清熱化瘀方調控Th17 對小鼠心肌缺血再灌注損傷的影響

林文勇，施雪斐，張春伶，王棟元，牛振超，蘆瑞霞，王 丹，阮小芬，王肖龍?

（1.上海中醫藥大學附屬曙光醫院國家中醫心血管病臨床醫學研究中心分中心，上海 201203； 2.上海中醫藥大學附屬曙光醫院心血管病研究所，上海 201203）

急性心肌梗死仍然是世界范圍內發病和死亡的主要原因［1-2］，早期再灌注是目前拯救心肌梗死患者危險心肌的最有效策略。然而，早期心肌再灌注卻矛盾地誘發了心肌缺血再灌注（ischemia-reperfusion，I/R） 的損傷［3］。I/R 的病理過程包括產生過多的自由基、線粒體腫脹并激活促凋亡的級聯反應和自噬功能障礙［4］。一系列的病理改變最終導致了心肌細胞凋亡的增加和梗死面積的擴大，加重心肌梗死患者的臨床癥狀和不良預后［5］。因此，確定新的干預目標和輔助治療策略以限制I/R 損傷是非常必要的。

清熱化瘀方是曙光醫院心內科王肖龍教授根據臨床經驗總結，發現急性心肌梗死患者以舌質紅者居多，伴隨炎癥因子水平增高，因此提出急性心肌梗死應“熱瘀同治”，在《金匱要略》 “三黃湯” 的基礎上加味組成“清熱化瘀方”。前期臨床研究結果表明，清熱化瘀方可以調控免疫微環境，對心肌梗死后心臟損傷起保護作用，T 輔助細胞17 （T helper cell 17，Th17） 可能是其抗心肌I/R 損傷的潛在靶點［6-8］，但其作用機制尚不明確。因此，本實驗擬采用小鼠冠狀動脈結扎松解法建立心肌缺血再灌注損傷模型，研究清熱化瘀方抗心肌缺血再灌注損傷的作用，以期為清熱化瘀方治療心肌I/R 損傷的臨床應用提供科學依據。

1 材料

1.1 動物 無特定病原體的雄性C57BL/6 小鼠，8 周齡，體質量20～25 g，購自浙江維通利華實驗動物技術有限公司［實驗動物生產許可證號SCXK （浙） 2019-0001］，飼養于上海中醫藥大學動物實驗中心屏障系統內［實驗動物使用許可證號SYXK （滬） 2020-0009］，環境溫度（25±2）℃，相對濕度（50±10）%，自由飲食，12 h/12 h 光照/黑暗循環。實驗過程中所有操作均符合實驗動物倫理委員會規定（倫理號PZSHUTCM210913015）。

1.2 藥物與試劑 清熱化瘀方由黃連6 g、黃芩10 g、制大黃9 g、牡丹皮12 g、陳皮18 g、茯苓30 g、甘草12 g、丹參30 g、葛根30 g 組成，該顆粒劑購自江陰天江藥業有限公司（批號2106309），根據臨床用量進行小鼠等效給藥劑量換算，取適量蒸餾水將清熱化瘀方配制成低、中、高劑量。戊巴比妥鈉 （批號P3761，美國Sigma-Aldrich 公司）； 2% 2，3，5 三苯基氯化四氮唑染液 （2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC ）、蘇 木 素 伊 紅（hematoxylin-eosin，HE） 染液 （批號20210721、T8170，北京索萊寶科技有限公司）； 乳酸脫氫酶 （lactic dehydrogenase，LDH） 試劑盒（批號20210722，南京建成生物工程研究所）； 白介素-17 （interleukin-17，IL-17）、白介素-6 （IL-6） 試劑盒 （批號EK217/2-96、EK206/3-96，杭州聯科生物技術有限公司）； RIPA 裂解液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒、蛋白上樣緩沖液、ECL 化學發光試劑（批號ST505、P0012S、P0012A、P0015、P0018S，上海碧云天生物技術有限公司）； 蛋白Marker （批號26616，美國Thermo Fisher Scientific 公司）；RORγt、GAPDH 一抗、HRP-山羊二抗 （批號GB112204、GB12001、GB23303，武漢賽維爾生物科技有限公司）；SYBR RT-qPCR Master Mix、RNA 抽取試劑盒（批號Q341-02、7E552A1，南京諾唯贊生物科技股份有限公司）；GoScriptTMReverse Transcription （批號0000389033，美國Promega 公司）； Percoll 細胞分離液（批號10243024，美國GE 公司）； BB515-CD4、BV650-CD25、AF647-IL-17、PEFoxP3 熒光抗體（批號564419、563719、560437、560046，美國BD 公司）。

1.3 儀器 Vivid I 便攜式心臟超聲儀（美國GE 公司）；Synergy H1 酶標儀（美國BioTek 公司）； 5430R 高速冷凍離心機（德國Eppendorf 公司）； ECG-101G 動物用心電圖儀（邦健深圳邦健生物醫療設備股份有限公司）； TM-2V45-B9L 體視解剖顯微鏡（上海丙林電子科技有限公司）； 雙通道小動物呼吸機（北京眾實迪創科技發展有限責任公司）； 高通量研磨儀（上海凈信實業發展有限公司）； 6100化學發光成像儀（上海勤翔科學儀器有限公司）； 電泳儀和濕轉儀（美國Bio-Rad 公司）； StepOne Plus 熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司）； DxFLEX 流式細胞儀 （美國Beckman 公司）。

2 方法

2.1 分組與給藥 將45 只小鼠按隨機數字表分為假手術組、模型組和清熱化瘀方低、中、高劑量組，每組9 只。造模前7 d，清熱化瘀方低、中、高劑量組灌胃給予13、26、52 g/kg 清熱化瘀方，假手術組和模型組灌胃給予等體積蒸餾水，每天1 次，連續7 d。末次灌胃30 min 后，模型組和清熱化瘀方各劑量組小鼠進行心肌缺血再灌注損傷模型建立，假手術組小鼠僅開胸不結扎冠狀動脈。

2.2 心肌缺血再灌注損傷模型建立 稱定各組小鼠體質量，腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉溶液（15 mL/1 kg） 麻醉，氣管插管成功后仰臥固定在操作臺上，連接小動物呼吸機（頻率110 bpm，潮氣量1 mL，吸呼比1 ∶1） 和肢體導聯心電圖儀。脫去前胸毛發，在左側胸骨旁第三肋間逐層打開胸腔并暴露心臟，在體式解剖顯微鏡下觀察左冠狀動脈，于左心耳下緣1 mm 處以10-0 縫合線自左冠狀動脈下方穿過并取PE-10 細管置于繩結中結扎，以心電圖ST 段抬高和心臟前壁至心尖組織廣泛發白作為結扎成功的標志。心肌缺血30 min 后取出PE-10 細管進行復灌，以心電圖ST 段回落和發白組織復紅作為再灌注成功的標志。逐層關閉胸腔，脫機，將小鼠置于25 ℃環境中復蘇。

2.3 心臟超聲評估小鼠心功能 麻醉并固定小鼠于操作臺上，待呼吸、心率平穩后，使用M 型超聲于胸骨旁短軸切面測量收縮末期和舒張期末期左室內徑，由超聲系統自動計算出左室射血分數及左室短軸縮短率。

2.4 HE 染色觀察心臟組織病理損傷 每組隨機選取3 只小鼠，灌流后取心臟組織，濾紙吸去心臟表面水分，于4%多聚甲醛中固定48 h 后進行梯度脫水，石蠟包埋切片，脫蠟覆水，蘇木精染色5 min，流水沖洗，返藍，伊紅染色1 min，沖洗，中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察心臟組織病理損傷。

2.5 TTC 染色檢測心肌梗死面積 每組隨機選取3 只小鼠，灌流后取心臟組織，濾紙吸去心臟表面水分，放入－20 ℃冰箱中速凍15 min，按橫截面方向將心臟切成片狀，每片厚度1 mm。將切片放入2% TTC 溶液中，于37 ℃水浴鍋內避光染色20 min，每5 min 翻動1 次使染色均勻。將切片用4%多聚甲醛固定24 h 后拍照，非梗死區域呈紅色，梗死區域呈白色。通過Image J 軟件計算梗死面積。

2.6 試劑盒法檢測血清LDH 活性和IL-17、IL-6 水平 小鼠心肌缺血再灌注24 h 后，眼球取血，血液室溫靜置2 h，4 ℃、3 000 r/min 離心15 min，按試劑盒說明書檢測血清LDH 活性和IL-17、IL-6 水平。

2.7 RT-qPCR 法檢測心臟組織RORγtmRNA 表達 取適量小鼠心臟組織，按照試劑盒說明書提取總RNA 并逆轉錄為cDNA，進行實時熒光定量PCR 反應，條件為95 ℃預變性30 s，95 ℃變性10 s，60 ℃退火延伸30 s，采用2－ΔΔCT法計算RORγtmRNA 相對表達量。引物由生工生物工程（上海） 股份有限公司設計并合成，序列見表1。

表1 引物序列

2.8 Western blot 法檢測心臟組織RORγt 蛋白表達 取適量小鼠心臟組織，加入適量裂解液進行勻漿，4 ℃、12 000 r/min 離心30 min，取上清液，按BCA 試劑盒說明書檢測各樣品蛋白質濃度并調整樣品濃度。SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白質，濕轉法將蛋白轉移到聚偏二氟乙烯（PVDF） 膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h，與一抗（1 ∶1 000） 在4 ℃下孵育過夜，次日與二抗（1 ∶5 000） 在室溫下孵育1 h，用ECL 化學發光試劑顯影蛋白質電泳條帶，拍照并通過Image J 軟件進行條帶灰度值分析。以目的條帶灰度值與內參條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達量。

2.9 流式細胞術檢測外周血中Th17 和Treg 細胞比例 將等體積的淋巴細胞分離液緩慢加入小鼠全血中，在室溫下300×g離心10 min 獲取小鼠外周淋巴細胞懸液。按照試劑盒說明書加入刺激和抑制劑培養7 h，分別加入5 μL CD4 和CD25熒光抗體，4 ℃避光孵育30 min，用Fix/Perm 試劑透化后加入5 μL IL-17 和FoxP3 熒光抗體，4 ℃避光孵育30 min，將細胞重懸并通過流式細胞儀檢測。CD4＋IL-17＋細胞代表Th17細胞，而CD4＋CD25＋Foxp3＋細胞代表Treg 細胞。

2.10 統計學分析 通過SPSS 17.0 軟件進行處理，計量資料以（±s） 表示，組間比較采用單因素方差分析，方差齊采用LSD 方法檢驗； 方差不齊采用Dunnett’s T3 法檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 清熱化瘀方對I/R 損傷小鼠心功能的影響 如表2 所示，與假手術組比較，模型組小鼠左室射血分數和左室短軸縮短率降低（P＜0.05），左室收縮末內徑和舒張末內徑無明顯變化（P＞0.05）； 與模型組比較，清熱化瘀方中劑量組左室射血分數和左室短軸縮短率升高（P＜0.05），左室收縮末內徑和舒張末內徑無明顯變化（P＞0.05），清熱化瘀方低、高劑量組左室射血分數和左室短軸縮短率均有提升，但均無統計學差異（P＞0.05）。結果表明，清熱化瘀方中劑量組對于I/R 損傷具有保護作用。

表2 各組小鼠心功能比較（±s，n＝3）

表2 各組小鼠心功能比較（±s，n＝3）

注： 與假手術組比較，?P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05。

組別左室收縮末內徑/mm左室舒張末內徑/mm左室射血分數/%左室短軸縮短率/%假手術組2.40±0.043.75±0.0972.00±3.4636.33±2.88模型組2.19±0.942.62±1.1140.67±3.05?16.33±1.52?清熱化瘀方低劑量組2.88±0.363.59±0.3747.33±5.0320.00±3.00清熱化瘀方中劑量組2.62±0.283.36±0.3951.33±2.88＃22.00±1.73＃清熱化瘀方高劑量組2.62±0.853.22±1.1144.33±3.7818.33±2.08

3.2 清熱化瘀方對I/R 損傷小鼠心臟組織病理改變的影響 如圖1 所示，假手術組小鼠心肌組織的結構正常，心肌排列整齊有序，細胞間隙分明，肌膜完整； 模型組小鼠心肌組織損傷增加，結構異常，心肌細胞排列紊亂，細胞間質水腫增加，炎性細胞浸潤； 清熱化瘀方各劑量組小鼠心肌細胞結構異常，病理改變減輕。

圖1 各組小鼠心臟組織病理形態（HE，×200）

3.3 清熱化瘀方對I/R 損傷小鼠心肌梗死面積的影響 如圖2、表3 所示，與假手術組比較，模型組小鼠心肌梗死面積增大（P＜0.05）； 與模型組比較，清熱化瘀方各劑量組小鼠心肌梗面積均減?。≒＜0.05）； 與清熱化瘀方中劑量組比較，清熱化瘀方高劑量組心肌梗死面積增大 （P＜0.05）。結果表明，清熱化瘀方可以縮小小鼠心臟梗死面積。

圖2 各組小鼠心臟組織TTC 染色

表3 各組小鼠心臟梗死面積比較（±s，n＝3）

表3 各組小鼠心臟梗死面積比較（±s，n＝3）

注： 與假手術組比較，?P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05； 與清熱化瘀方中劑量組比較，＆P＜0.05。

組別梗死面積/%假手術組2.00±1.08模型組36.60±2.98?清熱化瘀方低劑量組25.07±1.72＃清熱化瘀方中劑量組21.13±2.31＃清熱化瘀方高劑量組29.23±1.61＃＆

3.4 清熱化瘀方對I/R 損傷小鼠血清LDH 活性和IL-17、IL-6 水平的影響 如表4 所示，與假手術組比較，模型組小鼠血清LDH 活性升高（P＜0.05）； 與模型組比較，清熱化瘀方各劑量組小鼠血清LDH 活性均降低（P＜0.05），提示清熱化瘀方可以減少細胞的損傷和LDH 釋放。與假手術組比較，模型組小鼠血清IL-17、IL-6 水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，清熱化瘀方各劑量組小鼠血清IL-17、IL-6水平均降低（P＜0.05）； 與清熱化瘀方高劑量組比較，清熱化瘀方低、中劑量組小鼠血清IL-6 水平降低（P＜0.05）。

表4 各組小鼠血清LDH 活性和IL-17、IL-6 水平比較（±s，n＝6）

表4 各組小鼠血清LDH 活性和IL-17、IL-6 水平比較（±s，n＝6）

注： 與假手術組比較，?P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05； 與清熱化瘀方高劑量組比較，ΔP＜0.05。

組別LDH/（U·L－1）IL-17/（pg·mL－1）IL-6/（pg·mL－1）假手術組501.77±103.330.59±0.1328.54±9.76模型組1 475.43±178.28?1.26±0.36?93.37±16.24?清熱化瘀方低劑量組982.20±124.94＃0.85±0.12＃52.21±11.32＃Δ清熱化瘀方中劑量組891.61±136.58＃0.74±0.05＃47.66±9.37＃Δ清熱化瘀方高劑量組936.35±73.20＃0.76±0.15＃81.37±11.14＃

3.5 清熱化瘀方對I/R 損傷小鼠心臟組織RORγtmRNA 表達的影響 如表5 所示，與假手術組比較，模型組小鼠心臟組織RORγtmRNA 表達升高，但差異無統計學意義（P＞0.05）； 與模型組比較，清熱化瘀方各劑量組小鼠心臟組織RORγtmRNA 表達降低（P＜0.05）。

表5 各組小鼠心臟組織RORγt mRNA 表達比較（±s，n＝3）

表5 各組小鼠心臟組織RORγt mRNA 表達比較（±s，n＝3）

注： 與模型組比較，＃P＜0.05。

組別RORγt mRNA 表達假手術組1.02±0.28模型組1.34±0.19清熱化瘀方低劑量組0.44±0.14＃清熱化瘀方中劑量組0.51±0.32＃清熱化瘀方高劑量組0.46±0.06＃

3.6 清熱化瘀方對I/R 損傷小鼠心臟組織RORγt 蛋白表達的影響 如圖3、表6 所示，與假手術組比較，模型組小鼠心臟組織RORγt 蛋白表達升高（P＜0.05）； 與模型組比較，清熱化瘀方各劑量組小鼠心臟組織RORγt 蛋白表達降低（P＜0.05）； 與清熱化瘀方高劑量組比較，清熱化瘀方低、中劑量組小鼠心臟組織RORγt 蛋白表達降低（P＜0.05）。

圖3 各組小鼠心臟組織RORγt 蛋白條帶圖

表6 各組小鼠心臟組織RORγt 蛋白表達比較（±s，n＝3）

表6 各組小鼠心臟組織RORγt 蛋白表達比較（±s，n＝3）

注： 與假手術組比較，?P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05； 與清熱化瘀方高劑量組比較，ΔP＜0.05。

組別RORγt 蛋白表達假手術組0.24±0.002模型組0.31±0.003?清熱化瘀方低劑量組0.24±0.002＃Δ清熱化瘀方中劑量組0.24±0.008＃Δ清熱化瘀方高劑量組0.32±0.005＃

3.7 清熱化瘀方對I/R 損傷小鼠外周血中Th17、Treg 細胞比例和Th17/Treg 平衡的影響 如圖4～5、表7 所示，與假手術組比較，模型組小鼠外周血中Th17 細胞占比和Th17/Treg 比值升高（P＜0.05），Treg 細胞占比降低，但無統計學意義（P＞0.05）； 與模型組比較，清熱化瘀方低劑量組小鼠Th17 細胞占比降低（P＜0.05），高劑量組Treg 細胞占比升高 （P＜0.05），低、中劑量組Th17/Treg 比值降低（P＜0.05）。結果表明，清熱化瘀方可能通過恢復Th17 和Treg 細胞的平衡對心肌I/R 損傷起修復作用。

圖4 各組小鼠外周血中Th17 細胞比例

表7 各組小鼠外周血中Th17、Treg 細胞比例和Th17/Treg 比值比較（±s，n＝3）

表7 各組小鼠外周血中Th17、Treg 細胞比例和Th17/Treg 比值比較（±s，n＝3）

注： 與假手術組比較，?P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05。

組別Th17/%Treg/%Th17/Treg假手術組4.66±1.735.06±2.310.96±0.18模型組12.76±4.44?3.90±1.373.26±0.15?清熱化瘀方低劑量組 5.58±0.15＃4.64±1.281.25±0.28＃清熱化瘀方中劑量組10.60±0.435.75±0.481.84±0.08＃清熱化瘀方高劑量組15.20±1.476.68±0.20＃2.27±0.27

4 討論

心肌I/R 損傷是在開展介入治療之后才被提出并逐漸受到關注，因此古代并無此病。隨著研究不斷深入，I/R 與熱毒學說的關系越來越受到重視［9］?！督饏T要略心典》 曰： “毒者，邪氣蘊結不解之謂?！?邪聚則日久成毒，毒聚則日久成疾，體現了外邪致病的變化規律。而熱邪蘊結成毒者，雖然臨床上表現出熱瘀并重，但實則熱重于瘀。楊超等［10］從血液成分和流變分析了 “熱毒血瘀” 的表征，發現缺血、缺氧、血瘀和變性的根本原因在于炎癥反應。

清熱化瘀方由9 味中藥組成，該方中君藥黃連和黃芩清熱瀉火； 臣藥大黃清熱解毒、活血化瘀，牡丹皮清熱活血； 佐藥陳皮健脾化痰，諸藥合用，共奏清熱解毒、活血化瘀之效?，F代藥理學研究表明，黃芩具有減輕心肌缺血再灌注損傷的作用，還能抗炎、抗氧化、抑制心肌纖維化及抑制平滑肌細胞的增殖［11］； 黃芩中的有效成分黃芩素被證實具有抑制TNF-α、IL-1β、IL-6 和PAI-1 等炎癥因子及NF-κB 信號通路的表達，減少心肌細胞損傷的作用［12-14］。黃連素可以通過下調TNF-α、IL-1β、IL-6 水平，增加血液中NO 水平保護冠心病大鼠血管內皮細胞［15］。清熱化瘀法治療心肌I/R 損傷具有較好的應用前景。

本研究發現，清熱化瘀方可以提高小鼠左心功能，縮小心肌梗死面積，降低外周血中損傷標志物LDH 活性和炎性因子IL-6、IL-17 水平，恢復Th17/Treg 平衡，提示清熱化瘀方對小鼠心肌缺血再灌注損傷有保護作用。在生理條件下，T 細胞亞群之間維持著相對動態平衡，這種自穩態在疾病的發生發展中起重要作用［16］，T 細胞缺失的小鼠疾病模型已經證明了T 細胞在缺血［17］和心肌梗死［18-19］中的關鍵作用。Th17 細胞是第3 個被發現并被描述的T 輔助細胞亞群，以分泌IL-17 為主的促炎細胞，關鍵性地參與到炎癥反應中［20］。Th17 的分化離不開IL-6，IL-6 可直接作用于T細胞，通過信號轉導gp130 的酪氨酸殘基誘導STAT3 激活。STAT3 可以誘導Th17 細胞特異性轉錄因子RORγt 的表達，促進Th17 細胞的分化［21］。Th17 分泌的炎癥因子IL-17 能促進急性心肌梗死后的炎癥反應，引起心肌肥大和心室重構［22］。與Th17 細胞促炎相對應的，Treg 細胞是另一群起炎癥抑制作用并維持機體免疫穩態的重要T 細胞亞群，越來越多的研究表明Treg 細胞在I/R 損傷后的心臟修復中發揮重要作用［23］。因此，識別和開發一種激活Treg 細胞增殖或抑制Th17 細胞分化的選擇性免疫調節制劑或將成為抗I/R 損傷的潛在治療策略。本研究發現，清熱化瘀方可恢復Th17/Treg 平衡。

綜上所述，清熱化瘀方對于心肌I/R 損傷的保護作用可能與調節Th17 細胞及Th17/Treg 免疫平衡有關，更確切的調控機制還有待進一步研究。