柴歸湯調控環磷酸腺苷/蛋白激酶B信號通路干預原發性高血壓大鼠作用機制

許欣穎,胡小海,朱紅俊

(1.南京中醫藥大學,江蘇 南京 210023;2.南京中醫藥大學無錫附屬醫院,江蘇 無錫 214071)

高血壓是冠狀動脈疾病、心衰、腦卒中、外周血管疾病等心血管疾病的主要危險因素,每年有850萬人因高血壓死亡[1-3]。高血壓的發病機制復雜,臨床需聯合使用多種單一機制的降壓藥物控制血壓水平,存在局限性及不良反應,且難以治愈[4]。中醫藥治療高血壓具有巨大潛力,中藥復方治療疾病具有“多成分”“多通路”“多靶點”協同作用的優勢,并已獲得高質量臨床證據[5-7]。本研究團隊采用柴歸湯(小柴胡湯與當歸芍藥散的合方)治療1-2級高血壓,取得一定臨床療效,且單用柴歸湯治療在降低舒張壓幅度方面優于單純西藥治療[8]。第二信使cAMP對心血管系統的血管舒張、心室收縮、心肌肥厚、細胞凋亡、細胞代謝等具有廣泛調節作用[9]。cAMP信號通路是否參與以及如何參與柴歸湯治療高血壓機制仍不清楚。本研究擬通過動物實驗,探索柴歸湯對cAMP/AKT信號通路的干預及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物:從上海斯萊克實驗動物有限公司[生產許可證編號 SCXK(滬) 2017-0005]購買野生型Wistar-Kyoto大鼠(SPF級)和原發性高血壓(Spontaneously hypertensive,SH)大鼠。在江南大學醫學院動物中心[實驗動物使用許可證號SYXK(蘇)2017-0052]隨機分籠飼養,每籠5只。SPF級動物飼養屏障環境,環境濕度維持在50%,溫度保持在25 ℃左右,進食飲水自由。采用燈光控制系統,每天50%光照與50%黑夜時間交替。

1.1.2 藥物與試劑:柴歸湯處方組成與劑量參照前期研究[10],柴胡、茯苓、生白術各60 g,北沙參、黃芩、生姜、當歸、姜半夏各45 g,生白芍240 g,川芎、澤瀉各120 g,柴歸湯灌胃藥劑由無錫市中醫醫院制劑室提供。柴歸湯入腸代表性成分參照前期研究:柴胡皂苷A 0.15 mg/kg、毛蕊花糖苷5.09 mg/kg[11]。貝那普利(批號H20030514,規格10 mg/片)由無錫市中醫醫院藥房提供。采用0.9%氯化鈉溶液配制成0.2 mg/ml溶液。大鼠cAMP、AKT、PKA ELISA試劑盒(批號20210627)。

1.1.3 實驗儀器:酶標儀(美國Bio Tek Instruments公司);無創血壓測量系統(美國IITC Life Science公司);冷凍高速離心機(美國Thermo公司);PEX100磷酸化抗體芯片檢測技術由上海華盈生物醫藥科技有限公司進行。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組與給藥:將購買的36只雄性原發性高血壓大鼠4周齡預適應1周后(按照SPF級飼養標準適應性喂養)。Wistar-Kyoto (WKY)大鼠6只,體重175 ～ 225 g,雄性,12周齡,購自SPF(北京)生物技術有限公司,WKY大鼠為空白組,給予等體積0.9%氯化鈉溶液。所有原發性高血壓大鼠隨機分為模型組、貝那普利組、柴歸湯高劑量、中劑量、低劑量組,柴歸湯入腸成分組,每組6只。貝那普利組劑量為6 mg/kg,柴歸湯高劑量組15 g/kg、柴歸湯中劑量組5 g/kg、柴歸湯低劑量組3 g/kg,將所有生藥的混合物在80 ℃的9倍熱水中浸泡1 h,然后在96 ℃的水中提取兩次(分別為4、2 h),噴霧干燥,制成干粉進行灌胃。柴歸湯入腸成分組劑量為5.24 mg/kg。實驗期間,大鼠自由獲取食物和水。干預期間,各組大鼠每天灌胃1次,連續干預4周,每周檢測1次血壓并記錄。

1.2.2 收縮壓與舒張壓檢測:通過尾壓法測量大鼠的收縮壓和舒張壓,使用嚙齒動物無創血壓測量系統。

1.2.3 ELISA檢測血清cAMP、主動脈組織AKT、PKA水平:大鼠禁食過夜后,麻醉處死,取部分血樣入普通試管,4 ℃下3000 r/min離心15 min分離血清。獲得的血清樣本保存在-80 ℃?？焖偈占糠种鲃用}組織,4%多聚甲醛固定48 h用于組織病理學分析,收集剩余主動脈組織,立即在-80 ℃冷凍。主動脈組織取勻漿,設置參數1500 r/min,運行20 s,間隔10 s,重復3次,于冷凍高速離心機離心20 min,12000 r/min,半徑12 cm,取上清。檢測全部在無錫市中醫醫院心血管疾病實驗室進行,采用酶標儀測定。

1.2.4 PEX100磷酸化抗體芯片檢測關鍵蛋白磷酸化:PEX100抗體芯片為信號通路廣篩抗體芯片,芯片上固定有識別多條信號通路中關鍵蛋白的抗體,共1318種。該芯片上大部分抗體為配對抗體(584對),即每種磷酸化位點會有2種抗體共同檢測,隨機選擇空白組、模型組和柴歸湯高劑量組的部分大鼠心肌組織進行測定。使用Gene Pix Pro 6.0軟件讀取原始數據,樣本內磷酸化水平計算:同一樣本中,具有配對抗體的所有磷酸化位點蛋白,采用某位點磷酸化抗體信號值除以非磷酸化抗體信號值。組間磷酸化比值計算:在不同樣本比較中,采用實驗組某位點磷酸化水平除以對照組該位點磷酸化水平。

2 結 果

2.1 各組大鼠收縮壓、舒張壓比較 見表1。與模型組相比,柴歸湯低劑量、柴歸湯中劑量、柴歸湯高劑量組,柴歸湯入腸成分組及貝那普利組均可顯著降低原發性高血壓大鼠第4周的收縮壓和舒張壓(P<0.01)。

表1 各組大鼠干預4周后收縮壓及舒張壓比較(mmHg)

2.2 各組大鼠血清cAMP及主動脈組織AKT、PKA表達比較 見表2。與空白組相比,柴歸湯入腸成分組cAMP、柴歸湯低劑量、中劑量組PKA、貝那普利組AKT均有所升高(P<0.05)。與模型組相比,柴歸湯入腸成分組血清cAMP,柴歸湯高劑量組、柴歸湯中劑量組主動脈組織AKT,柴歸湯中劑量組主動脈組織PKA水平均顯著升高(P<0.05)。

表2 各組大鼠干預4周后血清cAMP及主動脈組織AKT、PKA比較

2.3 各組大鼠磷酸化抗體芯片檢測結果比較 見表3、4(圖1)。柴歸湯將eNOS Ser1177磷酸化水平從模型組的2.8倍回調至1.5倍,柴歸湯高劑量組AKT1 Thr450磷酸化修飾水平較模型組上調3.52倍,較空白組上調1.75倍。芯片上的每種抗體設置兩次技術重復,以兩次技術重復校正信號值作后續分析。

圖1 各組大鼠AKT1 Thr450、eNOS Ser1177位點免疫熒光圖

表3 各組大鼠干預4周后AKT1 Thr450、eNOS Ser1177位點校正信號值比較

表4 各組大鼠干預4周后AKT1 Thr450、eNOS Ser1177位點磷酸化比值比較

3 討 論

高血壓仍是全球心血管疾病死亡和殘疾的主要原因。中醫學認為,高血壓歸屬于“頭痛”“眩暈”范疇,其病機主要與“風、火、痰、虛、瘀”等有關,病位與肝、脾、腎三臟關系密切,病因與情志、飲食、勞逸失常等相關,病機多屬本虛標實,虛實夾雜[12-13]?！端貑枴ぶ琳嬉笳撈诽岢觥爸T風掉眩,皆屬于肝”,黃莉等[14]總結當代名醫經驗,提出調整肝的陰陽平衡是中醫治療高血壓的關鍵樞紐。團隊基于龍砂醫派和仝小林院士“三期六態”高血壓診治體系學術思想提出了高血壓的新分型,其中體型正?；蛳莸母哐獕喝巳憾x為厥陰型[15-16]。厥陰型高血壓患者常多血少氣,常有疲倦乏力、面黃無華、水腫貌等特征,脈象平弦或浮弦,為肝失疏泄,水液運輸不利而致,針對厥陰型高血壓,團隊選用柴歸湯治療,柴歸湯由小柴胡湯和當歸芍藥散合方而成,具有疏利氣機,調暢肝氣,活血利水之功[16-17]。日本漢方RCT循證醫學報告提出《傷寒雜病論》經典方劑小柴胡湯、當歸芍藥散是治療高血壓等循環系統疾病的常用有效方劑[18]。柴歸湯治療高血壓,已經取得較好的臨床療效[8]。團隊通過UHPLC-Q-TOF-MS/MS方法解析了柴歸湯的功效成分;并進行動物實驗深入研究,柴歸湯能明顯降低原發性高血壓和高血壓大鼠[19]的血壓,參與調控原發性高血壓的RAAS平衡及磷脂代謝[10-11]。本研究通過對原發性高血壓大鼠cAMP信號通路檢測,進一步探索cAMP信號通路對柴歸湯干預高血壓的作用機制。

目前認為,血管內皮通過釋放各種生化因子來維持血管張力,調節下層血管平滑肌的收縮和松弛行為,調節炎癥,免疫調節,血小板聚集和血栓形成,其機制與激活負責一氧化氮(NO)產生的內皮一氧化氮合酶 (eNOS)有關[20]。eNOS磷酸化是血管舒張的分子開關,缺乏eNOS基因的大鼠可表現出血壓水平升高和內皮依賴性血管松弛功能喪失[21-22]。eNOS 磷酸化通過 PPAR-γ-eNOS、氧化應激、Rho途徑、PI3K/Akt等信號途徑調節NO[23]。NO通過介導血管舒張,降低血管阻力,從而降低血壓,促進血管重塑[24]。

環狀3',5'-腺苷單磷酸(cAMP)是許多器官中的主要第二信使,在工作心肌中,cAMP可以激活蛋白激酶A(PKA)以介導各種生物學效應,包括心臟重塑和肥大[25-26]。本實驗研究結果示,柴歸湯入腸成分組cAMP與模型組、空白組相比顯著增加,柴歸湯低劑量、中劑量組較模型組明顯升高主動脈組織中PKA水平。cAMP/PKA/eNOS信號傳導被證明可增強缺血部位的內皮祖細胞募集,誘導內皮分化,促進新生血管形成[27]。磷酸化抗體芯片檢測結果顯示,柴歸湯將eNOS Ser1177磷酸化水平從正常的2.8倍回調到1.5倍。eNOS Ser1177的過度磷酸化可能是原發性高血壓的代償反應,報道指出eNOS從產生心臟保護性NO切換到產生細胞毒性超氧化物和二級活性氧,導致內皮功能嚴重喪失[28]。柴歸湯通過調節eNOS Ser1177的過度磷酸化更有利于促進血管舒張而降低血壓,并減少過氧化對血管內皮的危害。

本研究發現,柴歸湯中劑量、高劑量組及貝那普利組均可顯著升高大鼠主動脈組織AKT水平,PEX100磷酸化抗體芯片檢測示AKT1 Thr450磷酸化修飾水平上調3.52倍。而AKT通過誘導eNOS絲氨酸1177位點(Ser1177)磷酸化,導致eNOS活性增加,實現對心臟的保護,cAMP/PI3K/AKT通路與PKA/eNOS通路可協同調節內皮血管生成[29-30]。例如西洛他唑通過cAMP/PKA和PI3K/AKT依賴性eNOS激活機制誘導NO產生,從而促使人主動脈內皮細胞中的血管生成[31]。有研究發現PKA與AKT可形成物理復合物,且AKT作為PKA的底物參與調節,免疫共沉淀結果示AKT和PKA與eNOS的存在相互作用關系[29,32]。與此同時,cAMP/PKA信號傳導可以激活PI3K的p85α亞基并觸發AKT激活,抑制內皮細胞凋亡,同時維持增殖,對血管損傷起到保護作用[33]。筆者推測柴歸湯降壓機制可能與cAMP/PKA,cAMP/PI3K/AKT協同激活eNOS調節血管內皮功能有關,但未測PI3K水平是一個遺憾,值得未來進一步設計實驗研究。

綜上所述,通過動物實驗及磷酸化芯片抗體檢測,柴歸湯能夠顯著降低原發性高血壓大鼠血壓,其降壓機制可能與cAMP/AKT、cAMP/PKA通路對eNOS的協同作用有關。