浙貝母提取液在大鼠尿液、糞便中的原型成分及代謝產物分析

宗 政，胡 揚，王 昊，王金宏，楊 波，胡玲玲，程 斌，周愛珍，李文蘭?

（1.哈爾濱商業大學藥學院，黑龍江 哈爾濱 150076； 2.浙江藥科職業大學中藥學院，浙江 寧波 315100）

浙貝母為百合科浙貝母FritillariathunbergiiMiq.的干燥鱗莖，名列“浙八味” 之首，是我國傳統的道地藥材之一，常用于治療風熱咳嗽、肺癰、乳癰、瘰疬、瘡毒，腫瘤等疾?。?-3］。迄今為止，從浙貝母中已經鑒定出數百種化學成分［4］。研究表明，浙貝母生物堿類成分為其抗炎、抗氧化及抗腫瘤的潛在活性成分［5-7］，貝母素甲和貝母素乙為浙貝母中的主要活性成分［6-8］。程斌等［9-10］通過譜-效相關性研究初步篩選出浙貝母9 種與抗炎作用相關的質量標志物，6 種與化痰作用相關的質量標志物。

近年來，鑒定藥物在體內化學成分的方法和技術不斷發展，最常用的為超高效液相色譜-四極桿-飛行時間串聯質譜（UPLC-Q-TOF-MS） 技術［11-12］。李榮榮等［13］對浙貝母主要成分在大鼠血中的代謝產物進行研究，而目前尚未有對浙貝母在大鼠尿液、糞便中化學成分的相關研究。因此，本實驗對灌胃浙貝母后大鼠的尿液和糞便樣品進行UPLC-Q-TOF-MS 分析，初步明確其在尿液、糞便中的化學成分，并追尋主要活性成分貝母素甲、貝母素乙的代謝途徑，以期為后期其藥效物質基礎研究提供參考。

1 材料

1.1 動物 雄性Wistar 大鼠，體質量（230±20） g，購自長春市億斯實驗動物技術有限責任公司，實驗動物生產許可證號SCXK （吉） 2018-0007。單次實驗所用大鼠均為同一批次，自由進食飲水，飼養于哈爾濱商業大學實驗室，適應性飼養1 周，設定溫度為（22±1）℃，相對濕度為45% ～60%。所有實驗操作均符合哈爾濱商業大學動物倫理委員會要求（審查號HSDYXY-2020080）。

1.2 試劑與藥物 浙貝母（產地浙江章水） 購自哈爾濱三棵樹藥材市場，經哈爾濱商業大學張德連教授鑒定為正品。貝母素甲（批號B20080）、貝母素乙（批號B20081）、西貝素（批號B21331）、貝母辛（批號B20082） 對照品均購自上海源葉生物科技有限公司，純度均＞99.0%。乙腈（質譜純）、甲醇（質譜純）、甲酸（質譜純） 均購自美國Thermo Fisher Scientific 公司； 甲醇（色譜級）、氨水（分析純） 均購自天津市天力化學試劑有限公司； 三氯甲烷（分析純） 購自天津市科密歐化學試劑有限公司； 水為蒸餾水，購自廣州屈臣氏食品有限公司。

1.3 儀器 Xevo G2 Q TOF 質譜、Acquity UPLC 色譜儀（美國Waters 公司）； 電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）； 干式氮吹儀（北京成萌偉業科技有限公司）； 快速混勻器（常州國華電器有限公司）； 臺式離心機（上海安亭科學儀器有限公司）； 超聲清洗器（深圳潔盟清洗設備有限公司）。

2 方法

2.1 提取物制備 稱取已過4 號篩的浙貝母粉末13 g，加入26 mL 濃氨水浸潤1 h，再加入260 mL 三氯甲烷-甲醇混合液（4 ∶1），稱定質量后混勻，在80 ℃水浴中加熱回流2 h，自然放冷，濾紙過濾后濃縮成浸膏，即得，置于－20 ℃冰箱保存。

2.2 分組與給藥 將大鼠隨機分為空白組、浙貝母組，每組6 只。在前期實驗基礎上，確定浙貝母灌胃給藥劑量為0.9 g/kg （以生藥計），空白組大鼠灌胃給予等體積生理鹽水，每天1 次，連續7 d。

2.3 尿液、糞便收集及預處理

2.3.1 尿液 給藥7 d 后，將浙貝母組大鼠置于代謝籠中，禁食不禁水12 h，收集0～12 h 含藥尿液，3 500 r/min離心15 min，取上清液2 mL，加入4 倍量乙腈渦旋混勻2 min，13 000 r/min 離心10 min，取上清液，N2吹干，加入2 倍量乙腈渦旋混勻2 min，13 000 r/min 離心10 min，取上清液，N2吹干，0.4 mL 甲醇復溶，0.22 μm 微孔濾膜過濾，同法制備空白尿液供試品溶液，4 ℃保存。

2.3.2 糞便 給藥7 d 后，將浙貝母給藥組大鼠置于代謝籠中，禁食不禁水12 h，收集0～12 h 含藥糞便，研缽搗碎研磨后稱取0.5 g，加入4 倍量乙腈超聲提取30 min，13 000 r/min 離心10 min，取上清液，N2吹干，加入2 倍量乙腈，渦旋混勻2 min，13 000 r/min 離心5 min，取上清液，N2吹干，0.4 mL 甲醇復溶，0.22 μm 微孔濾膜過濾，同法制備空白糞便供試品溶液，在4 ℃下保存。

2.4 UPLC-Q-TOF-MS 分析條件

2.4.1 色譜 Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）； 流動相乙腈 （A） -0.1% 甲酸（B），梯度洗脫 （0 ～5 min，2% ～25% A； 5 ～12 min，25% ～45% A； 12 ～15 min，45% ～80% A； 15 ～18 min，80% ～86%A； 18 ～25 min，86% ～94% A）； 體積流量0.4 mL/min； 柱溫30 ℃； 進樣量2 μL。

2.4.2 質譜 電噴霧離子源（ESI），正負離子掃描； 質量掃描范圍m/z50 ～1 200； 噴霧電壓3.0 kV； 離子源溫度100 ℃； 去溶劑氣溫度400 ℃，體積流量800 L/h； 錐孔氣體積流量50 L/h； 碰撞能量20～45 mV。

2.5 數據處理 通過PubMed、CNKI、Chemspider、中藥系統藥理數據庫和分析平臺（TCMSP） 等數據庫，收集整理關于浙貝母化學成分及其代謝物的信息，采用Waters Masslynx 4.1 軟件進行數據分析，根據分子量、分子式、碎片離子質譜圖、同類化合物的質譜裂解規律和相關文獻對化合物結構進行鑒定。

3 結果

3.1 成分鑒定及分析 尿液、糞便在正負離子模式下的基峰色譜圖分別見圖1～2。

圖1 大鼠糞便、尿液正離子模式基峰色譜圖

圖2 大鼠糞便、尿液負離子模式基峰色譜圖

正離子模式下，尿液中共檢測到15 種原型成分、9 種代謝產物； 而負離子模式下共檢測到5 種原型成分，去除重復后共檢測到28 種，包括19 種原型成分、9 種代謝產物。正離子模式下，糞便中共檢測到16 種原型成分、14 種代謝產物； 而負離子模式下共檢測到23 種原型成分、5 種代謝產物，去除重復后共檢測到53 種化學成分，包括37種原型成分、16 種代謝產物。除去不同生物樣品中的重復成分后，共檢測出66 種化學成分，包括45 種原型成分、21 種代謝產物，其中共有原型成分24 種，糞便中獨有成分15 種，尿液中獨有成分6 種； 共有代謝成分有6 種，糞便中獨有成分11 種，尿液中獨有成分4 種，具體見表1～2。

表1 正離子模式下大鼠尿液、糞便中浙貝母原型成分及代謝產物

表2 負離子模式下大鼠尿液、糞便中浙貝母原型成分及代謝產物

3.2 原型成分代謝途徑分析

3.2.1 貝母素甲 該成分可能會發生I 相代謝反應，即羥基化反應、氧化脫氫反應，以及Ⅱ相代謝反應，即硫酸化反應，其代謝途徑見圖3A。

圖3 貝母素甲（A）、貝母素乙（B） 代謝途徑

A15 號峰保留時間9.84 min，分子量431.339 9，m/z432.349 9 ［M ＋H］＋，失去一分子水形成m/z414.321 2［M＋H-H2O］＋，碎片離子m/z431.335 5、430.331 4 與對照品碎片離子一致，推測為貝母素甲。

A16 號峰保留時間10.03 min，分子量429.324 3，m/z430.332 8 ［M＋H］＋，與貝母素甲準分子離子峰相差2，可能為貝母素甲氧化脫氫產物，二級碎片離子m/z428.311 3［M＋H-H2］＋，m/z412.321 7 ［M＋H-H2O］＋，與文獻［15］報道一致，推測為貝母素甲代謝物M1。

C12 號峰保留時間7.28 min，分子量427.308 6，m/z428.316 0 ［M＋H］＋，與貝母素甲代謝物M1 準分子離子峰相差2，可能為貝母素甲代謝物M1 進一步氧化脫氫產物，二級碎片m/z410.305 ［M＋H-H2O］＋為失去一分子水形成，m/z256.206 9、148.111 8 碎片離子與文獻［16］ 報道一致，推測為貝母素甲代謝物M2。

C2 號峰保留時間7.44 min，分子量443.303 6，m/z444.311 4 ［M＋H］＋，與貝母素甲代謝物M2 準分子離子峰相差16，可能為貝母素甲代謝物M2 進一步羥基化產物，脫氧形成二級碎片離子m/z428.315 9 ［M＋H-O］＋，進一步失去一分子水形成m/z410.305 8 ［M＋H-O-H2O］＋碎片離子與文獻［15-16］ 報道一致，推測為貝母素甲代謝物M3。

A4 號峰保留時間7.24 min，分子量445.319 2，m/z446.327 6 ［M＋H］＋，與貝母素甲代謝物M1 準分子離子峰相差16，可能為貝母素甲代謝物M1 進一步羥基化產物，失去一分子水形成m/z428.315 9 ［M＋H-H2O］＋碎片離子，進一步失去一分子水產生m/z410.305 2 ［M＋H-H2O-H2O］＋碎片離子，此過程與文獻［16］ 報道一致，推測為貝母甲素代謝物M4。

G6 號峰保留時間5.96 min，分子量525.276，m/z524.268 8 ［M-H］－，與貝母素甲代謝物M4 準分子離子峰相差80，可能為貝母素甲代謝物M4 進一步硫酸化產物，失去一分子水形成m/z506.257 3 ［M-H-H2O］－的碎片離子，與文獻［15］ 報道一致，推測為貝母甲素代謝物M5。

C15 號峰保留時間6.86 min，分子量509.281 1，m/z510.288 5 ［M＋H］＋，與貝母素甲代謝物M1 準分子離子峰相差80，可能為貝母素甲代謝物M1 進一步硫酸化產物，碎片離子m/z430.330 8 為貝母素甲特征峰，它和m/z412.320 6 ［M＋H-H2O-SO3］＋與文獻［15］ 報道一致，推測為貝母素甲代謝物M6。

C14 號峰保留時間7.43 min，分子量511.296 7，m/z512.304 6 ［M＋H］＋，與貝母素甲準分子離子峰相差80，可能為貝母素甲硫酸化產物，二級碎片離子m/z414.337 4［M＋H-H2O-SO3］＋、m/z396.328 7 ［M＋H-2H2O-SO3］＋與文獻［15-16］ 報道一致，推測為貝母素甲代謝物M7。

A3 號峰保留時間9.20 min，分子量447.334 9，m/z448.342 3 ［M＋H］＋，與貝母素甲準分子離子峰相差16，可能為貝母素甲羥基化產物，失去一分子水形成m/z410.036 5［M＋H-H2O］＋碎片離子，與文獻［16］ 報道一致，推測為貝母素甲代謝物M8。

G5 號峰保留時間5.66 min，分子量527.291 7，m/z526.284 ［M-H］－，與貝母素甲代謝物M3 準分子離子峰相差80，可能為貝母素甲代謝物M3 進一步硫酸化產物，失去一分子水形成m/z508.276 2 ［M-H-H2O］－的碎片離子，與文獻［15］ 報道一致，推測為貝母素甲代謝物M9。

3.2.2 貝母素乙 該成分可能發生Ι 相代謝反應，即羥基化反應、還原加氫反應、氧化脫氫反應，以及Ⅱ相代謝反應，即硫酸化反應，其代謝途徑見圖3B。

A12 號峰保留時間8.70 min，分子量429.324 3，m/z430.337 3 ［M ＋H］＋，失去一分子水形成m/z412.326 1［M＋H-H2O］＋碎片離子，與對照品二級碎片信息一致，推測為貝母素乙。

C9 號峰保留時間6.86 min，分子量509.281 1，m/z510.291 3 ［M＋H］＋，與貝母素乙準分子離子峰相差80，可能為貝母素甲硫酸化產物，碎片離子m/z412.320 6 ［M＋HH2O-SO3］＋、m/z430.331 9 ［M＋H-SO3］＋與貝母素乙碎片離子及文獻［17］ 報道一致，推測為貝母素乙代謝物M1。

A9 號峰保留時間8.25 min，分子量431.339 9，m/z432.350 2 ［M＋H］＋，與貝母素乙準分子離子峰相差2，可能為貝母素乙還原加氫產物，其加氫得到m/z430.331 6［M＋H-H2］＋碎片離子，失去一分子水形成m/z412.320 8［M＋H-H2O］＋碎片離子，與文獻［15，17］ 報道一致，推測為貝母素乙代謝物M2。

A5 號峰保留時間7.28 min，分子量445.319 2，m/z446.327 9 ［M＋H］＋，與貝母素乙準分子離子峰相差16，可能為貝母素乙羥基化產物，失去一分子水形成m/z428.325 9 ［M＋H-H2O］＋碎片離子，進一步失去一分子水形成m/z410.305 8 ［M ＋H-H2O-H2O］＋碎片離子，與文獻［15］ 報道一致，推測為貝母素乙代謝物M3。

G6 號峰保留時間5.96 min，分子量525.276，m/z524.268 8 ［M-H］－，與貝母素乙代謝物M3 準分子離子峰相差80，可能為貝母素乙代謝物M3 進一步硫酸化產物，失去一水分子形成m/z506.257 3 ［M-H-H2O］－碎片離子，與文獻［15-17］ 報道一致，推測為貝母素乙代謝物M4。

A13 號峰保留時間9.20 min，分子量427.308 6，m/z428.316 ［M＋H］＋，與貝母素乙準分子離子峰相差2，可能為氧化脫氫產物，失去一分子水形成m/z410.036 5 碎片離子，與文獻［15］ 報道一致，推測為貝母素乙代謝物M5。

A6 號峰保留時間7.44 min，分子量443.303 6，m/z444.311 4 ［M＋H］＋，與貝母素乙代謝物M2 準分子離子峰相差16，可能為貝母素乙代謝物M2 進一步羥基化產物，脫去一個氧形成m/z428.315 9 ［M＋H-O］＋碎片離子，進一步失去一分子水形成m/z410.305 8 ［M＋H-O-H2O］＋碎片離子，與文獻［17］ 報道一致，推測為貝母素乙代謝物M6。

4 討論

中藥及其復方的有效組分研究和體內代謝產物、代謝過程的研究為中藥藥效物質基礎研究提供強有力的支撐，推動中藥及其復方的現代化。由于中藥化學成分多而復雜，在體內代謝產物、代謝路徑存在不可預知性，如何在數量龐大的生物樣本信息中辨識目標組分，是目前對中藥體內代謝研究的重點和難點，故本實驗采用UPLC/Q-TOF-MS 技術對灌胃浙貝母提取物后大鼠的尿液與糞便進行定性分析。結果發現，在大鼠尿液中共檢測出化學成分28 種，其中原型成分19 種，代謝產物9 種； 在大鼠糞便中共檢測出化學成分53 種，其中原型成分37 種，代謝產物16 種，去除重復后，共檢測出化學成分66 種，其中原型成分45 種，代謝產物21 種； 糞便、尿液中共有原型成分24 種，糞便中獨有成分15 種，尿液中獨有成分6 種； 糞便、尿液中共有代謝成分6 種，糞便中獨有成分11 種，尿液中獨有成分4 種。

浙貝母中的有效活性成分主要是異甾型生物堿，其極性較小，多以原型被吸收［32］。本實驗在尿液和糞便中共計檢測出47 種原型成分，這些原型成分排泄途徑大多不一致，一些原型藥物代謝后主要通過腎臟，由尿液排泄； 一些原型藥物可能未被吸收，或吸收經膽汁分泌進入腸道，最后通過糞便排泄［33］。而貝母素甲、貝母素乙、去氫鄂貝定堿、紫鄂貝堿、鄂貝定堿、coriolic acid 等原型藥物存在尿液、糞便共有現象，推測這些成分可能經胃腸道吸收后，一部分進入體循環后隨尿液排出，一部分經膽汁分泌進入小腸隨糞便排出。本實驗通過對尿液、糞便的成分研究發現，主要發生生物轉化的活性成分是生物堿類成分，本實驗在推測灌胃浙貝母后尿液、糞便化學成分的基礎上，分析了其主要生物堿活性成分貝母素甲、貝母素乙的代謝途徑，結果表明其主要通過Ι 相代謝（羥基化、氧化脫氫、還原加氫）、Ⅱ相代謝（硫酸化） 等，可為后期進一步研究浙貝母的體內代謝過程和作用機制奠定基礎。