甲真菌病的真菌學檢測方法研究進展

曹冰瑩, 廖德君,2, 楊茜, 楊政敏

1.黔南民族醫學高等?？茖W校,2.黔南州人體寄生蟲病研究重點實驗室,貴州 都勻 558000

甲真菌病(onychomycosis)是最常見的指(趾)甲疾病,由皮膚癬菌、酵母菌和非皮膚癬菌性霉菌侵犯甲板和(或)甲床所致[1],以甲顏色改變、甲下角化過度、甲肥厚和甲分離為主要臨床特征[2]。該病呈全球分布,在世界范圍內的患病率為5.5%,占臨床上所有指甲疾病的50%[3],被認為是全球分布的主要公共衛生問題之一。目前臨床上甲真菌病的真菌學診斷仍以傳統的真菌培養、直接鏡檢、組織病理檢查為主[1],這些方法靈敏度較低,耗時長,不能鑒定真菌種類,不利于甲真菌病的早期診斷和分類治療。近年來,精確到屬、種的真菌學檢查方法層出不窮,已成為真菌分類學研究的熱點。本文現對甲真菌病的真菌學檢測方法的研究進展進行綜述。

1 傳統檢測方法

以直接鏡檢、真菌培養和組織病理檢查為主的傳統診斷技術被廣泛地應用于臨床診斷工作中,仍是甲真菌病真菌學診斷的主要手段。

1.1 直接鏡檢

1.1.1 KOH溶甲鏡檢法 該方法是利用10%～20%氫氧化鉀(KOH)溶液溶解標本病甲后,借助顯微鏡進行形態學診斷。該方法簡便,費用低,可在1 h內出具診斷結果,因此被廣泛地應用在臨床中[4-9]。然而該方法的診斷容易受病甲標本采集質量和檢驗技術水平的影響,并且僅能確定真菌是否存在而不能明確真菌的種類。

1.1.2 熒光染色鏡檢法 該方法是使用真菌熒光染色劑浸染病甲碎片標本后,在熒光顯微鏡下進行觀察診斷。該方法可增強顯示病甲中的真菌結構,更易被檢查者觀察發現,因此其靈敏度與KOH溶甲鏡檢法相比顯著提升[10-11]。該法具有簡便、無創、檢出率高等優點,但也不能確定病原真菌的種類。

1.2 真菌培養

1.2.1 普通培養 真菌培養是指使用沙氏培養基、馬鈴薯培養基等不同培養基在25～30 ℃下對病甲進行培養2至4周,通過肉眼觀察菌落特征和(或)使用顯微鏡觀察真菌的孢子、菌絲等形態學特征來診斷,可以鑒別病原真菌的種類以及判斷其活力[9, 12-14]。該法特異性強,靈敏度較高,可以提供有關真菌活性信息、鑒定真菌種類以及真菌藥敏情況,有助于臨床診療工作。真菌培養是一項操作相對復雜、耗時、成本較高的診斷方法,其可靠性很大程度上取決于檢測中心的專業性。此外,真菌培養容易受霉菌的污染,對霉菌所致的甲真菌病常需要重復培養3次方可確定。

1.2.2 顯色培養及生化反應 兩者主要可用于酵母菌的鑒定。顯色培養是通過菌落顏色來鑒定菌種,該法能鑒定出超過90%的致病性酵母菌,如白念珠菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌等[15]。鑒定酵母菌種屬的生化反應試驗一般包括尿素酶、海藻糖、酚氧化酶、糖同化、糖發酵、硝酸鹽試驗。目前,臨床上已有基于生化反應的酵母菌自動化鑒定系統,可以將臨床常見的酵母樣真菌鑒定到種水平,對酵母菌的鑒定能力明顯優于顯色培養,且與新興的分子鑒定技術有很好的一致性[16]。

1.3 甲組織病理學檢查

甲組織病理學檢查使用組織染色對甲標本進行染色后觀察,可以獲得真菌感染的直接證據。該技術可使用過碘酸雪夫染色法(periodic acid-schiff stain,PAS)或六胺銀染色(grocott methenamine silver stain,GMS)對真菌菌體進行染色,以增加顯微鏡檢查時的能見度[17-19]。實施甲組織病理學檢查需要大量的實驗室準備,如甲組織固定、脫水、包埋、切片等。雖然組織病理學是傳統甲真菌病診斷方法中最敏感的,但它并不能鑒定致病真菌種類,且存在操作復雜、耗時較長、標本需要量多、實施條件高等問題,導致其在臨床診斷工作中逐步被其他診斷技術所替代。

2 新興檢測技術

2.1 免疫學檢測技術

由于致病真菌僅在被侵犯的甲板內生長繁殖,人體免疫系統難以產生有效的免疫應答,因此認為真菌特異性抗體檢測不是甲真菌病病原檢查的最好方案,而真菌特異性抗原檢測是診斷甲板真菌感染的可行方案,其能快速提供檢測結果,在甲真菌病病原診斷和流行病學調查等領域具有重要價值。

2.1.1 免疫層析法(immunochromatography,ICA) 該法是一種利用特異性抗體檢測病甲中真菌抗原的免疫學診斷方法,如膠體金法、側流免疫層析法(lateral flow immunochromatographic assay,LFIA)等。日本學者利用膠體金技術開發了一種可檢測絕大部分甲真菌病病原真菌的體外診斷試劑盒,其靈敏度高達98.0%,而特異度為88.2%[20]。Tsuboi等[21]應用側流免疫層析法對甲真菌病患者進行紅色毛癬菌特異性抗原檢測,結果顯示,在不能檢測其他真菌的情況下,該方法靈敏度和特異度分別為84.8%和83.9%。該法用目視即可完成檢測結果的判斷,對檢測人員和檢測設備的要求不高,可用于疾病初篩和流行病學調查,但由于缺少大數據的方法學研究,因此尚未取得臨床的認可。

2.1.2 酶聯免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA) 酶聯免疫吸附測定指將可溶性的抗原或抗體結合到聚苯乙烯等固相載體上,利用抗原抗體特異性結合進行免疫反應的定性和定量檢測方法。Méhul等[22]用重組的紅色毛癬菌和趾間毛癬菌的類枯草桿菌蛋白酶6(subtilisin-like protease 6,Sub6)作為抗原分別制備了Sub6的兔抗血清和小鼠單克隆抗體,并應用ELISA(雙抗體夾心法)對患者進行了檢測,顯示出該方法具有較高的靈敏度和特異度。

2.2 基于PCR的分子生物學鑒定技術

生物學鑒定技術主要有常規聚合酶鏈式反應(PCR),熒光實時定量PCR(RT-PCR),巢式PCR(nest-PCR),多重 PCR(mutiplex -PCR),限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應(PCR-RFLP)等,具有敏感性高、檢測快、不受檢測人員形態學鑒定水平的限制等優點,有廣闊的應用前景。

2.2.1 PCR 是一種利用特異性引物擴增DNA片段來鑒定真菌的分子生物學技術,即用真菌特異的分子引物來擴增測試樣品中的真菌DNA,以鑒定真菌生物亞型,具有較高的敏感度和特異度[23-24]。該法在鏡檢陽性但真菌培養陰性的疑似患者標本的檢測中顯示出巨大的優勢,但在應用該法時需要考慮成本、假陽性、假陰性以及污染的可能。

2.2.2 RT-PCR 是一種使用不同的特異性引物,結合探針作為染料,直接從臨床樣本中檢測出一種或多種皮膚癬菌的分子方法。應用RT-PCR法可顯著提高甲真菌病致病菌的檢出率,可將真菌鑒定精確至屬種水平[24-27]。該方法在其他病原生物的診斷上已經取得臨床工作者的認可,是一種很有應用前景的診斷技術。

2.2.3 nest-PCR 巢式PCR技術由初級和次級擴增組成,初級擴增的產物用作次級擴增的模板,以提高特異度和靈敏度[28-29]。楊靜等[30]基于28 S rRNA基因序列的巢式PCR方法快速檢測甲真菌病真菌種類,巢式PCR敏感性為93.33% (168/180),特異性為100% (168/168)。巢式PCR因涉及兩次擴增步驟,污染風險更高。

2.2.4 PCR-RFLP 是一種擴增含有小規模遺傳變異核酸的特定片段,然后用適當的限制性內切酶處理,根據片段的電泳結果進行鑒定的技術。目前,PCR-RFLP已經能夠直接從指甲、皮膚或頭發樣本中成功檢測到紅色毛癬菌和須癬毛癬菌[31-32]。PCR-RFLP簡便、經濟、不依賴先進的儀器設備,但是需要限制性內切酶、操作復雜以及耗時費力的缺點限制了其在臨床上的應用。

2.2.5 PCR-酶聯免疫吸附試驗(polymerase chain reaction-enzyme-linked immunosorbent assay,PCR-ELISA) 是一種應用ELISA方法檢測PCR產物的定量試驗。這一技術相對于傳統的凝膠光密度定量,在靈敏度、特異度、準確度上有很大的提升,可滿足臨床診斷甲真菌感染的要求,并且只要有擴增儀和酶標儀就可以進行。但有研究發現,PCR-ELISA應用于甲真菌病的致病菌診斷及鑒定時,其檢出率并未體現出巨大的優勢[33]。Savin等[34]對法國生產的一種甲真菌病PCR-ELISA診斷試劑進行評估,結果發現在經真菌學證實的患者標本中僅有86.3%的檢出率,且未能鑒定至屬、種水平。因此,該法仍需在檢出效能和種屬鑒定上繼續探索。

2.3 基因芯片技術(gene chip)

基因芯片技術是同時將大量的探針分子固定到固相支持物上,借助核酸分子雜交配對的特性對DNA樣品的序列信息進行高效的解讀和分析,包括寡核苷酸微陣列(Oligo-microarray)及DNA微陣列(DNA microarray)。目前該技術已被廣泛應用到各種病原生物的檢測中,具有高通量、速度快、靈敏度和特異度高等優點。Han 等[35]基于真菌rRNA ITS序列設計了一組DNA微陣列,以真菌培養為金標準,其陽性預測值和陰性預測值顯著高于真菌培養法,且檢測時間不超過24 h?；蛐酒夹g僅需要18 h就可以1次檢測50多種不同的微生物,靈敏度明顯高于直接鏡檢法和培養法[36]?；蛐酒夹g可同時檢測多個基因表達譜,在分子診斷和研究上有巨大潛力,但技術復雜,操作難度高,單次檢測成本較高,還存在誤差和可重復性差的局限,故該技術需在成本與質量控制上進一步探索。

2.4 恒溫核酸擴增技術

環介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)與常規PCR相比,不需要模板的熱變性、溫度循環、電泳及紫外觀察等過程。該技術在靈敏度、特異性和檢測范圍等指標上能媲美甚至優于PCR技術,不依賴任何專門的儀器設備實現現場高通量快速檢測,檢測成本遠低于熒光定量PCR,具有簡單、快速、特異性強的特點,目前已成功地應用于分子生物學領域。已有學者成功應用LAMP技術鑒定出甲真菌病患者的病原真菌,并顯示出極高的靈敏度和特異度[37],但該技術仍處于初級階段,還存在非特異性擴增產物不易鑒別等問題,故目前應用LAMP技術鑒別病原真菌的研究較少,其未來發展潛力巨大。

2.5 基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)

MALDI-TOF MS 是一種基于蛋白質組學的研究技術,能夠直接測定蛋白質、多肽、核酸、寡糖等生物大分子。臨床標本經分離和純培養后,可通過質譜技術獲得可疑菌落病原體的蛋白質譜峰圖,將其與數據庫中參考光譜的特征峰進行對比,即可得到鑒定結果,匹配度越高,結果越可信。目前,已有學者成功應用這項技術對甲真菌病病原真菌進行了種屬鑒定,顯示出較高的靈敏度和特異度[38-39]。但此方法受限于真菌的分離與培養,因此并不能用于培養陰性的標本檢測。此外,質譜檢測技術還受圖譜庫的豐度、提取方法等因素的影響。

2.6 光譜學鑒定

2.6.1 紅外光譜分析 紅外吸收光譜是利用物質對不同頻率紅外光的吸收特性,獲得分子內化學鍵、官能團的振動和轉動信息進行物質分析鑒定的方法。隨著傅里葉變換紅外光譜學技術(frourier transform infrared spectroscopy,FTIR)的出現和衰減全反射技術(attenuated total refraction,ATR)的應用,紅外光譜分析技術逐步開始在微生物檢測領域廣泛應用。De Bruyne 等[40]利用ATR-FTIR譜技術成功用于探測、鑒定甲真菌病體外模型和活體甲標本中的致病菌至屬或種的水平。與目前其他致病真菌檢測方法相比,紅外光譜技術具有適用范圍廣、判斷準確、快捷、費用低的特點,具有廣闊的臨床應用前景,但仍需解決真菌培養方法及預處理過程的標準化、設備成本的優化、致病真菌紅外光譜參考數據庫的建立和分析方法的程序化等問題。

2.6.2 拉曼光譜分析 拉曼光譜分析法是基于拉曼散射光譜,對與入射光頻率不同的散射光譜進行分析以得到分子振動、轉動方面信息,并應用于分子結構研究的一種分析方法。利用已構建的生物大分子拉曼光譜數據庫[41],學者們運用拉曼光譜分析可以準確地鑒定出皮膚癬菌、酵母菌和霉菌,并且可以達到屬、種甚至菌株水平[42-44]。Smijs 等[45]應用拉曼光譜分析技術對厚為50 μm的人離體甲感染模型進行分析,準確鑒定出紅色毛癬菌、白念珠菌、短帚霉等常見的甲真菌病病原體。該方法用于致病真菌的檢測時具有很多優勢:標本需要量少,靈敏度高,可達單個孢子水平;能直接使用固體培養基上的菌落,無需樣本標記或染色等預處理,耗材少;操作簡便,測定時間短等。但此方法也存在試驗條件與設備要求高,數據庫缺乏和數據分析繁瑣,部分相似的菌種難以區分等問題。

3 傳統檢測方法與新興檢測技術的比較

以直接鏡檢、真菌培養和病理組織檢查為主的傳統診斷技術被廣泛地應用于臨床診斷工作中,仍是甲真菌病真菌學診斷的主要手段。然而傳統技術在真菌種屬的鑒定上存在明顯的局限,主要體現為嚴重依賴檢測人員的技術水平和檢測周期過長。免疫學診斷、分子生物學診斷、MALDI-TOF MS 和光譜學診斷等新興技術在很大程度上擺脫了對檢測人員技術水平的依賴,通常都具有快速簡便、準確的優點,但也明顯存在檢測成本高、操作流程和技術尚未標準化、檢測結果存在一定的假陰性與假陽性等局限,因此尚未獲得臨床工作者的認可。傳統檢測方法與新興檢測技術的優劣詳見表1。

表1 甲真菌病真菌學傳統檢測技術與新興檢測技術的比較Table 1 Comparison of traditional and emerging mycological detection technologies for onychomycosis

4 結語與展望

快速準確的真菌學診斷是治愈甲真菌病和防治復發的關鍵因素,而目前針對甲真菌病的傳統檢測方法與新興檢測技術各有優缺點。開發真菌學檢測方法成為甲真菌病診治領域的研究熱門。隨著科技的進步,基于深度學習技術與人工智能技術在醫學診斷領域取得了重大進展,相信不管是基于形態學的真菌學傳統診斷技術,還是與醫學免疫學、分子生物學、醫學物理學緊密相關的新興診斷技術,亦或是甲真菌病臨床診斷技術,也將迎來廣闊的發展前景。