黑逍遙散調控p38MAPK/ATF2/COX-2 信號通路對阿爾茨海默病大鼠神經炎癥的影響

米彩云，彭 超，周 君，李明成，王虎平

（甘肅中醫藥大學，甘肅省方藥挖掘與創新轉化重點實驗室，甘肅 蘭州 730000）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD） 是一種患者認知和記憶能力惡化并伴隨著神經精神癥狀和行為障礙的慢性退行性疾病。據估計，全球約有4 600 萬AD 病例，每年的相關支出費用約為8 000 億美元，是僅次于心臟病、惡性腫瘤和中風的第四大死亡原因［1］，已成為一個棘手的社會和醫學問題，但目前尚無有效的方法治療或減緩AD的進程［2］。研究表明，神經炎癥是AD 重要的發病機制之一，AD 患者大腦通常具有炎癥跡象，在炎性環境下，神經元進行性喪失，并最終導致認知和運動障礙［3］。AD 可歸于中醫“呆癥” “健忘” “癡呆” 等范疇，與肝、脾、腎三臟密切相關，因此，本研究選用肝脾腎“三臟并調”的經典方黑逍遙散進行研究，探討該方通過調控p38MAPK/ATF2/COX-2 信號通路防治AD 的作用及其免疫炎癥機制，以期為臨床應用黑逍遙散防治AD 提供實驗支撐。

1 材料

1.1 動物 SPF 級4 月齡雄性Wistar 大鼠90 只，體質量（250±50） g，由甘肅中醫藥大學動物實驗中心提供（動物質量合格證號62001000000570）。所有大鼠置于受控環境下飼養，溫度（23±2）℃，相對濕度（45±5）%，12 h 光照/12 h 黑暗周期，自由飲食飲水。所有動物均按實驗動物中心的指導原則處理，所有項目均經過甘肅中醫藥大學倫理委員會的評估和批準（倫理號2020-004）。

1.2 藥物與試劑 黑逍遙散組方購自甘肅中醫藥大學第二附屬醫院中藥房，經鑒定符合2020 年版《中國藥典》 要求。Aβ1－42蛋白 （上海源葉生物科技有限公司，批號107761-42-2）； 鹽酸多奈哌齊［衛材（中國） 藥業有限公司，國藥準字H20070181］； HE 染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號G1120）； Aβ1－42、iNOS、PGE2酶聯免疫試劑盒（上海茁彩生物科技有限公司，批號YY56922、YY98455、YY69712 ）； p38、p-p38、COX-2、ATF2、p-ATF2 抗體 （ 美國 ImmunoWay 公司，批號 YT3513、YP0336、YT1037、YT0385、YP0023）。

1.3 儀器 MT-200 型Morris 水迷宮實驗系統（成都泰盟科技有限公司）； Multiskan Mk3 型酶標儀、Real-time PCR儀（美國羅氏公司）； JY-SCZ2＋型垂直電泳槽、JY-ZY5 型轉膜儀、JY300C 型電泳儀（北京君意東方電泳設備有限公司）； 5200 型化學發光凝膠成像儀（上海天能科技）。

2 方法

2.1 藥物制備 黑逍遙散按熟地15 g、柴胡10 g、當歸10 g、白芍10 g、白術10 g、茯苓10 g、生姜10 g、炙甘草8 g、薄荷2 g 比例稱取飲片，涼水浸泡40 min，大火煮沸，小火煎熬1 h，后下薄荷煎煮5 min，濾出藥汁后，加水二次煎煮30 min，混合2 次濾出藥汁，濃縮得到生藥量1.0 g/mL 的黑逍遙散湯劑。鹽酸多奈哌齊研成粉末，溶解于純水中，配制成0.005 mg/mL 的溶液。

2.2 模型復制 大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉溶液進行麻醉，剃去大鼠頭部毛發備皮后固定頭部，沿腦頂部正中切開1 cm 左右切口，使顱骨完全暴露，確定海馬CA1 區位置并標記，用牙科鉆在標記處鉆孔直至出現落空感，再用微量進樣器在2 孔各緩慢注射1 μL Aβ1－42溶液至硬腦膜下深3 mm，留針3 min 后再緩慢出針。假手術組大鼠注射等劑量生理鹽水，不注射Aβ1－42溶液，術后在創面涂抹青霉素干粉劑以預防感染，縫合皮膚后再次碘伏消毒。

2.3 分組與給藥 隨機選取10 只大鼠作為空白組，10 只作為假手術組，選取造模成功的大鼠50 只，隨機分為模型組、鹽酸多奈哌齊組和黑逍遙散低、中、高劑量組。根據第四版《藥理實驗方法學》 中人和大鼠體表面積折算方法，黑逍遙散低、中、高劑量為4.25、8.5、17 g/kg，鹽酸多奈哌齊劑量為0.5 mg/kg，空白組與假手術組給予生理鹽水，灌胃給藥，每天1 次，連續42 d。

2.4 Morris 水迷宮行為學檢測 給藥結束后進行水迷宮實驗，向水箱注水至淹沒圓形平臺2 cm 處，加入二氧化鈦使水變為乳白色避免大鼠看清水下平臺，將大鼠面朝池壁隨機放入任一象限，分別記錄大鼠找到平臺的時間，如果時間超過120 s，則引導大鼠至平臺上停留15 s，每次游泳結束后，將大鼠用毛巾擦干以防感冒。每只大鼠每天測試2次，連續測試5 d，第6 天撤除平臺，開始120 s 的探索訓練。記錄2 次結果，作為行為學的檢測指標。

2.5 標本采集與保存 于末次行為學測試后，大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉進行麻醉，待麻醉后處死，每組取3 只大鼠全腦，置于固定液中，常溫放置； 其余大鼠腦組織在冰浴條件下，剝離海馬體，置于－80 ℃冰箱保存。

2.6 HE 染色觀察海馬CA1 區病理形態學變化 腦組織于4%多聚甲醛溶液中固定8 h，浸于70%乙醇溶液中，然后分別置于80%、90%、95%和無水乙醇中梯度脫水4 h，將組織浸泡在二甲苯中30 min，然后用石蠟包埋，切片，脫蠟水化后將切片浸泡于蘇木素溶液中染色10 min，純水沖洗干凈，然后使用1%鹽酸乙醇沖洗切片5 s，純水沖洗干凈后用伊紅復染2 min，純凈水再次沖洗，經脫水、透明、封片后置于顯微鏡下觀察。400 倍鏡下觀察海馬組織結構及細胞形態，同時采集照片。

2.7 ELISA 法檢測海馬組織Aβ1－42、iNOS、PGE2水平 取海馬組織，勻漿后離心，收集上清液，于孔板上加入各梯度標準品和待測樣品，按各試劑盒說明書操作進行反應，反應終止后在450 nm 波長處檢測各孔光密度（OD） 值，根據OD 值繪制標準曲線，計算各組大鼠海馬組織Aβ1-42、iNOS、PGE2水平。

2.8 RT-qPCR 法檢測海馬組織p38、ATF2、COX-2 mRNA表達 稱取各組海馬組織100 mg，加入RNA 抽提試劑提取RNA，用微量分光光度計檢測RNA 純度，重復3 次取平均值。將所提取的RNA 按照說明書操作反轉錄合成cDNA，建立20 μL 反應體系（各0.4 μL 正反向引物、1 μL 待測DNA、10 μL HieffTM qPCR SYBR＆ Green Master Mix、無酶水定容至20 μL） 進行qPCR 反應。按照試劑盒說明書設置兩步法擴增程序，40 個循環后采集熒光信號，每個基因重復3 次實驗。引物由生工生物工程（上海） 股份有限公司合成，序列見表1。

表1 引物序列

2.9 Western blot 法檢測海馬組織p38、p-p38、ATF2、p-ATF2、COX-2 蛋白表達 取海馬組織80 mg，加入細胞裂解液和蛋白酶抑制劑，勻漿后離心，吸取上清液進行BCA蛋白濃度測定，蛋白定量后進行變性。取蛋白樣品加樣電泳，然后轉移至PVDF 膜，室溫封閉2 h，加一抗置于搖床上孵育1 h 后，于4 ℃過夜，次日用PBST 洗膜，加入稀釋好的二抗孵育2 h，PBST 洗膜，用濾紙吸干PVDF 膜的液體，將膜放在曝光機顯影板上曝光，分析條帶灰度值。

2.10 統計學分析 通過SPSS 21.0 軟件進行處理，計量資料以（±s） 表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較方差齊采用LSD 法； 方差不齊采用Games-Howell 法。P＜0.05 為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 大鼠一般情況 空白組大鼠常規喂養，發育良好，皮毛有光澤，反應迅速，飲食、二便未見改變； 造模48 h 后，假手術組及造模組大鼠精神不振，蜷縮俯臥，飲食減少，大便色淺呈稀糊狀，假手術組死亡1 只，模型組死亡2 只，均出現腦部水腫； 給藥1 周后黑逍遙散中劑量組死亡1 只，高劑量組死亡2 只，腹部膨大，判斷為腸梗阻死亡。隨著藥物干預時間的推移，各給藥組大鼠一般狀況有所好轉，大鼠皮毛逐漸恢復光澤，精神狀態逐漸變好，活躍度有所提升，飲食尚可，二便較正常； 模型組和假手術組術后常規飼養，未進行任何治療，一般狀態稍有好轉，但仍精神不振、皮毛蓬松沒有光澤、反應遲鈍、飲食飲水較少，體質量增長緩慢。

3.2 黑逍遙散對AD 大鼠學習記憶能力的影響 與空白組比較，假手術組大鼠第2 天逃避潛伏期延長（P＜0.05），第3、4 天無明顯變化（P＞0.05），模型組大鼠第2～4 天逃避潛伏期延長（P＜0.01）； 與假手術組比較，模型組大鼠第2～4 天逃避潛伏期延長（P＜0.01）； 與模型組比較，黑逍遙散高、中劑量組和鹽酸多奈哌齊組逃避潛伏期縮短（P＜0.01），低劑量組無明顯變化（P＞0.05），見表2。與空白組比較，假手術組大鼠有效區域運動距離、目標象限停留時間百分比無明顯變化（P＞0.05），模型組有效區域運動距離減少（P＜0.01），在目標象限停留時間百分比降低（P＜0.01）； 與模型組比較，黑逍遙散各劑量組及多奈哌齊組有效區域運動距離增加（P＜0.01），黑逍遙散高、中劑量組及多奈哌齊組大鼠目標象限停留時間百分比提高（P＜0.05，P＜0.01），低劑量組無明顯變化（P＞0.05），表3。

表2 黑逍遙散對AD 大鼠第2～4 天逃避潛伏期的影響（±s）

表2 黑逍遙散對AD 大鼠第2～4 天逃避潛伏期的影響（±s）

注： 與空白組比較，?P＜0.05，??P＜0.01； 與假手術組比較，△△P＜0.01； 與模型組比較，＃＃P＜0.01。

組別動物數/只逃避潛伏期/s第2 天第3 天第4 天空白組1061.50±13.2233.10±7.9122.20±4.13假手術組972.11±12.61?41.33±8.9025.89±9.35模型組8104.75±8.10??△△81.75±11.51??△△67.75±7.69??△△黑逍遙散低劑量組1097.20±8.1372.00±10.1563.10±11.16黑逍遙散中劑量組896.13±6.96＃＃60.25±5.97＃＃34.25±11.12＃＃黑逍遙散高劑量組986.67±11.51＃＃59.44±9.29＃＃40.44±13.86＃＃鹽酸多奈哌齊組1084.70±10.19＃＃51.40±11.37＃＃29.50±6.57＃＃

表3 黑逍遙散對AD 大鼠有效區域運動距離和目標象限停留時間百分比的影響（±s）

表3 黑逍遙散對AD 大鼠有效區域運動距離和目標象限停留時間百分比的影響（±s）

注： 與空白組比較，??P＜0.01； 與假手術組比較，△△P＜0.01； 與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別動物數/只有效區域運動距離/cm目標象限停留時間百分比/%空白組10619.33±137.0628.38±6.90假手術組9551.23±104.4826.80±3.68模型組846.75±11.76??△△11.39±3.12??△△黑逍遙散低劑量組10278.47±64.75＃＃16.19±4.42黑逍遙散中劑量組8341.53±81.89＃＃20.38±5.95＃黑逍遙散高劑量組9388.95±175.68＃＃23.04±5.23＃＃鹽酸多奈哌齊組10483.37±113.56＃＃23.53±6.80＃＃

3.3 黑逍遙散對AD 大鼠海馬CA1 區病理改變的影響 空白組大鼠海馬CA1 區神經元數量豐富，排列有序，結構正常，細胞核清晰，核仁明顯，細胞質豐富； 與空白組比較，假手術組大鼠海馬CA1 區神經元形態、結構、數量未見明顯改變； 模型組大鼠海馬CA1 區神經元明顯丟失，可見大量腫脹的神經元，結構疏松，細胞核固縮，形成一些液泡結構； 與模型組比較，各給藥組大鼠海馬神經元形態均有所改善，以黑逍遙散高劑量組和鹽酸多奈哌齊組作用最為顯著，可以清晰地觀察到神經元排列有序，細胞體飽滿，未見大量凋亡細胞，見圖1。

圖1 黑逍遙散對AD 大鼠海馬CA1 區病理改變的影響（HE，×400）

3.4 黑逍遙散對AD 大鼠海馬組織Aβ1－42、iNOS、PGE2水平的影響 與空白組比較，假手術組大鼠海馬組織Aβ1－42、iNOS、PGE2水平無明顯變化（P＞0.05），模型組大鼠海馬組織Aβ1－42、iNOS、PGE2水平升高（P＜0.01）； 與假手術組比較，模型組大鼠海馬組織iNOS、PGE2水平升高（P＜0.01）； 與模型組比較，黑逍遙散中、高劑量組和鹽酸多奈哌齊組大鼠海馬組織Aβ1－42、iNOS、PGE2水平降低（P＜0.05，P＜0.01），見表4。

表4 黑逍遙散對AD 大鼠海馬組織Aβ1－42、iNOS、PGE2 水平的影響（pg/mL，±s，n＝6）

表4 黑逍遙散對AD 大鼠海馬組織Aβ1－42、iNOS、PGE2 水平的影響（pg/mL，±s，n＝6）

注： 與空白組比較，??P＜0.01； 與假手術組比較，△△P＜0.01； 與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別Aβ1－42iNOSPGE2空白組22.86±1.061.38±0.42247.85±18.03假手術組23.63±1.151.48±0.29243.61±12.54模型組36.56±1.17??△△6.69±0.27??△△327.24±15.71??△△黑逍遙散低劑量組35.08±2.316.34±0.64319.97±11.97黑逍遙散中劑量組29.13±1.90＃＃4.52±0.26＃293.30±24.01＃＃黑逍遙散高劑量組24.61±1.98＃＃2.83±0.34＃＃282.09±21.45＃＃鹽酸多奈哌齊組24.63±1.15＃＃2.15±0.22＃＃269.67±35.34＃＃

3.5 黑逍遙散對AD 大鼠海馬組織p38、ATF2、COX-2 mRNA 表達的影響 與空白組比較，假手術組大鼠海馬組織p38 mRNA 表達升高（P＜0.05），ATF2、COX-2 mRNA 表達無明顯變化（P＞0.05），模型組大鼠海馬組織p38、COX-2 mRNA 表達均升高（P＜0.01），ATF2 mRNA 表達無明顯變化（P＞0.05）； 與假手術組比較，模型組大鼠海馬組織p38 mRNA 表達升高（P＜0.01），ATF2、COX-2 mRNA 表達無明顯變化 （P＞0.05）； 與模型組比較，各給藥組p38 mRNA 表達均降低（P＜0.01），ATF2 mRNA 無明顯變化（P＞0.05），黑逍遙散中、高劑量組及鹽酸多奈哌齊組COX-2 mRNA 表達降低（P＜0.05，P＜0.01），低劑量組COX-2 mRNA 表達無明顯變化（P＞0.05），見表5。

表5 黑逍遙散對AD 大鼠海馬組織p38、ATF2、COX-2 mRNA 表達的影響（±s，n＝6）

表5 黑逍遙散對AD 大鼠海馬組織p38、ATF2、COX-2 mRNA 表達的影響（±s，n＝6）

注： 與空白組比較，?P ＜0.05，??P ＜0.01； 與假手術組比較，△△P＜0.01； 與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別p38ATF2COX-2空白組0.28±0.071.02±0.180.29±0.05假手術組0.41±0.10?1.19±0.060.39±0.15模型組1.00±0.00??△△1.00±0.001.00±0.00??黑逍遙散低劑量組0.46±0.02＃＃1.07±0.100.64±0.10黑逍遙散中劑量組0.45±0.07＃＃0.92±0.050.50±0.07＃黑逍遙散高劑量組0.40±0.12＃＃0.92±0.060.52±0.01＃＃鹽酸多奈哌齊組0.48±0.05＃＃1.08±0.120.45±0.06＃

3.6 黑逍遙散對AD 大鼠海馬組織p38、p-p38、ATF2、p-ATF2、COX-2 蛋白表達的影響 與空白組比較，假手術組p38、ATF2、p-p38、p-ATF2 蛋白表達無明顯變化 （P＞0.05），假手術組大鼠海馬COX-2 蛋白表達升高 （P＜0.05），模型組大鼠海馬組織p38、p-p38、p-ATF2 蛋白表達升高（P＜0.01），ATF2 蛋白表達無明顯變化（P＞0.05）；與假手術組比較，模型組大鼠海馬組織p38、p-p38、p-ATF2、COX-2 蛋白表達升高（P＜0.05，P＜0.01），ATF2 蛋白表達無明顯變化（P＞0.05）； 與模型組比較，黑逍遙散低劑量組p-ATF2 蛋白表達降低（P＜0.01），中劑量組p38、p-p38、p-ATF2 蛋白表達降低（P＜0.01），高劑量組及鹽酸多奈哌齊組p38、p-p38 蛋白表達降低（P＜0.01），黑逍遙散高劑量組及鹽酸多奈哌齊組p38、p-p38、p-ATF2、COX-2 蛋白表達均降低（P＜0.01），見表6、圖2。

圖2 各組大鼠海馬組織p38、p-p38、ATF2、p-ATF2、COX-2 蛋白條帶圖

表6 黑逍遙散對AD 大鼠海馬組織p-p38、p-ATF2、COX-2 蛋白表達的影響（±s，n＝3）

表6 黑逍遙散對AD 大鼠海馬組織p-p38、p-ATF2、COX-2 蛋白表達的影響（±s，n＝3）

注： 與空白組比較，?P＜0.05，??P＜0.01； 與假手術組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01； 與模型組比較，＃＃P＜0.01。

組別p38p-p38ATF2p-ATF2COX-2空白組1.01±0.030.38±0.011.03±0.070.40±0.040.65±0.03假手術組0.98±0.020.47±0.031.15±0.070.48±0.010.98±0.05?模型組1.34±0.08??△△1.04±0.05??△△1.09±0.060.98±0.08??△△1.31±0.05??△黑逍遙散低劑量組1.14±0.031.01±0.010.94±0.020.66±0.11＃＃1.19±0.10黑逍遙散中劑量組0.92±0.08＃＃0.78±0.04＃＃0.98±0.010.64±0.12＃＃1.25±0.05黑逍遙散高劑量組0.70±0.03＃＃0.66±0.01＃＃1.04±0.070.65±0.08＃＃1.02±0.06＃＃鹽酸多奈哌齊組0.68±0.04＃＃0.75±0.25＃＃1.06±0.050.70±0.05＃＃0.80±0.03＃＃

4 討論

p38 絲裂原蛋白活化激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK） 級聯信號通路作為介導炎癥的經典途徑，已被證實與神經退行性變有關［4-7］。炎癥反應是β-淀粉樣蛋白（β-amyloid protein，Aβ） 沉積所引起的繼發性反應，Aβ 能激活小膠質細胞并通過p38MAPK 途徑釋放大量炎癥因子，從而誘導神經元凋亡，導致記憶力及認知功能障礙［8］?；罨D錄因子2 （activation transcription factor 2，ATF2） 作為p38MAPK 信號通路下游的重要底物，在炎癥中具有潛在的作用［9］。研究發現，當其上游信號分子p38MAPK 被激活后，ATF2 的Try307 位點會迅速發生磷酸化改變，從而上調或下調靶基因的轉錄過程，干擾正常的基因表達，介導諸如細胞凋亡等病理過程［10-11］。有研究表明，在ATF2 基因敲除大鼠中，經脂多糖刺激后腫瘤壞死因子-α、白細胞介素1β 和白細胞介素6的表達受到顯著抑制，且ATF2 在浸潤性巨噬細胞中高表達，并抑制抗炎分子ATF3 在白色脂肪組織的M1 巨噬細胞中的轉錄［12］。一氧化氮（nitric oxide，NO） 可由NOS 的3種亞型產生，其中誘導型NOS （iNOS） 能夠通過脂多糖和各種細胞因子的刺激，產生大量NO，從而加速AD 的進程［13-14］。另一種炎癥介質 PGE2可通過環氧合酶2（cyclooxygenase，COX-2） 依賴性途徑合成參與神經退行性病變等疾病的病理過程［15］。研究表明，在炎癥模型中，當機體受到外界刺激后，COX-2 應激性升高，促進其催化產物PGE2的表達量增加［16］，PGE2進一步作用于局部炎性細胞，加重炎癥損傷［17］。

黑逍遙散出自清·徐大椿《醫略六書·女科指要》卷二十六方，由《局方》 之逍遙散加熟地而成，具有補腎填精、養血疏肝、健脾和中功效。課題組前期研究已經證實，黑逍遙散對提高大鼠學習記憶功能具有確切療效，并對AD表現出較為顯著的防治作用［18-21］，但其對于學習記憶的改善是否與調控p38MAPK 途徑減輕AD 腦內及血清中炎癥因子的表達有關，有待進一步證實。本研究發現，黑逍遙散可以縮短大鼠逃避潛伏期，增加平臺象限停留時間，提示其在改善Aβ1-42誘導的AD 大鼠空間學習記憶缺陷方面的有效作用； 黑逍遙散能降低AD 大鼠海馬組織Aβ1-42、iNOS、PGE2水平； 黑逍遙散能降低p38、COX-2 mRNA 表達和p38、p-p38、p-ATF2、COX-2 蛋白表達，提示其能夠通過降低p38 總量以及其磷酸化水平來阻斷p38MAPK 信號通路。而本實驗發現，p38 的下游底物ATF2 在各組中總量變化無明顯差異，但p-ATF2 在模型組中呈高表達，給藥干預后其表達降低，說明p-p38 能夠激活ATF2 使其磷酸化，活化后的ATF2 又可誘導 COX-2 的上調。因此，阻斷p38MAPK/ATF2/COX-2 介導的炎癥通路可能是治療AD 的重要靶點。

綜上所述，黑逍遙散對AD 具有明確的防治作用，其作用機制可能是通過調控p38MAPK/ATF2/COX-2 信號通路從而抑制炎癥因子的釋放，進而改善Aβ1-42誘導的神經元改變和學習記憶障礙。