CircRNA 在乳腺癌中的研究進展

殷飛 倪毅 劉偉 錢煒偉 劉蕾 馬家禮 許桐林

目前乳腺癌成為了中國女性最常見的癌癥。2018 年, 乳腺癌在我國女性最常見的5 種惡性腫瘤中排第1 位, 占我國惡性腫瘤患者總數的19.2%；在女性5 種最常見的癌癥相關死亡原因中位于第4 位, 占我國癌癥總死亡人數9.1%［1］。目前早期乳腺癌患者即使給予了規范化的治療, 仍有30%～40%有可能發生轉移［2］。因此從分子層面了解乳腺癌的發生、進展發病機制尤為重要。

CircRNA 是一類非線性的非編碼核糖核酸(RNA),它們通過特殊的反向拼接, 形成不含3'末端和5'末端的共價閉合連續環。1976 年科學家發現類病毒是單鏈共價封閉的CircRNA 分子［3］。早期研究認為CircRNA是線性信使RNA(mRNA)加工過程中誤剪接的副產品,沒有特殊功能［4］。隨著高通量RNA 測序(RNA-seq)技術的發展和應用, 目前CircRNA 作為一類新的非編碼RNA 被人們重視。CircRNA 從產生機制上可以分為外顯子CircRNA、內含子CircRNA、內含子-外顯子CircRNA。CircRNA 的功能主要有：內源性競爭RNA(ceRNA), 海綿擦拭微小RNA(miRNA)；調控蛋白的表達；調控基因轉錄［5］。近年來研究發現CircRNA在乳腺癌的發生、進展、轉移過程中起著重要作用, 現就CircRNA 在乳腺癌中的研究進展總結如下。

1 乳腺癌中CircRNA 的表達變化

CircRNA 在乳腺癌發生、發展中起到重要作用, 很多學者分析和檢測了乳腺癌相關CircRNA 的表達變化。Li 等［6］使用ceRNA 微陣列技術檢測在6 對乳腺癌和相應的癌旁組織中篩選出4370 個異常表 達CircRNA, 其 中2735 個 上 調, 1995 個 下 調。進一步使用聚合酶鏈式反應(PCR)技術確認了hsa_circ_0069094、hsa_circ_0062558、hsa_circ_0074026、hsa_circ_0079876 在乳腺癌組織及細胞系中表達上調, hsa_circ_0017536、hsa_circ_0023302、hsa_circ_0017650、hsa_circ_0017545 表達下調。Yan 等［7］高通量測序技術在乳腺癌干細胞中篩選出27 個異常表達的CirRNA(fold change≥1.8, Pvalue ＜ 0.05), 其 中19 個表達下調, 8 個表達上調；并隨機選取了circVRK1,circBRIP, circOLA, circETFA, circMED13 和circBCL11B進行PCR 驗證, 最終證明PCR 結果與RNA 測序數據一致。Yin 等［8］從5 個乳腺癌和配對健康志愿者的血漿中利用微陣列分析發現41 個CircRNA 異常表達(fold change≥2), 其中19 個上調和22 個下調, 通過PCR 確認了hsa_circ_0001785、hsa_circ_0108942 上調和hsa_circ_0068033 下調；進一步研究發現hsa_circ_0001785在乳腺癌患者血中表達術后明顯低于術前。Yuan 等［9］利用微陣列技術在激素受體陽性的乳腺癌組織中鑒別出3653 個異常CircRNA, 其中1953 個 circRNAs 表達上調, 1700 個circRNA 表達下調；后續利用定量PCR技 術, 驗 證 了hsa_circ_0072304, hsa_circ_0087378 和hsa_circ_0087377 在乳腺癌組織中表達下調。He 等［10］對3 個三陰性乳腺癌細胞系(MDA-MB-231、MDAMB-468 和BT549)和1 個HME 細 胞 系(MCF-10A)進行了高通量微陣列分析, 發現174 個CircRNA 表達下 調, 93 個CircRNA 表 達 上 調(P＜0.05, FDR＜0.05)。Fu 等［11］利用高通量測序技術檢測比較了乳腺癌腦轉移細胞系231 和對應的非轉移乳腺癌細胞系MDAMB-231, 發 現 共 有215 個circRNA 上 調, 191 個circRNA 下調, 進一步PCR 驗證了hsa_circ_0001944、hsa_circ_0001481、hsa_circ_0000646、hsa_circ_0001006和hsa_circ_0000732 上 調, hsa_circ_0001910、hsa_circ_0008285 和hsa_circ_0000002 下 調。Gao 等［12］通過微陣列技術從阿霉素耐藥MCF-7 乳腺癌細胞和親本MCF-7 乳腺癌細胞中鑒別出18 個表達變化的Circ RNA, 其中hsa_circ_0002113、hsa_circ _0001667、hsa_circ_0006528 等12 個 上 調, hsa_circ_0008131、hsa_circ_0003838、hsa_circ _0007551 等6 個下調。

CircRNA 在乳腺癌組織、干細胞、外周血以及不同的分子分型中、乳腺癌轉移及耐藥均有表達變化, 說明CircRNA 在乳腺癌發生、發展及轉移及治療過程中均起到重要作用, 因此研究乳腺癌中表達變化CircRNA 的功能, 對進一步了解乳腺癌的病變機制及治療有著重要作用。

2 CircRNA 在乳腺癌中的生物學功能及調控

miRNA 在乳腺癌致癌過程中調節基因表達, 調節惡性腫瘤的增殖、轉移和侵襲。CircRNA 在乳腺作用miRNA 的內源性競爭RNA, 海綿吸附MirRNA 調節下游蛋白的表達, 形成CircRNA/miRNA/蛋白軸。Pan等［13］發現hsa_circ_0061825 (circ-TFF1)在乳腺癌中表達上調, 功能上海綿吸附miR-326 上調TFF1 表達, 通過miR-326/TFF1 軸介導促進乳腺癌進展, 敲除Circ-TFF1 阻礙乳腺癌細胞在體外的增殖、遷移、侵襲。Tang 等［14］發現 CirKIF4A 在三陰性乳腺癌中表達上調, 功能上作為Mir-375 的海綿調節KIF4A 的表達,形成 CirKIF4A/miR-375/KIF4A 軸調節三陰性乳腺癌細胞的增殖和遷移。Xiao 等［15］發現CircAHNAK1 在三陰性乳腺中表達顯著下調, CircAHNAK1 作為miR-421 海綿, 減弱miR-421 對其靶基因RASA1 的抑制作用, 過表達Circ AHNAK1 可抑制三陰性乳腺癌的增殖、遷移以及體外侵襲。Zhou 等［16］發現CircFBXL5(hsa_circ_0125597)在乳腺癌肺轉移組織中上表達上調, 功能上作為海綿與miR-660 結合調節SRSF6 表達, 功能分析提示敲除CircFBXL5, 能抑制乳腺癌細胞的增殖和向肺的遷移。Sang 等［17］發現hsa_circ_0025202 他莫昔芬耐藥的MCF-7 細胞系中表達下調, 功能上作為miR-182-5p 的 海 綿, 調 控miR-182- 5p/FOXO3a 軸,能抑制細胞增殖、集落形成和遷移, 增加細胞凋亡和對他莫昔芬的敏感性。

上述研究發現乳腺癌中CircRNA 作為miRNA海綿在乳腺發生、分子分型、遠處轉移及耐藥過程中發揮調控作用, 但是也有一部通過部分研究提示CircRNA 通過其他方式調控乳腺癌, 如調控信號通路、編 碼 蛋 白。Zhou 等［18］發 現hsa_circ_0011946/RFC3信號通路可抑制乳腺癌MCF-7 細胞的遷移和侵襲能力。Ma 等［19］發現在對紫杉醇耐藥的三陰性乳腺癌細胞系中CircAMOTL1 具有調節AKT 通路的功能, 通過激活AKT 產生磷酸化的AKT, 抑制細胞凋亡, 促進細胞存活。Wang 等［20］研究發現circ_0067934 在乳腺癌組織中表達上調, 具有調控蛋白的功能, 實驗發現敲除circ_0067934, 發現MCL-1 表達降低；通過上調蛋白MCL-1 來促進乳腺癌細胞增殖, 調節細胞周期。Ye 等［21］發現在三陰性乳腺癌中CircFBXW7 具有編碼的FBXW7-185AA 蛋白的功能, 通過上調FBXW7的表達來抑制三陰性乳腺癌的進展。Du 等［22］發現circSKA3 在乳腺癌細胞系表達上調, 功能上可以結合TKS5 和Integrinβ1, 誘導侵襲性偽足的形成, 促進乳腺癌轉移。目前乳腺癌CircRNA 相關的上游調控機制研究較少, Zheng 等［23］發現E2F1 和EIF4A3 分別結合了SEPT9 基因的啟動子和轉錄前體RNA, 對CircSEPT9 的生成有調控作用。

綜上可知, CircRNA 對乳腺癌的調控是多途徑, 可以作為miRNA 海綿, 可以調節乳腺癌的相關信號通路,可以編碼相應的蛋白, 在乳腺癌發生、發展及轉移過程中起到關鍵作用。

3 CircRNA 在乳腺癌臨床診療中的應用

3.1 CircRNA 成為乳腺癌潛在的診斷及判斷預后的生物標志物 早發現、早診斷、早治療是目前降低乳腺癌死亡率, 提高治愈率的關鍵。目前乳腺癌主要診斷方法包括超聲、鉬靶和穿刺活檢等是侵入性或昂貴的, 因此微創和便宜的方法是迫切需要的。此外, 乳腺癌術后復發風險評估對乳腺癌的術后治療起到重要指導作用。Li 等［6］發現CircRNA 在乳腺癌患者血漿與正常人血漿表達水平的顯著差異, hsa_circ_0069094、hsa_circ_0079876 上 調, hsa_circ_0017650 和hsa_circ_0017536 下調, 因此可以作為乳腺癌診斷潛在血液標記物。Yin 等［8］研究示提了與健康人群比較, 乳腺癌患者外周血中hsa_circ_0001785、hsa_circ_0108942上調和hsa_circ_0068033 下調, 受試者工作特征曲線(ROC)顯示hsa_circ_0001785 的診斷價值［曲線下面積(AUC)=0.771］優于其他CircRNA；進一步研究發現hsa_circ_0001785 在乳腺癌患者血中表達術后明顯低于術前, 因此hsa_circ_0001785 有成為乳腺癌潛在診斷標記物的價值。Liu 等［24］研究提示hsa_circ_001783 在乳腺癌中表達上調, 高水平的hsa_circ_001783 與乳腺癌患者的不良預后有關, 因此可作為乳腺癌的一種新的預后標記物。Zeng 等［25］研究發現circANKS1B 在三陰性乳腺癌中表達增加與淋巴結轉移及晚期臨床密切相關, 是乳腺癌患者整體生存的獨立危險因素。Li 等［26］發現circ-VRK1 在乳腺癌組織及細胞系中下調, 具有抑制細胞增殖, 促進細胞凋亡的作用, 可作為患者預后的獨立預測因子。Yan 等［27］發現與癌旁正常組織比,hsa_circ_0072309 在乳腺癌組織中表達下調, 具有抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲的功能, 可以作為判斷乳腺癌預后的生物標志物。

3.2 CircRNA 具有成為乳腺癌潛在治療靶點的可能目前, 許多circRNA 已被證明與乳腺癌的增殖和進展有關, 表明它們有在乳腺癌治療中作為靶點的潛在作用。CircRNA 有望為乳腺癌治療提供新的途徑, 目前,一些技術為部分或完全去除致癌CircRNA 提供了可能,如小干擾RNA(siRNA)的技術。Zhou 等［16］發現敲除CircFBXL5, 能抑制乳腺癌細胞的增殖和向肺的遷移,可以作為乳腺癌肺轉移治療潛在靶點。Zeng 等［25］證明在三陰性乳腺中ESRP1/CircANKS1B/miR-148a/152-3p/USF1 通路通過誘導TGF-β1介導的乳腺癌上皮間質化, 促進細胞侵襲和轉移, CircANKS1B 作為治療靶點可更好地預防乳腺癌轉移。

3.3 CircRNA 具有逆轉乳腺治療耐藥的可能 化療、內分泌治療是乳腺癌全身治療的主要方法, 但是內分泌或化療耐藥性而降低臨床治療效果, 導致相關乳癌患者預后差。因此了解乳腺癌發病過程中引起耐藥的分子途徑是至關重要。Ma 等［19］發現CircAMOTL1 在對紫杉醇耐藥的三陰性乳腺癌MDA-MB-231 細胞系中表達上調, 能夠增加細胞活力, 減少細胞凋亡, 增強侵襲能力, 通過調節AKT 途徑、促進抗凋亡蛋白和抑制促凋亡蛋白, 能降低紫杉醇對乳腺癌細胞的殺傷。Gao等［12］從阿霉素耐藥的MCF-7 乳腺癌細胞中表達上調, 進一步研究發現Circ0006528/miR-7-5p/Raf1 軸在乳腺癌阿霉素耐藥中起到調節作用。Liang 等［28］發現在有轉移的乳腺癌組織中CircBMPR2 的表達下調。在功能上, 敲除CircBMPR2 有效地促進細胞增殖、遷移和侵襲。此外, 敲除CircBMPR2 通過抑制他莫昔芬誘導的細胞凋亡來促進乳腺癌細胞對他莫昔芬的耐藥性,CircBMPR2 表達上調能降低他莫昔芬耐藥性；進一步研究發現CircBMPR2 海綿擦拭miR-553, 減輕USP4的抑制作用, 以抑制乳腺癌的進展和他莫昔芬的耐藥性。Sang 等［17］在他莫昔芬耐藥的乳腺癌MCF-7 篩查出hsa_circ_0025202 表達下調, 功能有增加他莫昔芬的敏感性作用。Liu 等［29］在Monastrol 耐藥的乳腺癌細胞系中篩選出CircRNA-MTO1 (hsa_circRNA_007874)在細胞系中下調, 提高circRNA-MTO1 表達能增加Monastrol 的作用, 逆轉耐藥。因此抑制表達上調的耐藥CircRNA 或上調表達下調的藥敏circRNA 具有逆轉臨床乳腺癌治療耐藥的可能。

CircRNA 剛發現時認為是錯誤剪接的無功能產物,但目前研究發現CircRNA 具有包括海綿、翻譯等多種功能。根據本文綜述可知CircRNA 參與乳腺癌的各種生物學過程, 包括增殖、遷移、侵襲、凋亡和轉移, 可以作為乳腺癌診斷、預后、復發和風險評估的潛在生物標志物、治療靶點。CircRNA 為乳腺癌的診斷和治療提供了新的視角, 然而目前研究中仍有很多不足。盡管目前已經發表了很多關于乳腺癌CircRNA 研究的文章, 但關于CircRNA 在乳腺癌發生和發展過程中的確切機制還需深入研究。目前乳腺癌CircRNA 的研究主要集中于組織樣本, 對血液中及循環腫瘤細胞中的研究尚有不足。CircRNA 的功能研究主要集中在其下游調控機制及作用, 其上游調控機制目前研究較少。CircRNA 具有成為潛在的診斷和預后生物標志物潛力,但其臨床意義還進一步擴大樣本量的研究。CircRNA具有作為乳腺癌治療的潛在靶點可能, 如何有效的增加具有抑癌作用CircRNA 的表達, 或降低或敲除具有促癌作用CircRNA 的表達滿足臨床治療的需要仍有待進一步研究。隨著技術進步, 未來CircRNA 在臨床應用將為癌癥治療帶來巨大的進步。