鱉甲煎丸對肝癌大鼠黏著斑激酶/雷帕霉素靶蛋白通路的影響

李杳瑤,劉 華,孫銅林,伍 靜,孟小莎,伍夢思,,蘇聯軍

(1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院,湖南 長沙 410007;2.湖南中醫藥大學,湖南 長沙 410208)

肝癌(Hepatic carcinoma,HCC)是我國第三大最常見的癌癥?；熌退幰鸬膹桶l和轉移是肝癌管理改善臨床結果的主要挑戰[1-2]。肝轉移瘤手術切除后的5年生存率為25%～55%,且在大多數患者中觀察到癌癥復發[3]。因此,需要更多的研究來推進復發風險高且對當前療法反應率低的HCC。惡性腫瘤發展的分子機制研究表明,黏著斑激酶(Focal adhesion kinase,FAK)通過控制細胞外基質(Extracellular matrix,ECM)微環境與腫瘤細胞之間的相互作用有助于癌細胞運動和侵襲性活動[4]。FAK將底物磷酸化為支架,局灶黏附誘導促進基質金屬酶(Matrix metalloenzymes,MMP)分泌的信號轉導途徑,導致ECM底物降解并增加ECM底物上的腫瘤細胞黏附。此外,除了與細胞生長相關外,雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin,mTOR)信號通路還參與細胞的存活和分化,以及它們的侵襲潛力。此外,許多研究表明,mTOR信號傳導有助于調節MMP-2/-9活性[5-7]。鱉甲煎丸是治療體內腫塊的經典方劑,來源于《文一倫》一書。方中鱉甲、烏扇炮、黃芩、鼠婦熬用于分解積聚和消除瘀血,干姜、大黃、桂枝起到尋找和清除病原體作用,石韋、厚樸、瞿麥、紫葳擅長軟化腫瘤硬度,阿膠、柴胡、蜣螂熬滋肝陰,甘草是各藥的調劑。作為傳統中藥,鱉甲煎丸已被證明對多種腫瘤具有抗腫瘤活性,如肺癌、乳腺癌和肝癌[8]。迄今為止,多項研究表明鱉甲煎丸具有加速細胞凋亡、誘導自噬、促進細胞周期阻滯或抑制腫瘤轉移的能力[9]。然而,關于鱉甲煎丸治療肝癌壞死性凋亡的研究很少。本研究擬探討鱉甲煎丸對HCC大鼠病理損傷及FAK、mTORC1蛋白表達的影響,為HCC治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物:體重18～22 g的Sprague-Dawley(SD)大鼠100只獲自昆明醫科大學動物試驗中心[許可證編號SCXK(云)2019-0012,合格證號SCXK(云)2019-0013]。大鼠喂養環境為(22±2)℃,12 h光-暗循環。

1.1.2 實驗試劑及儀器:5-氟尿嘧啶組(批號45896.36,20 mg/kg)、TRIzol試劑(批號DC-45896.36)、Thermo script RT系統試劑(批號MN-52636.36)、Power SYBRGREEN PCR MasterMix試劑(批號VB-45896.36)、BCA蛋白質檢測試劑盒(批號BC-4896.36)、聚偏二氟乙烯膜(批號526987.36)。FAK、mTORC1一抗(中國碧云天生物科技,批號CI-636985.36、854635.54);HRP偶聯的二抗(批號45874585.3);VEGFR-2、VEGF、IL-4、IL-8、TNF-α蛋白Quantikine ELISA試劑盒(泉州市睿信生物科技有限公司,批號69696.36、47852.54、48965.25、52419.65、95487.25)。Applied Biosystems序列檢測系統7900(ABI Prism7900HT)、化學發光系統(Amersham Biosciences)。

1.1.3 鱉甲煎丸配方:炙鱉甲、烏扇炮、黃芩、鼠婦熬、干姜、大黃、桂枝、石韋去毛、厚樸、瞿麥、紫葳、阿膠各3 g,柴胡、蜣螂熬各6 g,芍藥、牡丹去心、蟲熬各5 g,蜂窠炙4 g,赤硝12 g,桃仁2 g,人參、半夏,葶藶各1 g,由湖南中醫藥大學第一附屬醫院提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組:根據大鼠體重隨機分成五組,正常組、模型組、5-氟尿嘧啶組(20 mg/kg)、鱉甲煎丸低劑量組(40 mg/kg)、鱉甲煎丸高劑量組(80 mg/kg),每組20只,雌雄各半。

1.2.2 各組大鼠模型建立:模型組、5-氟尿嘧啶組、鱉甲煎丸低劑量組、鱉甲煎丸高劑量組用HepG2(1×107)細胞皮下注射到大鼠右腋皮下,10 d后,腫瘤體積達到50 mm3說明建模成功。24 h后5-氟尿嘧啶組、鱉甲煎丸低劑量組、鱉甲煎丸高劑量組給予相應藥物灌胃,持續4周,正常組、模型組均給予等體積0.9%氯化鈉溶液。

1.2.3 各組大鼠肝癌組織重量、肝癌組織體積、肝癌組織抑瘤率測定:采用游標卡尺檢測其長短徑,計算腫瘤抑制率及腫瘤組織體積。腫瘤抑制率=[(模型組腫瘤體積-其他組腫瘤體積)/模型組腫瘤體積]×100%。腫瘤組織體積=(腫瘤組織長徑×腫瘤組織短徑2)/2。

1.2.4 各組大鼠肝癌組織FAK、mTORC1基因測定:使用TRIzol試劑從肝癌組織中分離總RNA,并使用TRIzol試劑提取總RNA。根據制造商的說明,通過Thermo script RT系統試劑將RNA逆轉錄為互補DNA(cDNA)。使用Applied Biosystems序列檢測系統7900(ABI Prism7900HT)與10 μl由Power SYBRGREEN PCR Master Mix、500 nmol每個引物和300 ngcDNA模板。反應條件為95 ℃下初始變性5 min,然后是60個循環,94 ℃下20 s,60 ℃下20 s和72 ℃下40 s,再以0.1 ℃/s速度從72 ℃升溫至95 ℃之前,包括在72 ℃下進行5 min最終延伸,并進行連續熒光采集。對于定量RT-qPCR的每個實例,復制每個cDNA樣本,并使用2-ΔΔCt方法確定平均相對倍數mRNA表達,其中檢測到GAPDH作為內部對照。RT-qPCR中使用的引物序列,見表1。

表1 FAK、mTORC1基因引物序列

1.2.5 各組大鼠肝癌組織FAK、mTORC1蛋白測定:肝癌組織用裂解緩沖液(20 ml Tris-HCl、1 m MEDTA、1 ml EGTA、1 ml釩酸鈉、0.2 ml苯甲基磺酰氟、0.5%NP-40、1 μg/ml亮抑酶肽、1 μg/ml抑肽酶和1 μg/ml胃酶抑素A)裂解。用BCA蛋白質檢測試劑盒測定蛋白質濃度。將等量的總細胞裂解物30 μg溶解在樣品緩沖液中,并在變性SDS-PAGE凝膠(5%濃縮凝膠和8%～12%分離凝膠)電泳,然后將蛋白質轉移到聚偏二氟乙烯膜。用FAK、mTORC1一抗探測印跡,然后用HRP偶聯的二抗探測,通過增強的化學發光系統觀察抗原-抗體復合物。

1.2.6 各組大鼠肝癌組織VEGFR-2、VEGF、IL-4、IL-8、TNF-α蛋白水平測定:使用Quantikine ELISA試劑盒根據制造商的說明書測量肝癌組織VEGFR-2、VEGF、IL-4、IL-8、TNF-α水平。用分光光度法分別在450、459、468、652、548 nm處測量吸光度。

2 結 果

2.1 各組大鼠肝癌組織重量、肝癌組織體積、肝癌組織抑瘤率比較 見表2。與正常組比較,模型組肝癌組織重量、肝癌組織體積、肝癌組織抑瘤率升高(P<0.05)。與模型組比較,5-氟尿嘧啶組、鱉甲煎丸低劑量組、鱉甲煎丸高劑量組肝癌組織重量、肝癌組織體積、肝癌組織抑瘤率降低,且鱉甲煎丸高劑量組肝癌組織重量、肝癌組織體積、肝癌組織抑瘤率低于鱉甲煎丸低劑量組,差異有統計學意義(P<0.05)。

表2 各組大鼠肝癌組織重量、肝癌組織體積、肝癌組織抑瘤率比較

2.2 各組大鼠肝癌組織VEGFR-2、VEGF蛋白表達比較 見表3。與正常組比較,模型組肝癌組織VEGFR-2、VEGF蛋白表達升高(P<0.05)。與模型組比較,5-氟尿嘧啶組、鱉甲煎丸低劑量組、鱉甲煎丸高劑量組肝癌組織VEGFR-2、VEGF蛋白表達降低,且鱉甲煎丸高劑量組肝癌組織VEGFR-2、VEGF蛋白表達低于鱉甲煎丸低劑量組,差異有統計學意義(P<0.05)。

表3 各組大鼠肝癌組織VEGFR-2、VEGF蛋白表達比較(ng/g)

2.3 各組大鼠肝癌結構比較 正常組肝組織結構正常;模型組肝癌細胞異型性增生,有明顯增生灶結節,可見脂肪變性、細胞核增大出血及壞死細胞,炎癥細胞浸潤明顯;經過5-氟尿嘧啶、各劑量的鱉甲煎丸干預后,肝癌面積減少,癌細胞異型性增生減弱,炎癥細胞浸潤減少(圖1)。

A:正常組;B:模型組;C:5-氟尿嘧啶組;D:鱉甲煎丸低劑量組;E:鱉甲煎丸高劑量組

2.4 各組大鼠肝癌組織FAK、mTORC1 mRNA表達比較 見表4。與正常組比較,模型組肝癌FAK、mTORC1 mRNA表達升高(P<0.05)。與模型組比較,5-氟尿嘧啶組、鱉甲煎丸低劑量組、鱉甲煎丸高劑量組肝癌組織FAK、mTORC1 mRNA表達降低,且鱉甲煎丸高劑量組肝癌組織FAK、mTORC1 mRNA表達低于鱉甲煎丸低劑量組,差異有統計學意義(P<0.05)。

表4 各組大鼠肝癌組織FAK、mTORC1 mRNA表達比較

2.5 各組大鼠肝癌組織FAK、mTORC1蛋白表達比較 見表5(圖2)。與正常組比較,模型組肝癌FAK、mTORC1蛋白表達升高(P<0.05)。與模型組比較,5-氟尿嘧啶組、鱉甲煎丸低劑量組、鱉甲煎丸高劑量組肝癌FAK、mTORC1蛋白表達降低,且鱉甲煎丸高劑量組肝癌FAK、mTORC1蛋白表達低于鱉甲煎丸低劑量組,差異有統計學意義(P<0.05)。

A:正常組;B:模型組;C:5-氟尿嘧啶組;D:鱉甲煎丸低劑量組;E:鱉甲煎丸高劑量組

表5 各組大鼠肝癌組織FAK、mTORC1蛋白表達比較

2.6 各組大鼠肝癌組織IL-4、IL-8、TNF-α比較 見表6。與正常組比較,模型組肝癌組織IL-4、IL-8、TNF-α升高(P<0.05)。與模型組比較,5-氟尿嘧啶組、鱉甲煎丸低劑量組、鱉甲煎丸高劑量組肝癌組織IL-4、IL-8、TNF-α水平降低,且鱉甲煎丸高劑量組肝癌組織IL-4、IL-8、TNF-α低于鱉甲煎丸低劑量組,差異有統計學意義(P<0.05)。

表6 各組大鼠肝癌組織IL-4、IL-8、TNF-α水平比較(ng/g)

3 討 論

鱉甲煎丸的抗腫瘤作用集中體現在細胞凋亡誘導、侵襲和遷移抑制以及細胞周期停滯[10]。近期報道,鱉甲煎丸通過抑制多種癌細胞生長和誘導細胞凋亡而具有抗癌活性[11]。據報道,鱉甲煎丸可誘導人白血病細胞系中的壞死性凋亡[12]。研究發現,鱉甲煎丸通過抑制NF-κB和NF-κB調節的基因產物抑制人胰腺腫瘤的生長并增強吉西他濱的抗腫瘤作用[13]。此外,鱉甲煎丸通過內質網應激和線粒體凋亡途徑誘導人前列腺癌細胞[14]。體外試驗發現,鱉甲煎丸可通過激活Caspase-3誘導細胞凋亡,在用鱉甲煎丸處理的膠質瘤U251細胞中,Caspase-8蛋白質水平降低[15]。根據中草藥配伍原則,結合肝癌病理特點,鱉甲煎丸在三家散的基礎上選用黃芪支持氣機運行,去除了黃蟬、蟬科,代替了姜黃以加強祛血功效,減去白芍,代之以紫芍、紅花,增強當歸的活血、養陰功效。鱉甲煎丸能促進血液循環,對體內腫塊表現明顯抑制作用,因此可用于治療肝硬化、肝細胞癌等。此外,臨床應用表明鱉甲煎丸對肝硬化或HCC療效較好,肝功能指標、門靜脈直徑均得到改善。然而,鱉甲煎丸對HCC的潛在機制仍然知之甚少。本研究中鱉甲煎丸對VEGFR-2、VEGF蛋白表現出直接抑制作用,說明鱉甲煎丸對大鼠肝癌具有抑制作用,這與前述討論一致。此外,高劑量的鱉甲煎丸與5-氟尿嘧啶效果一致,提示加大鱉甲煎丸劑量可達到更好療效。病理研究結果發現,正常組肝組織結構正常,模型組肝癌細胞異型性增生,細胞排列密集,核大見分裂,炎癥細胞浸潤明顯;經過5-氟尿嘧啶、各劑量的鱉甲煎丸干預后,肝癌面積減少,癌細胞異型性增生減弱,炎癥細胞浸潤減少,說明鱉甲煎丸能減輕大鼠肝癌所致的病理損傷。

最近報告表明,MMP-9和FAK與表皮生長因子受體(EGFR)在表皮生長因子(EGF)誘導時相關,并促進腫瘤細胞運動和侵襲。EGF/EGFR信號傳導被確定為包括乳腺癌、肺癌在內的多種腫瘤類型的重要參與者。當FAK與179-kDa EGFR結合時,受體激活涉及與其他EGFR家族成員的同源和異質二聚化,以及磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)和MAPK途徑激活,這些途徑增強了腫瘤生長和侵襲。此外,EGFR/PI3K/Akt信號通路調節mTOR靶標,稱為癌細胞增殖的關鍵控制器。mTOR信號通路能抑制F-肌動蛋白重組和FAK磷酸化,這是細胞遷移的功能指標。mTORC1最近已被證明與壞死性凋亡有關。FAK和mTORC1通過它們的RIP同型相互作用基序(RHIM)域相互作用,形成FAK/mTORC1復合物,介導經典的壞死性凋亡[16]。近期研究發現,5-氟尿嘧啶在mRNA水平上抑制mTORC1轉錄,降低mTORC1表達和磷酸化[17-18]。在mTORC1-/-MEF和mTORC1過表達的肝癌細胞中5-氟尿嘧啶誘導的凋亡被顯著降低。因此,5-氟尿嘧啶誘導的凋亡可定義為mTORC1依賴性壞死性凋亡[19-22]。研究發現,環磷酰胺誘導乳腺癌細胞中的ROS生成和線粒體功能障礙顯著觸發細胞凋亡[23-25],環磷酰胺引起壞死性凋亡來抑制體內和體外肺癌細胞生長,mTORC1的激活使S358處的MLKL磷酸化并衍生其寡聚化,這直接破壞了壞死性凋亡過程中的膜完整性。因此,MLKL在5-氟尿嘧啶處理后被mTORC1磷酸化,并通過與mTORC1的相互作用被招募形成壞死體。本研究結果說明,鱉甲煎丸能抑制肝癌FAK、mTORC1表達進而誘導肝癌細胞凋亡。這與上述研究一致。