腎臟脫細胞基質材料在腎臟再生與修復中的研究進展

單曉彤，邊學燕，梅勁

目前，中國成人慢性腎臟病的患病率約為8.2%[1]，這無疑給家庭和醫療機構帶來了沉重的負擔。腎移植作為終末期腎病最有效的治療手段，其應用也面臨著巨大的挑戰。據統計，2020 年我國登記等待腎移植人數超過6 萬，器官移植的供需比例嚴重失衡，器官捐獻的數量無法滿足移植的需求[2]。因此，基于腎臟損傷基礎上的修復和器官再造成為研究熱點。脫細胞基質（decellularized extracellular matrix，dECM）由于良好的生物相容性和低免疫原性，已廣泛應用于再生醫學和組織工程。近年來，隨著水凝膠技術和理論的快速發展，人們不僅利用支架進行器官重建，還對腎臟dECM 水凝膠的再生潛力進行探索。本文主要介紹腎臟dECM 的制備、組成與結構，回顧了腎臟脫細胞支架與水凝膠在再生與修復中的具體應用，并對其今后的應用前景進行展望。

1 腎臟dECM

1.1 制備方法 脫細胞的基本原理就是利用化學法、物理法或生物酶法去除組織中的細胞成分，并最大限度地保留細胞外基質（extracellular matrices，ECM）中的原有活性組分。脫細胞方法的選擇一般由組織特征和預期用途來決定。對腎臟這類實質器官而言，基于原有脈管系統，并借助化學試劑對其進行灌注去細胞是目前最常用的脫細胞方法。常用于脫細胞的化學試劑包括酸、堿、洗滌劑、螯合劑等，其中應用最廣泛的就是離子洗滌劑和非離子洗滌劑。曲拉通X-100 是典型的非離子洗滌劑，能破壞脂質和脂質-蛋白質的相互作用；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）作為離子洗滌劑的代表，不僅可以有效溶解細胞膜，還不會顯著破壞ECM蛋白[3]。在對組織進行脫細胞處理時，還要關注化學洗脫劑的濃度。Sauter 等[4]研究了兩種SDS 濃度（即0.66%和3%）對人內皮細胞在大鼠腎脫細胞支架中的黏附和增殖能力的影響。在半定量的再細胞化分析中，當使用SDS 濃度為0.66%的溫和脫細胞方案時，動態培養5 d 后的細胞計數增加了1 倍以上。物理學方法有凍融和機械力等，其中凍融法有利于保留ECM 的物理結構，最適合于強和厚的組織[5]；機械震動力通常應用于具有天然剝離平面的器官，如膀胱和小腸[6]。生物酶法主要通過破壞細胞片段或細胞-基質黏附的特定鏈來發揮作用，常見的酶試劑有核酸酶、胰酶、膠原酶等。但生物酶的應用不僅會導致ECM 的超微結構的破壞，還可能帶來支架植入后的免疫反應，所以這種方法的應用較少[7]。

1.2 組成與結構 腎臟dECM 保留了大量的ECM結構蛋白和特異性蛋白，它們不僅賦予組織特異性結構，還時刻影響著細胞的各種生命活動。Nagao等[8]對成人腎臟dECM 的定量研究表明：成人腎臟dECM主要由膠原蛋白、層粘連蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖等組成。其中膠原蛋白主要為IV 型膠原蛋白和I型膠原蛋白，分別占比37%和20%；層粘連蛋白占比約8%；硫酸乙酰肝素蛋白聚糖約占3%。這些蛋白不僅與細胞生長、分化、遷移等生命活動息息相關，還積極參與腎臟損傷后的修復。如蛋白聚糖不僅是大多數生長因子的儲存庫，還參與它們生物活性的調節[9]。在大鼠殘腎模型中，肝細胞生長因子不僅可以通過調節巨噬細胞趨化蛋白-1 的小管表達來減輕腎小球和小管間質中的炎癥反應[10]，還可以通過多種機制攔截Smad信號轉導以拮抗TGF- 1來抵抗腎臟纖維化[11]。

除了獨特的生物活性物質，dECM 還具有與天然組織相似的物理結構。已有研究證明ECM 的超微結構和力學性能對細胞遷移和分化、器官特異性細胞命運的決定以及器官發生過程中的自組裝存在潛在影響[12]，如當基質硬度接近腦組織硬度時，神經元分化潛能最大[13]；而腎上皮細胞在超過生理剛度的基質上頂基無法極化[14]。這種組織特異性腎臟dECM可以為特定細胞類型提供最佳底物和理想的細胞-基質相互作用從而保持細胞表型和功能[15]。因此，腎臟dECM 可以提高干細胞分化的可靠性和效率，在腎臟再生中發揮十分重要的作用。

2 腎臟dECM 支架與全腎再生/殘腎修復

2.1 全腎脫細胞與再細胞化 腎臟dECM 支架用于構建完整組織工程腎臟主要涉及到全腎的脫細胞與再細胞化。要進行器官重建，對支架進行再細胞化處理是十分有必要的。但全腎dECM 支架的再細胞化仍然面臨以下幾個不容忽視的問題：（1）腎臟具有十分復雜的天然結構，含有幾十種高度特化的上皮細胞類型[16]。理論上說，將具有分化潛能的各種干細胞播種到支架上，在適宜條件下，可以誘導干細胞定向分化為組織特異性細胞。但目前的研究表明，對脫細胞支架進行再細胞化不能滿足器官再造的全部細胞類型。（2）再細胞化很難保證細胞均勻分布到整個支架當中，且細胞數量無法達到正常組織器官水平。為了提高dECM支架再細胞化的程度，Song等[17]通過腎動脈持續灌注人臍靜脈內皮細胞，然后經由輸尿管持續灌注大鼠新生腎細胞，同時對器官腔施加負壓梯度。這種灌注再細胞化的方式，可以讓細胞分布于整個腎小管間室，直至腎小球叢。Caralt等[7]設計了一個基于灌注的生物反應器，通過腎動脈將人腎皮質上皮細胞以25 ml/min 的速度順行搏動灌注到支架中，然后將流速降至4 ml/min，并持續7 d。這種方法提高了再細胞化的程度，但是高灌注壓力誘導細胞外滲并積聚在支架的病灶區域。為了更好地利用dECM 支架進行組織工程腎臟的構建，還需要探索完善更多干細胞類型和再細胞化方法。

2.2 dECM 支架與殘腎修復 關于腎臟dECM 支架應用于腎臟的再生與修復，除了進行再細胞化，還可以將dECM支架直接縫合到部分腎臟缺損的動物模型中。Yu 等[18]對部分腎切除的大鼠進行dECM 腎臟支架的移植，并在移植后的支架中發現了腎臟再生細胞，免疫熒光也顯示除了分布于腎小球，許多巢蛋白陽性細胞存在于腎小管和切緣附近的間質中，后來Tajima等[19]在豬部分腎切除模型中也得到了同樣積極的結果。Wang 等[20]還將腎dECM 支架移植到5/6 個腎切除大鼠腎臟上，并與明膠海綿覆蓋的切口邊緣進行比較，以探討腎dECM 支架治療慢性腎功能衰竭的效果。結果顯示支架組血尿素氮和血管緊張素II 在大多數時間顯著降低，同時其III 型膠原和IV 型膠原的積累也明顯減少。但是基質中腎元再生的機制還沒有明確，大多數觀點支持dECM支架刺激祖細胞的分化和增殖從而參與腎臟修復。

3 腎臟dECM 水凝膠應用于腎臟組織工程

dECM支架在結構和機械上擁有與腎臟組織相似的優點，但也同時存在局限性，例如：固定的形狀無法填補不規則缺損，不利于與其他生物材料進行有機結合，支架與種子細胞的結合無法脫離生物反應器等。在后來的研究中，人們嘗試對腎臟dECM水凝膠進行各種化學修飾和改造，從而擴大腎臟dECM 的應用范圍。關于腎臟dECM 水凝膠的組織工程應用見圖1。

圖1 腎臟脫細胞水凝膠的組織工程應用

3.1 腎臟dECM 水凝膠用于干細胞的傳遞 近年來，以干細胞為基礎的治療，包括移植誘導多能干細胞、腎祖細胞、胚胎干細胞、間充質干細胞等，被證明可以有效促進腎臟的再生和修復。然而，如何有效輸送干細胞到達指定部位仍是一個巨大的挑戰?？勺⑸渌z因侵入性小、內含豐富的生物活性分子等優點已被組織工程視作輸送干細胞的理想載體。Zhou 等[21]利用腎臟dECM 水凝膠作為可注射支架，將脂肪來源的間充質干細胞輸送到缺血腎臟部位，有效改善了大鼠缺血再灌注后受損的腎功能。經改良策略制備的腎dECM水凝膠不僅可以提高干細胞移植后在腎臟的保留率和存活率，還能促進生長因子的分泌和上皮分化，從而增強干細胞療法的的潛力。Chu 等[22]將負載腎祖細胞的豬腎dECM 和藻酸鹽混合水凝膠注入大鼠缺損的腎臟，21 d 后在樣本中初步發現了類似腎小球結構的形成和定向細胞網絡現象。由此可見，腎dECM 水凝膠與干細胞聯合應用可能是一種十分具有前景的治療手段。

3.2 腎臟dECM 水凝膠用于類器官培養 類器官屬于三維（three-dimensional，3D）細胞培養物，它擁有與對應器官類似的空間組織并能夠重現其部分功能。ECM 水凝膠具有獨特的結構和生物活性物質，被廣泛應用于類器官的培養。Kim 等[23]用腎dECM水凝膠進行類器官培養時發現：使用腎dECM 水凝膠培養的血管化腎類器官具有更成熟的腎小球發育模式，且與人腎的相似性更高。體內實驗也表明：移植到小鼠腎臟中腎類器官不僅可以加速內皮細胞在宿主小鼠腎臟的募集，還能保持血管的完整性。Guo等[24]利用人尿源性干細胞（urine-derived stem cells，USCs）培養的三維腎小管類器官為體外腎毒性篩查提供了優化方案。USCs 在沒有腎臟dECM 的二維培養體系中不表達足細胞或腎小管上皮細胞的標記物。因此，他們將腎臟dECM 水凝膠加入培養基中以誘導USCs 的分化，培養14 d 后觀察到腎小管樣結構，在隨后的腎毒性藥物實驗中也顯示出對順鉑和丙酮的高敏感性。由于USCs 的來源廣泛，利用其進行3D 腎小管類器官的構建在藥物開發早期可以作為動物模型的理想代替方案。

3.3 腎臟dECM 水凝膠用于3D 生物打印 3D 生物打印通常用于組織工程中，旨在開發具有復雜結構的天然器官支架，最終可用于臨床移植。腎臟有著復雜的器官結構和ECM組成，傳統組織工程方法難以復制，3D生物打印可以更好地模擬其復雜性和ECM 分布。Singh 等[25]開發了一種脫細胞腎源性的生物墨水，并通過海藻酸鹽的加入來改善其力學性能。他們利用三維同軸細胞打印系統，分別在腎近端小管上皮細胞和人臍靜脈內皮細胞的中空管內直接制備了混合生物墨水，以此創建了腎小管的3D模型。將血管化的腎小管組織移植到免疫缺陷小鼠的腎包膜下部8 周后，植入物在血管的浸潤和功能標記物的表達方面均有十分優秀的表現。令人驚嘆的是，將打印物植入單側輸尿管梗阻小鼠模型時，它還表現出抗纖維化的潛力，而這對體外慢性腎臟病模型的研究有很大的幫助。這些生物墨水在疾病建模的微流控設備中的應用也通過血管化的腎近端小管芯片的創建得到驗證。Ali 等[26]開發了一種新型光交聯腎臟ECM衍生生物墨水配方，與人原代腎細胞混合后，使用集成組織器官打印系統制備腎結構。熒光染色提示：這種生物打印的腎組織構建物不僅表現出天然腎組織的結構特征，還具備了電解質重吸收能力和氨基酸運輸活性。

4 展望

腎臟dECM 材料在組織工程腎臟的構建、促進受損組織再生修復等方面已經取得了積極的結果。但這些令人鼓舞的研究成果大都源于小動物模型和細胞實驗，距離其真正應用于臨床還需經過漫長的探索。另外，移植后的血栓形成、脫細胞組織的有效再細胞化以及新的ECM 的建立等都是亟需解決的問題。為了發展臨床可行的組織工程腎臟移植，需要新的再細胞化策略和先進的部分腎臟植入療法以及對再細胞化腎支架進行廣泛的體外功能測試。相信在不久的將來，可以通過異種ECM 來源的腎臟dECM材料構建出真正可以應用于臨床的生物材料。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突