枸杞多糖調節Nrf2/HO-1/GPX4 鐵死亡途徑對妊娠期糖尿病大鼠胰島素抵抗的改善作用

張翠翠，謝 玲，孫文萍

（青海紅十字醫院產一科，青海 西寧 810099）

妊娠期糖尿?。℅DM） 是首次出現在妊娠期的糖尿病，胰島素抵抗是其主要病理特征，可阻礙機體有效利用胰島素，導致血糖不受控地升高，嚴重影響胎兒生長發育，極大增加孕婦分娩結局不良的風險［1-2］。氧化應激和炎癥反應與GDM 患者胰島素抵抗的增強密切相關，可影響糖脂代謝，導致血糖升高，并引發高血脂及肥胖，通過抗炎、抗氧化和胰島素增敏可有效改善孕婦肥胖癥狀，利于胎兒發育及產婦安全分娩［3］。枸杞多糖是枸杞子的主要活性成分，可改善機體糖代謝紊亂［4］，并可通過抑制炎癥反應減輕糖尿病大鼠腎功能損傷［5］。鐵死亡在2 型糖尿病、GDM的發生發展過程中起到關鍵調控作用，抑制鐵死亡可減弱胰腺β 細胞丟失和功能障礙［6］，減輕高糖刺激下的滋養層細胞氧化應激損傷，改善GDM 癥狀［7］。促進核因子E2 相關因子2 （Nrf2） /血紅素加氧酶-1 （HO-1） /谷胱甘肽過氧化酶4 （GPX4） 表達可抑制炎癥和過氧化反應，減輕細胞鐵死亡，改善糖尿病腎病癥狀［8］。因此Nrf2/HO-1/GPX4信號可做為防治GDM 的潛在作用靶點，但枸杞多糖是否可通過調節該途徑改善GDM 大鼠胰島素抵抗，目前還尚未研究清楚。本研究以枸杞多糖干預GDM 大鼠，探究其作用機制，以期為其深入研究提供依據。

1 材料

1.1 動物 SPF 級SD 大鼠購自湖北省實驗動物研究中心，實驗動物生產許可證號SCXK （鄂） 2015-0018，雌雄比例為2 ∶1，雄性體質量190～210 g，雌性體質量170 ～190 g。嚴格遵循《中華人民共和國實驗動物管理條例》 的規定，并經過青海紅十字醫院動物倫理委員會批準 （倫理號202102-11），于青海紅十字醫院動物中心分籠適應飼養，實驗動物使用許可證號SYXK （青） 2020-0001，每籠5 ～6只，實驗操作均符合3R 原則。

1.2 試劑與藥物 枸杞多糖 （純度≥90%，批號20170523），生理鹽水溶解混勻，制得質量濃度為10、20、40 mg/mL 的枸杞多糖藥液［9］； 鐵死亡抑制劑ferrostatin-1（純度＞98.00%，批號20160213），生理鹽水溶解混勻，制得質量濃度為0.07 mg/mL 的ferrostatin-1 藥液［10］。鏈脲佐菌素（純度≥98%，批號20190406） 購自北京索萊寶科技有限公司； ML385 （純度＞98.00%，批號20150427） 購自美國Glpbio 公司； 全蛋白提取試劑盒（批號20180426）、白細胞介素-6 （IL-6） 測試盒（批號20141120）、羊抗兔二抗（批號20170711）、白細胞介素-18 （IL-18） 測試盒（批號20181105）、BCA 法總蛋白定量檢測試劑盒 （批號20180921） 購自南京建成生物工程研究所有限公司； 丙二醛（MDA） 試劑盒 （批號20190610）、超氧化物歧化酶（SOD） 試劑盒（批號20190421）、兔源β-actin 一抗（批號20131103） 購自上海碧云天生物技術有限公司； 兔源長鏈脂酰輔酶A 合成酶4 （ACSL4） 一抗（批號20150622）、兔源環加氧酶2 （PTGS2） 一抗（批號20160321）、兔源Nrf2 一抗 （批號20140724）、兔源GPX4 一抗 （批號20140724）、兔源HO-1 一抗（批號20190417） 購自英國Abcam 公司。

1.3 儀器 全自動干式生化分析儀（型號SD1） 購自成都斯馬特科技有限公司； 葡萄糖/乳酸分析儀（型號BIOSEN C＿Line） 購自北京德?？悼瀑Q有限公司； 多功能酶標儀（型號SpectraMax iD3） 購自美國Molecular Devices 公司；電泳儀（型號JS-power600）、化學發光成像系統（型號JS-1070P） 購自上海培清科技有限公司； 快速濕轉儀（型號eBlot L1） 購自南京貝登醫療股份有限公司。

2 方法

2.1 GDM 大鼠模型制備及分組干預 以2 ∶1 的比例將性成熟雌、雄大鼠合籠，次日檢查陰栓即得到孕鼠43 只，標記為妊娠第1 天，同時腹腔注射45 mg/kg 鏈脲佐菌素（以檸檬酸緩沖液溶解），3 d 后采集尾靜脈血，檢測空腹血糖（FBG），選擇FBG≥16.7 mmol/L 的孕鼠作為造模成功大鼠進入后續實驗［11］。40 只造模成功的大鼠以隨機數表法分為模型組，枸杞多糖低、中、高劑量組（100、200、400 mg/kg），ferrostatin-1 組（0.7 mg/kg），每組8 只。另設對照組注射等體積檸檬酸緩沖液。

枸杞多糖各劑量組孕鼠分別灌胃給予枸杞多糖藥液10 mL/kg，同時腹腔注射生理鹽水10 mL/kg； ferrostatin-1 組孕鼠灌胃給予生理鹽水10 mL/kg，同時腹腔注射ferrostatin-1 藥液10 mL/kg； 對照組、模型組孕鼠灌胃并腹腔注射給予生理鹽水10 mL/kg，各組孕鼠均于妊娠第4 天后給藥，每天1 次，連續14 d。

2.2 大鼠胰島素抵抗指數檢測 末次給藥24 h 后，采集各組大鼠尾靜脈血，葡萄糖/乳酸分析儀檢測FBG 水平，全自動分析儀檢測胰島素（FINS） 水平，計算胰島素抵抗指數（IRI），公式為IRI ＝FBG×FINS/22.5，評估胰島素抵抗水平。

2.3 大鼠IRI 和血脂檢測 按“2.1” 項下方法制備GDM大鼠模型，隨機分為模型組、枸杞多糖（400 mg/kg） 組、ML385 （Nrf2 抑制劑，30 mg/kg） 組、枸杞多糖 （400 mg/kg） ＋ML385 （30 mg/kg） 組，每組8 只； 另設對照組，注射等體積檸檬酸緩沖液。參照“2.1” 項下給藥方法分組給藥，枸杞多糖（灌胃） 與ML385 （腹腔注射）［12］的劑量分別為400、30 mg/kg，同樣于妊娠第4 天后給藥，每天1 次，連續14 d。

末次給藥24 h 后，采集各組大鼠尾靜脈血，檢測FBG、FINS 水平，并計算IRI，同時以全自動分析儀檢測孕鼠總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG） 水平。

2.4 大鼠母體與胎鼠體質量檢測 末次給藥24 h 后，各組大鼠置于乙醚氣體中麻醉，采集腹主動脈血1.3 mL，離心吸取上清，分組標記后于－80 ℃保存備用。測得各組孕鼠體質量后斷頭處死，打開子宮取出胎鼠，無流產記錄，計數胎鼠數目，測得所有胎鼠體質量后算出平均值，分離子宮內膜組織，剪下0.6 g 于液氮中保存備用。

2.5 ELISA 法檢測大鼠血清IL-18、IL-6、SOD、MDA 水平 以冰水浴溶解“2.4” 項下血清后，按照相關試劑盒說明書操作，檢測血清IL-18、IL-6、SOD、MDA 水平。

2.6 Western blot 法檢測大鼠PTGS2、ACSL4、Nrf2、HO-1、GPX4 蛋白表達 取各組大鼠液氮處理的子宮內膜組織，研碎，提取蛋白并定量后，每組取20 μg 總蛋白煮沸變性，上樣電泳，濕轉，以脫脂奶粉溶液封閉，經ACSL4、PTGS2、Nrf2、HO-1、GPX4 兔源一抗孵育、漂洗、羊抗兔二抗孵育、漂洗后，采用化學發光法顯影，通過化學發光成像系統采集蛋白條帶圖像，以β-actin 為內參，分析灰度值，計算各組蛋白相對表達量。

2.7 統計學分析 通過SPSS 24.0 軟件進行處理，數據以（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 枸杞多糖對GDM 大鼠FBG、FINS、IRI 的影響 與對照組比較，模型組大鼠FBG、FINS、IRI 升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠FBG、FINS、IRI 降低（P＜0.05），并且枸杞多糖作用呈劑量依賴性； 與枸杞多糖高劑量組比較，ferrostatin-1 組大鼠FBG、FINS、IRI 升高（P＜0.05），見表1。

表1 枸杞多糖對GDM 大鼠FBG、FINS、IRI 的影響（±s，n＝8）

表1 枸杞多糖對GDM 大鼠FBG、FINS、IRI 的影響（±s，n＝8）

注： 與對照組比較，?P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05； 與枸杞多糖高劑量組比較，＆P＜0.05。

組別FINS/（IU·L－1） FBG/（mmol·L－1）IRI對照組8.34±0.724.73±0.451.75±0.36模型組21.30±2.09?17.34±1.36? 16.42±1.87?枸杞多糖低劑量組 17.25±1.21＃13.26±1.04＃10.17±1.04＃枸杞多糖中劑量組 13.16±0.93＃9.17±0.68＃5.36±0.78＃枸杞多糖高劑量組 9.16±1.02＃5.32±0.47＃2.17±0.42＃ferrostatin-1 組13.08±1.07＃＆9.12±0.79＃＆5.30±0.86＃＆

3.2 抑制Nrf2 逆轉枸杞多糖對大鼠FBG、FINS、IRI 的影響 與對照組比較，模型組大鼠FBG、FINS、IRI 升高（P＜0.05）； 與模型組、枸杞多糖＋ML385 組比較，枸杞多糖組大鼠FBG、FINS、IRI 均降低（P＜0.05），ML385 組大鼠FBG、FINS、IRI 均升高（P＜0.05），見表2。

表2 抑制Nrf2 對GDM 大鼠FBG、FINS、IRI 的影響（±s，n＝8）

表2 抑制Nrf2 對GDM 大鼠FBG、FINS、IRI 的影響（±s，n＝8）

注： 與對照組比較，?P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05； 與枸杞多糖＋ML385 組比較，△P＜0.05。

組別FINS/（IU·L－1） FBG/（mmol·L－1）IRI對照組8.21±0.674.76±0.511.74±0.41模型組21.62±1.90?17.42±1.45?16.74±1.51?枸杞多糖組9.24±0.62?！?.53±0.34?！?.27±0.29?！鱉L385 組30.15±0.59?！?3.79±1.63?！?1.88±3.17?！麒坭蕉嗵牵玀L385 組 20.13±1.7216.81±1.0215.04±0.84

3.3 枸杞多糖對大鼠血脂水平的影響 與對照組比較，模型組大鼠血清TG、TC 水平升高（P＜0.05）； 與模型組、枸杞多糖＋ML385 組比較，枸杞多糖組大鼠血清TG、TC 水平降低（P＜0.05），ML385 組大鼠血清TG、TC 水平升高（P＜0.05），見表3。

表3 各組大鼠血清TG、TC 水平比較（±s，n＝8）

表3 各組大鼠血清TG、TC 水平比較（±s，n＝8）

注： 與對照組比較，?P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05； 與枸杞多糖＋ML385 組比較，△P＜0.05。

組別TG/（mmol·L－1）TC/（mmol·L－1）對照組0.45±0.091.41±0.32模型組1.71±0.18?6.83±0.75?枸杞多糖組0.50±0.14?！?.52±0.36?！鱉L385 組2.92±0.22?！?0.91±0.58?！麒坭蕉嗵牵玀L385 組1.64±0.136.41±0.62

3.4 枸杞多糖對大鼠母體及胎鼠體質量的影響 與對照組比較，模型組大鼠母體體質量、胎鼠體質量升高 （P＜0.05）； 與模型組、枸杞多糖＋ML385 組比較，枸杞多糖組大鼠母體體質量、胎鼠體質量降低（P＜0.05），ML385 組大鼠母體體質量、胎鼠體質量升高（P＜0.05），見表4。

表4 各組大鼠母體及胎鼠體質量比較（±s，n＝8）

表4 各組大鼠母體及胎鼠體質量比較（±s，n＝8）

注： 與對照組比較，?P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05； 與枸杞多糖＋ML385 組比較，△P＜0.05。

組別母體體質量/g 平均子鼠數量/只 胎鼠體質量/g對照組310.48±4.1210.50±1.844.22±0.15模型組361.23±5.36?11.13±1.685.70±0.42?枸杞多糖組315.02±6.03?！?0.75±1.524.84±0.36?！鱉L385 組389.78±3.92?！?0.25±1.466.85±0.39?！麒坭蕉嗵牵玀L385 組 356.84±3.2810.88±1.345.36±0.37

3.5 枸杞多糖對大鼠血清IL-6、IL-18、SOD、MDA 水平的影響 與對照組比較，模型組大鼠血清IL-6、IL-18、MDA 水平升高（P＜0.05），SOD 水平降低（P＜0.05）； 與模型組、枸杞多糖＋ML385 組比較，枸杞多糖組大鼠血清IL-6、IL-18、MDA 水平降低（P＜0.05），SOD 水平升高（P＜0.05），ML385 組大鼠血清IL-6、IL-18、MDA 水平升高（P＜0.05），SOD 水平降低（P＜0.05），見表5。

表5 各組大鼠血清IL-6、IL-18、SOD、MDA 水平比較（±s，n＝8）

表5 各組大鼠血清IL-6、IL-18、SOD、MDA 水平比較（±s，n＝8）

注： 與對照組比較，?P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05； 與枸杞多糖＋ML385 組比較，△P＜0.05。

組別IL-18/（ng·L－1）IL-6/（ng·L－1）SOD/（U·L－1）MDA/（nmol·L－1）對照組26.41±3.1250.63±9.8227.56±3.6413.81±2.24模型組58.67±6.03?189.75±34.21?10.02±1.13?36.92±4.13?枸杞多糖組28.52±3.96?！?9.02±10.25?！?4.97±4.01?！?5.62±2.46?！鱉L385 組79.24±8.31?！?53.18±15.93?！?.12±0.45?！?0.31±5.39?！麒坭蕉嗵牵玀L385 組56.13±4.02182.91±27.3611.93±1.2734.75±3.62

3.6 枸杞多糖對大鼠子宮內膜組織PTGS2、ACSL4、Nrf2、HO-1、GPX4 蛋白表達的影響 與對照組比較，模型組大鼠子宮內膜組織PTGS2、ACSL4 蛋白表達升高（P＜0.05），Nrf2、HO-1、GPX4 蛋白表達降低（P＜0.05）； 與模型組、枸杞多糖＋ML385 組比較，枸杞多糖組大鼠子宮內膜組織PTGS2、ACSL4 蛋白表達降低 （P＜0.05），Nrf2、HO-1、GPX4 蛋白表達升高（P＜0.05），ML385 組大鼠子宮內膜組織PTGS2、ACSL4 蛋白表達升高（P＜0.05），Nrf2、HO-1、GPX4 蛋白表達降低（P＜0.05），見圖1、表6。

圖1 各組大鼠子宮內膜組織ACSL4、PTGS2、Nrf2、HO-1、GPX4 蛋白條帶圖

表6 各組大鼠子宮內膜組織PTGS2、ACSL4、Nrf2、HO-1、GPX4 蛋白表達比較（±s，n＝8）

表6 各組大鼠子宮內膜組織PTGS2、ACSL4、Nrf2、HO-1、GPX4 蛋白表達比較（±s，n＝8）

注： 與對照組比較，?P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05； 與枸杞多糖＋ML385 組比較，△P＜0.05。

組別ACSL4PTGS2Nrf2HO-1GPX4對照組0.48±0.060.35±0.040.87±0.090.94±0.141.01±0.22模型組1.21±0.14?0.96±0.11?0.43±0.05?0.47±0.06?0.52±0.07?枸杞多糖組0.59±0.07?！?.43±0.05?！?.81±0.10?！?.90±0.12?！?.95±0.06?！鱉L385 組1.75±0.15?！?.41±0.18?！?.12±0.03?！?.13±0.02?！?.20±0.04?！麒坭蕉嗵牵玀L385 組1.16±0.130.92±0.160.45±0.070.51±0.100.54±0.12

4 討論

隨著生活水平提高，人們飲食結構改變，營養過剩普遍存在，我國GDM 發生率也逐年提升，嚴重威脅婦女生殖健康［13-14］。本研究于SD 大鼠腹腔內注射鏈脲佐霉素誘導建立GDM 模型，結果顯示鏈脲佐菌素注射可破壞胰島細胞功能，升高血糖血脂水平，促使炎性細胞因子合成釋放，進而引發炎癥與氧化應激，增加血中胰島素水平，造成胰島素抵抗，最終導致母體及胎鼠肥胖，體質量明顯增加，表明GDM 模型建立成功。

胰島素抵抗是引發糖脂代謝紊亂，促使GDM 發生的主要病理基礎，炎癥反應、氧化應激等多種致病因素參與其中，限制炎癥反應、降低氧化應激可提高胰島素敏感性，減輕GDM 孕婦高血糖癥狀［15-16］。枸杞多糖具有降糖降脂、抗氧化應激、消炎抑菌及增強免疫力等多種功效，能抑制NF-κB 信號激活，減少高糖誘導的促炎因子合成［17］，降低2 型糖尿病大鼠血糖并減弱其胰島素抵抗［18］。本實驗以不同劑量枸杞多糖處理GDM 大鼠，可降低FINS、FBG 水平及IRI，具有劑量依賴性，表明枸杞多糖可改善糖代謝紊亂，有效降低血糖水平，減弱胰島素抵抗。以高劑量枸杞多糖處理GDM 大鼠，不僅可降低FINS、FBG 水平及IRI，還可降低血脂及炎性細胞因子水平，減弱氧化應激，最終改善母體及胎鼠肥胖癥狀。

鐵死亡在GDM 的發病機制及病情發展中發揮著重要作用，減弱鐵死亡可減輕氧化應激損傷，有效改善GDM 大鼠子宮和胎盤功能失調［19］。本研究以鐵死亡特異性抑制劑ferrostatin-1 處理GDM 大鼠，可明顯降低FINS、FBG 水平及IRI，表明鐵死亡參與介導GDM 的發生發展，抑制鐵死亡可減輕GDM 大鼠胰島素抵抗，改善母體及胎鼠肥胖癥狀。Nrf2/HO-1/GPX4 信號可抑制早期炎癥和氧化應激，降低胰島細胞鐵死亡水平，改善胰島功能障礙，促使移植的胰島存活，有效治療1 型糖尿?。?0］。本研究以Nrf2 抑制劑ML385 處理GDM 大鼠，可降低Nrf2/HO-1/GPX4 通路蛋白表達，促使炎性細胞因子進一步合成釋放，升高氧化應激水平，使鐵死亡標志蛋白ACSL4［11］、PTGS2［19］表達升高，促進鐵死亡，加重孕鼠胰島素抵抗及肥胖癥狀。當ML385和枸杞多糖聯合處理GDM 大鼠，ML385 可減弱枸杞多糖對鐵死亡及胰島素抵抗的抑制作用，并逆轉其對GDM 大鼠母體及胎鼠健康的保護作用。

綜上所述，枸杞多糖可上調Nrf2/HO-1/GPX4 通路蛋白表達，從而減少炎性細胞因子合成釋放，減輕氧化應激，抑制鐵死亡途徑，增強胰島素敏感性，促使糖脂代謝恢復，減弱胰島素抵抗。本研究為枸杞多糖的臨床推廣應用、克服GDM 潛在危害、預防相關疾病進一步發展提供了新的科學依據，并為GDM 的防治做出了一定貢獻。