五苓散調控RAS 對阿霉素腎病綜合征大鼠腎損傷的保護作用

何 丹，李 強，陳少麗，都廣禮

（上海中醫藥大學基礎醫學院，上海 201203）

腎病綜合征是一系列以大量蛋白尿、低蛋白血癥、高脂血癥以及水腫為特征的腎臟疾病。該病并發癥多［1］、復發率高［2］，且發病機制未明。因此，探討腎病綜合征的發病機制，尋找安全有效的治療藥物顯得尤為重要［3］。

五苓散［4］出自《傷寒論》，由茯苓、豬苓、澤瀉、白術、桂枝組成，是治療陽不化氣，水濕內停之經典方劑。近年來，五苓散的應用已不局限于蓄水證。研究表明，五苓散對改善泌尿系統［5-6］、心血管系統［7］疾病有明顯優勢。桂枝是樟科植物肉桂的干燥嫩枝，具有利尿、改善血液循環、擴張血管等多種藥理活性［8］。徐靈胎在《醫學源流論·古方加減論》中指出： “五苓之妙，專在桂枝”，可見桂枝在全方中起著至關重要的作用。桂皮醛是桂枝的主要化學成分，具有保護心?。?］、調控血壓［10］、減輕血管內皮損傷［11］等藥理作用。課題組前期研究發現，桂枝是五苓散的“要藥”，桂皮醛是桂枝的重要活性成分，并對阿霉素腎病大鼠腎功能有保護作用［12-13］。

本研究通過阿霉素構建腎病綜合征大鼠模型，探討五苓散及其拆方以及單體桂皮醛對腎病綜合征模型大鼠的影響及其作用機制，以期為腎病綜合征的臨床治療提供理論基礎。

1 材料

1.1 動物 SPF 級雄性SD 大鼠70 只，6～8 周齡，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產許可證號SCXK （滬） 2020-0002。飼養環境為溫度19～26 ℃，相對濕度30% ～70%，12 h/12 h 明暗交替，自由飲食飲水。本研究已通過上海中醫藥大學實驗動物倫理委員會審查（倫理號PZSHUTCM190912007）。

1.2 藥物 鹽酸阿霉素（批號25316-40-9），購自上海沃凱化學試劑有限公司； 鹽酸貝那普利（批號X2603），購自北京諾華制藥有限公司。五苓散由豬苓9 g、茯苓9 g、澤瀉15 g、白術9 g、桂枝6 g 組成，所有飲片均購自康橋中藥飲片有限公司，經上海中醫藥大學都廣禮教授鑒定為正品，所有飲片浸泡1 h，煎煮30 min，旋轉蒸發濃縮，五苓散全方的給藥質量濃度為1.6 g/mL，五苓散去桂枝方的給藥質量濃度為1.4 g/mL，五苓散去桂枝加桂皮醛方的給藥質量濃度為1.403 g/mL。桂皮醛對照品（批號104-55-2），購自上海源葉生物科技有限公司。所有藥物以人臨床劑量3 倍給藥，并根據大鼠給藥換算公式計算，劑量為10 mL/kg。

1.3 試劑 尿素氮 （批號2020001）、肌酐 （批號2020003） 檢測試劑盒購自長春匯力生物技術有限公司； 尿蛋白檢測試劑盒（批號C035-2-1） 購自南京建成生物工程研究所有限公司； ACE （批號sc-23908）、ACE2 （批號sc-390851）、Ang-2 （批號sc-74402） 一抗，購自美國Santa Cruz Biotechnology 公司； GAPDH （批號60004-1-1g），購自美國Proteintech 公司； 山羊抗小鼠IgM 二抗 （批號L3032），購自美國Signalway Antibody 公司。

1.4 儀器 2-16PK 離心機購自美國Sigma-Aldrich 公司；Primo-Star 光學顯微鏡購自蔡司光學儀器（上海） 國際貿易有限公司； TS-8 搖床購自海門市其林貝爾儀器制造有限公司； Epoch 酶標檢測儀購自美國BioTek 公司。

2 方法

2.1 造模、分組及干預 70 只SD 大鼠按體質量隨機分組，取正常組10 只，其余大鼠分別于實驗第1 天和第8 天尾靜脈注射阿霉素3 mg/kg 構建SD 大鼠阿霉素腎病綜合征模型。造模成功后隨機分為模型組、五苓散組、五苓散去桂枝組、五苓散去桂枝加桂皮醛組、桂皮醛組、貝那普利組，每組10 只，灌胃給予相應藥物，具體灌胃劑量按每天體質量計算。其中，桂皮醛組給予26 mg/kg 桂皮醛溶液，貝那普利組給予12 mg/kg 貝那普利溶液。每天1 次，連續28 d。

2.2 檢測指標 最后一次給藥結束后收集大鼠24 h 尿液，腹主動脈取血于抗凝管，離心并收集血漿； 摘取腎臟，稱定質量，左腎平均剖開，一半于甲醛中固定，另一半用OCT 包埋； 右腎分成3 份冷凍保存。

2.2.1 24 h 尿量及尿蛋白水平 代謝籠收集各組大鼠24 h尿液后測定具體尿量，3 000 r/min 離心5 min，取上清，按照相關試劑盒說明書檢測尿蛋白水平。

2.2.2 腎功能指標 按照相關試劑盒說明書檢測血漿中肌酐、尿素氮水平。

2.2.3 Western blot 法檢測腎組織ACE、ACE2、Ang-2 蛋白表達 切取冷凍保存的腎臟組織，稱定質量后放入1.5 mL 離心管，用剪刀將組織剪碎，加入裂解液，在冰上靜置35 min，研磨，離心后取上清，用BCA 法進行蛋白定量。常規電泳、轉膜，加入ACE、ACE2、Ang-2、GAPDH 一抗（1 ∶200） 37 ℃孵育1.5 h，洗膜后，室溫加入山羊抗小鼠IgM 二抗37 ℃孵育45 min，洗膜，以GAPDH 為內參，用Image J 軟件進行條帶灰度值定量分析。

2.3 統計學分析 通過GraphPad Prism 8.0.1 軟件進行處理，若為正態分布，數據以（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用TUKEY 法； 若不符合正態分布，用中位數及四分位數間距M（Q1，Q3） 進行統計描述，采用Kruskal-Wallis H 秩和檢驗，方差不齊時采用T2 檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 五苓散對大鼠24 h 尿量、尿蛋白水平的影響 如圖1所示，與正常組比較，模型組大鼠尿蛋白水平升高（P＜0.01），24 h 尿量減少（P＜0.01），表明阿霉素腎病綜合征大鼠模型構建成功； 與模型組比較，五苓散去桂枝加桂皮醛組、桂皮醛組、貝那普利組大鼠尿蛋白水平降低（P＜0.05，P＜0.01）。

圖1 各組大鼠24 h 尿量、尿蛋白水平比較（±s，n＝3）

3.2 五苓散對大鼠腎功能的影響 如圖2 所示，與正常組比較，模型組大鼠肌酐、尿素氮水平升高（P＜0.01）； 與模型組比較，五苓散去桂枝加桂皮醛組、桂皮醛組、貝那普利組大鼠肌酐、尿素氮水平降低（P＜0.05，P＜0.01）。

圖2 各組大鼠肌酐、尿素氮水平比較（±s，n＝3）

3.3 五苓散對大鼠腎組織ACE、ACE2、Ang-2 蛋白表達的影響 如圖3 所示，與正常組比較，模型組大鼠ACE、Ang-2 蛋白表達升高（P＜0.01），ACE2 蛋白表達降低（P＜0.01）； 與模型組比較，五苓散去桂枝加桂皮醛組、桂皮醛組、貝那普利組大鼠ACE、Ang-2 蛋白表達降低（P＜0.05，P＜0.01），ACE2 蛋白表達升高（P＜0.05，P＜0.01）。

圖3 各組大鼠腎組織ACE、ACE2、Ang-2 蛋白表達比較（±s，n＝3）

4 討論

腎病綜合征在中醫上被歸為“水腫” “水氣” 等范疇，其治療原則主要應側重于通陽利水［14］。五苓散是治療陽不化氣，水濕內停之經典方劑，常用于泌尿系統［5-6］、心血管系統［7］等疾病的治療。桂枝是五苓散的“要藥”，桂皮醛是桂枝的重要活性成分。

腎素血管緊張素系統（RAS） 的主要功能是調節和維持人體血壓、水、電解質的平衡，是參與高血壓發病的重要機制［15］。血管緊張素轉換酶（ACE） 是RAS 的關鍵組成部分，肝臟釋放的血管緊張素原被腎素水解為血管緊張素1（Ang-1） 后，可被ACE 裂解產生血管緊張素2 （Ang-2）［16］。而Ang-2 主要有血管收縮、水鈉潴留、醛固酮釋放等作用［17-21］。血管緊張素轉化酶2 （ACE2） 是ACE 的同源物［22-23］，主要在腎臟血管內皮和腎小管上皮中表達［24］，能減少體內Ang-2 表達，從而具有內源性ACE 抑制劑的作用，進而降低血壓，減輕腎損傷［25］。已有研究表明，阻斷RAS對腎臟具有保護作用［26］。

腎病綜合征可導致高血壓的發生，而高血壓又會進一步造成腎臟損害，兩者相互作用，促使疾病不斷發展［27-28］。蛋白尿是腎病綜合征的主要表現，高血壓的發生會加重蛋白尿［29］。研究表明，RAS 與血壓、腎損傷和尿蛋白密切相關，可通過降低血壓來減少腎損傷和蛋白尿［30］。其中，Ang-2 是參與疾病發展的主要因素［31］。

本實驗采用阿霉素成功復制了腎病綜合征大鼠模型。研究發現，五苓散去桂枝加桂皮醛、桂皮醛、貝那普利可降低阿霉素腎病綜合征大鼠尿蛋白、肌酐、尿素氮含量，降低ACE、Ang-2 表達，同時使ACE2 表達升高。但五苓散組及五苓散去桂枝組未見尿蛋白、肌酐、尿素氮水平降低，ACE、Ang-2 表達降低及ACE2 表達升高。

綜上所述，桂皮醛是五苓散發揮抗腎病綜合征的主要活性成分，對阿霉素腎病綜合征大鼠有一定的腎臟保護作用，其作用機制可能與RAS 信號通路有關。