2-rps12-1變異位點百分比最高，為49.30%。非編碼區變異位點百分比最高的20個基因序列如表4所示。

2.4 密碼子偏好性分析

川柿葉綠體全基因組序列中的蛋白編碼基因共包含52 639個密碼子，高頻密碼子（RSCU＞1）共有31個。其中，以A結尾的13個、以U結尾的12個、以C結尾的3個、以G結尾的3個（圖3）。密碼子Aug、Trp的RSCU值為1，表示其無偏好性。在這些密碼子所編碼的蛋白質中，亮氨酸（Leu）所占數量最多，含5 096個密碼子，占比9.68%；色氨酸（Trp）所占數量最少，含689個密碼子，占比1.31%。

2.5 選擇壓力分析

對川柿、老鴉柿、烏柿、海南柿葉綠體基因組的78個共有蛋白編碼基因進行選擇壓力檢測（圖4）。圖4結果表明，在兩兩物種的比較中，各基因的dN平均值為0.470 0，dS平均值為0.652 1，dN最高的基因為petD（2.054 9），dS最高的基因為rpoC1（3.352 4），ω（dN/dS）平均值為0.720 8。共有8個基因（ndhB、ndhG、ndhI、rbcL、rpoB、petB、petD、rps12）的ω平均值大于1，41個基因的ω等于0，其余基因的ω平均值均小于1。對于川柿而言，兩兩物種比較中，基因rps12的ω最大，為3.957 3，出現在川柿與海南柿的比較中?；騨dhG和ndhI的ω較大，分別為2.589 0和2.563 9，出現在川柿與烏柿及川柿與海南柿的比較中。

2.6 系統發育分析

分別以葉綠體全基因組、非編碼區序列、非編碼區20個變異熱點區域的一致性序列以及編碼區序列4個不同的數據集，進行包括川柿在內的12種柿屬植物的系統發育分析（圖5：a-d）。全基因組、非編碼區序列、非編碼區變異熱點序列3個系統樹（圖5：a-c）均強烈支持川柿與烏柿和老鴉柿親緣關系最為接近，烏柿與老鴉柿互為姐妹種，川柿與這2個種形成姐妹群（支持率均為PP/BS： 1/100）。這3個種又與海南柿形成姐妹群，共同構成一個單系分支。在以上4個物種構成的分支中，海南柿位于基部，較先分化。海南柿與其他3個種的姐妹關系在全基因組系統樹上表現為強支持（圖5：a），但在非編碼區及其變異熱點系統樹上的靴帶支持率卻較弱（圖5：b， c）。

在編碼區序列構建的系統樹上，川柿的近緣類群與以上3個數據集的系統樹相比有一些差異（圖5：d）。老鴉柿先與美洲柿（Diospyros virginiana）形成姐妹群，二者再與烏柿形成姐妹群，川柿則是這3個種的姐妹群。海南柿與川柿、烏柿、老鴉柿及美洲柿共同構成一個單系分支。

3 討論與結論

3.1 葉綠體基因組特征分析

本研究中，川柿葉綠體全基因組為典型的四分體結構，基因組全長157 917 bp，共編碼113個基因，沒有發生基因重排現象。經比較，在基因組結構、大小及基因類型和排列順序等方面，川柿與柿屬其他11個物種的葉綠體全基因組非常相似。周曉君等（2020）研究表明基因組的GC含量是判斷物種間親緣關系的重要指標，本研究川柿葉綠體基因組的GC含量與其他11個物種一致，均為37.4%。這表明柿屬物種的葉綠體基因組結構較為保守。

基因組中存在的重復序列在序列變異中發揮著重要作用，其長度影響基因組的結構和功能（Weng et al.， 2014）。在許多已知的被子植物中都發現葉綠體基因組具有不同類型的重復序列，特別是在基因間隔區中（Daniell et al.， 2016）。本研究川柿葉綠體基因組的長重復序列中，63.0%的重復序列位于非編碼區，在串聯重復序列中也得到了類似的結果，70.0%的序列位于非編碼區。檢測到的3種重復序列類型中，回文序列占比最高，為49.0%。這一結果與柿屬其他一些種類相似，在柿、油柿、金棗柿、粉葉柿、君遷子中，重復序列同樣主要分布于非編碼區，并且回文序列占比最高 （Fu et al.， 2016）。

簡單重復序列SSR具有含量豐富、多態性高、共顯性等優點，被廣泛用作分子標記（羅冉等， 2010）。戚建鋒等（2018）已將SSR成功應用于柿地方品種的鑒定中。在所有SSR類型中，A和T是最常用的堿基，很少包含堿基G或C重復，這可能是因為堿基A/T比堿基G/C更容易改變（Kuang et al.， 2011）。本研究川柿葉綠體基因組鑒定出的34個SSR中，僅一個位點由堿基C、G組成。此外， 非編碼區SSR位點出現的數量占比61.8%，遠多于編碼區。川柿SSR以上特點與其他很多被子植物葉綠體基因組SSR序列組成的規律基本一致（Sun et al.， 2021），這可能是導致葉綠體基因組具有較強保守性的原因之一。這些SSR序列為川柿的遺傳多樣性研究提供了候選的分子標記。

密碼子的使用偏好性與物種長期的進化過程密切相關，能夠對基因功能及其編碼蛋白的表達產生影響（冉然等， 2022）。川柿葉綠體基因組密碼子具有明顯的A/U偏好性，此特征與其他柿屬植物及很多雙子葉植物相似（Lin et al.， 2016; 傅建敏等， 2017）。與已報道的5種柿屬（柿、油柿、君遷子、金棗柿、粉葉柿）葉綠體基因組密碼子比較發現（傅建敏等， 2017），在共有密碼子中，有8個密碼子的使用頻率不同：在GGU、AGU、CGU中，這5個柿屬植物的RSCU＞1，而川柿RSCU＜1；在AUA、GGG、AGG、CCC、ACC中，這5個柿屬植物的RSCU＜1，而川柿RSCU＞1，顯示川柿對這些密碼子的使用頻率有一定的獨特性。

本研究中，對川柿及其他11種柿屬植物葉綠體基因組序列的變異分析顯示，LSC 區包含最多核苷酸變異值高的序列，表明LSC 區具有更高的序列多樣性水平。在編碼區與非編碼區的比較中，非編碼區變異位點數量和比例明顯高于編碼區，表明編碼區更加保守，這與大多數被子植物的結果相一致（Daniell et al.， 2016）。通過比較共選定了10個高變熱點區域，其中LSC區5個、SSC區4個、IR區1個。這些高變熱點區域提供了非常有價值的變異信息，可作為潛在的分子標記用于柿屬物種鑒定和系統發育研究。

不同的環境會對物種產生不同的選擇壓力，蛋白編碼基因中非同義突變率（dN）與同義突變率（dS）的比值ω是一個衡量分子進化選擇壓力的重要指標（Dos reis， 2015）。ω=1表示基因受到中性選擇，ω>1表示基因受到正選擇，ω<1表示基因受到負選擇。本研究對川柿、老鴉柿、烏柿、海南柿4個物種共有的78個葉綠體蛋白編碼基因進行兩兩比較，發現41個基因的ω平均值為0，意味著在適應性進化過程中，多數基因并沒有發生同義和非同義替換，在一定程度上表明了柿屬基因的穩定性。對于川柿而言，rps12、ndhG和ndhI的ω＞2，顯示這幾個基因受到較強烈的正選擇壓力。rps12基因在所有葉綠體基因中結構極為特殊且高度保守（平晶耀等， 2021）。Martín和Sabater（2010）的研究表明ndh基因可能參與葉綠體對光氧化脅迫的保護，同時植物抗氧化脅迫能力與其對其他環境條件的抗性密切相關。因此，rps12和ndh基因對研究川柿和柿屬植物葉綠體基因組適應性進化過程以及進化速率具有重要價值。

3.2 系統發育分析

近年來，對于柿屬的部分種類，國內外基于葉綠體全基因組、葉綠體基因片段以及核基因片段，已進行了一些分子系統學研究，為了解柿屬的系統發育提供了重要線索。雖然川柿早在1945年即已發表，但直到近年才在野外被再次發現，目前對川柿的研究極少，其系統親緣關系也不明確。

本研究中，葉綠體全基因組、非編碼區以及非編碼區變異熱點構建的系統發育樹均顯示川柿與老鴉柿和烏柿親緣關系最為接近，并且支持率均為最高。老鴉柿與烏柿的形態特征非常相似，以至于過去老鴉柿的標本常被誤定為烏柿（吳征鎰和崔鴻賓， 1987）。本研究中，二者的果實均較小，直徑1.5～3 cm，比川柿果實略小，其他形態特征與川柿很相似。在地理分布上，川柿、老鴉柿和烏柿在中國均分布于亞熱帶山地，在生境上非常相似。這3種柿樹進而與分布于海南熱帶常綠闊葉林的海南柿組成一個單系，顯示有最近的共同祖先。海南柿果實直徑3～4 cm且幼時密被毛，與川柿果實大小相近。

在編碼區構建的系統樹中，美洲柿與老鴉柿聚為同一分支，與烏柿形成姐妹群，進而與川柿匯于同一分支。然而，美洲柿的染色體為6倍體（2n=90），而老鴉柿染色體為4倍體（2n=60）（Tamura et al.， 1998）。其他葉綠體和核基因片段分子證據顯示，美洲柿與柿、油柿和君遷子關系密切，而與老鴉柿關系較遠（Yonemori et al.， 2008; Turner et al.， 2013）。張永芳等（2016）和胡超瓊等（2018）對部分柿屬植物花粉形態的觀察顯示，美洲柿、柿、油柿、粉葉柿在花粉表面紋飾上非常相似，而烏柿花粉表面呈現較多的褶皺，與這些種類有較大差異。編碼區系統樹的不一致可能是因葉綠體基因組編碼區序列較為保守、變異信息位點較少而導致。

另外，由分布于東南亞的D. blancoi和D. celebica以及中國海南的瓊島柿（D. maclurei）組成的分支，與其他國內種類分支的拓撲關系在4個系統樹中并不完全一致，并且支持率均很低，顯示葉綠體基因組數據尚不能闡明這3種柿樹的系統發育關系，需進一步深入研究。

綜上所述，基于葉綠體全基因組、非編碼區及其變異熱點所得到的川柿系統發育研究結果與其他已有證據的相一致。因此，在這11個柿屬物種中，與川柿親緣關系最近的是烏柿和老鴉柿。在全基因組、非編碼區及其變異熱點建立的3個系統樹中，全基因組系統樹的支持率最高，顯示應該優先選擇信息位點最多的葉綠體全基因組進行柿屬的系統發育研究。

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（ 責任編輯 蔣巧媛 ）

收稿日期： ??2023-10-11

基金項目： ??國家科技基礎資源調查專項“中國西南地區極小種群野生植物調查與種質保存” （2017FY100100）。

第一作者： ?楊楠（1999-），碩士研究生，研究方向為植物發育與進化，（E-mail）nanmuyi@163.com。

* 通信作者： ??趙良成，博士，教授，主要從事植物系統進化生物學研究，（E-mail）lczhao@bjfu.edu.cn。