溫肺降濁方對血管性癡呆大鼠海馬神經元的作用機制

姜明賀,張 鼎,朱歡歡,李方存,李麗琴,宋晨曦,陳 煒,胡躍強

(1.廣西中醫藥大學,廣西 南寧 530001;2.廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院,廣西 南寧 530011;3.廣西中醫藥大學第一附屬醫院,廣西 南寧 530023)

癡呆是一種不可逆性的疾病,可導致進行性認知能力下降,已經成為主要的健康問題之一[1]。血管性癡呆(Vascular dementia,VaD)是僅次于阿爾茨海默病的第二大癡呆病因[2]。雖然VaD的病因病理機制尚不清楚,但主要聚焦于神經血管單位破壞、膽堿能功能退化、氧化應激、炎癥反應、血腦屏障破壞等諸多因素[3]。慢性腦灌注不足引起的線粒體功能障礙可導致神經元內大量活性氧蓄積,進而激活內質網應激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)通路[4]。同時,ERS是通過激活未折疊蛋白反應來維持內質網內部的細胞穩態,且持續性的ERS能夠激活下游蛋白,如胱天蛋白酶-12、CCAAT增強子結合蛋白同源蛋白(CCAAT enhancer-binding protein homologous protein,CHOP)等,進而導致細胞死亡[5]。最新證據顯示,當抑制VaD大鼠腦內的ER應激反應可以有效改善其認知障礙[6]。因此,內質網應激反應是VaD發生發展過程中的一項重要因素。

血管性癡呆在中醫學中并無專屬病名,然而根據其臨床表現,中醫學將其歸屬于“呆病”范疇。歷代醫家多以心血虧虛、腎精不足以致腦竅失榮論治,故在治療上多以補益心腎為主。本團隊提出“從肺治腦”的理論,創制溫肺降濁方,施于臨床療效較好。前期的基礎研究顯示,該方具有抗氧化、抗凋亡和調節免疫作用,且溫肺降濁方可改善VaD大鼠的認知障礙,對老年性大鼠具有神經保護作用[7-9]。然而,溫肺降濁方是否參與了沉默信息調節因子1(Silent information regulator 1,SIRT1)/ERS通路對VaD的保護作用尚不清楚。因此,提出溫肺降濁方能夠通過調節SIRT1/肌醇需求酶1α(Inositolrequiring enzyme 1α,IRE1α)/剪接型X-盒結合蛋白1(Spliced X-box binding protein 1,XBP1S)/CHOP信號通路來改善大鼠海馬CA1區神經元損傷的假設,探討其改善認知功能障礙的作用機制,為后續基礎研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物:健康成年雄性SPF級SD大鼠,購買于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司,動物質量合格證號(SCXK湘2019-0004)。實驗動物飼養于廣西中醫藥大學動物實驗中心SPF級動物實驗室。本研究經廣西中醫藥大學科學實驗中心動物倫理委員會批準,批準編號DW20230425-105。

1.1.2 主要試劑和儀器:無水乙醇(批號10009218);二甲苯(批號10023418);蘇木精(批號H9627);伊紅Y(批號71014544);中性樹膠(批號10004160);SIRT1抗體(批號ab62352);IRE1α抗體(批號ab125066);XBP1s抗體(批號ab227828);CHOP抗體(批號ab179800);彩虹180廣譜蛋白Marker(批號PR1910);顯微鏡(型號BX53,日本奧林巴斯公司);PCR梯度基因擴增儀(型號SCI1000-G,美國賽洛捷克公司);小型垂直電泳轉印系統(型號1658033,美國伯樂公司)等。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型制備和分組:適應性喂養大鼠2周,體重保持在(250±30) g左右,隨機分為假手術組、模型組、溫肺降濁方低劑量組、溫肺降濁方中劑量組、溫肺降濁方高劑量組,每組6只大鼠。大鼠通過雙側頸總動脈永久性結扎建立VaD模型大鼠,具體操作為40 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔內注射麻醉,經頸部正中切開,暴露雙側頸總動脈,輕輕分離雙側頸總動脈和迷走神經,用6-0號絲線結扎雙側頸動脈并剪斷。假手術組只暴露動脈不進行結扎和剪斷。整個手術過程操作輕柔,減少觸碰迷走神經,術后用加熱毯維持大鼠體溫。

1.2.2 實驗藥品及制備:溫肺降濁方由制附子(先煎)20 g,黨參 15 g,干姜、田七、酒大黃各10 g,炙甘草 6 g組成。所有藥物購買于廣西中醫藥大學第一附屬醫院門診中藥房,本方分兩次煎煮,取汁200 ml,加熱濃縮至含有原藥材1.5 g/ml。尼莫地平片(批號211274)。

1.2.3 動物給藥:手術后4周開始給藥,模型組、假手術組予以等體積0.9%氯化鈉溶液灌胃,西藥組給予尼莫地平20 mg/(kg·d),溫肺降濁方低劑量組、溫肺降濁方中劑量組、溫肺降濁方高劑量組分別予以溫肺降濁湯3.75、7.5、15 g/(kg·d)灌胃給藥,持續4周。

1.2.4 Morris水迷宮試驗:給藥4周后,采用Morris水迷宮試驗評估大鼠的空間學習記憶能力。Morris水迷宮試驗的設備由一個黑色圓形池、一個逃生平臺和記錄系統組成,圓形池中加入無毒黑色墨水,加熱使水溫保持在(23±1) ℃,將圓形池分成四個相等的象限。將逃生平臺放置在目標象限中心的水面以下2 cm處。定位航行試驗中,大鼠每天從4個不同的位置被釋放,持續5 d。記錄大鼠逃避潛伏期和總路程。每個象限測試時間為60 s。若大鼠成功登臺,停留15 s,未成功登臺則人工引導大鼠至平臺停留20 s。第6天進行空間探索試驗,取出逃生平臺,將平臺所在象限設為目標區,從目標區對側象限將老鼠放入水中,自由游動60 s,記錄大鼠在目標象限上的停留時間、原始平臺位置的穿越次數。

1.2.5 HE染色和尼氏染色:水迷宮測試結束后進行取材,取材前各組大鼠禁食禁水24 h,用1%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔過量麻醉后,每組取3只大鼠,進行心臟灌注,立刻斷頭取腦,用4%多聚甲醛溶液浸泡24 h,然后用石蠟包埋,制作3 mm厚的切片。脫蠟后,進行HE染色和尼氏染色,最后用中性樹脂封片,光學顯微鏡下觀察海馬組織形態。

1.2.6 RT-qPCR檢測SIRT1、IRE1α、XBP1s、CHOP mRNA表達水平:總RNA嚴格按照Trizol試劑盒說明提取,微量分光光度計測定OD值,計算RNA的純度和濃度。將總RNA逆轉錄為cDNA,反應條件為42 ℃、2 min,50 ℃、15 min,85 ℃、5 s,4 ℃、10 min,1個循環。擴增程序分為兩步95 ℃預變性10 min,95 ℃變性15 s,60 ℃退火延伸45 s。以GAPDH為內參,2-ΔΔCt法計算最終mRNA相對表達量。PCR引物由武漢伯韜生物科技有限公司合成,引物序列,見表1。

表1 各基因PCR引物序列

1.2.7 Western blot檢測SIRT1、IRE1α、p-IRE1α、XBP1s、CHOP蛋白水平:從-80 ℃冰箱取出各組大鼠海馬組織,剪出一部分海馬組織放入裝有鋼珠的1.5 ml EP管中,自動制冷勻漿機勻漿,加RIPA裂解液,加入PMSF蛋白酶抑制劑,BCA蛋白檢測試劑盒進行定量分析。根據分子量制備相應分離膠,通過電泳、轉膜、5% BSA封閉,TBST洗膜,一抗主要有SIRT1(1∶2000)、IRE1α(1∶2000)、XBP1s(1∶2000)、CHOP(1∶2000)孵育,4 ℃過夜;TBST洗膜3次,每次10 min,稀釋二抗比例為1∶5000,將PVDF膜放置于二抗中,37 ℃搖床孵育1.5 h,TBST洗膜,超敏ECL顯色后曝光,以GAPDH為內參,計算目的蛋白相對表達量。

2 結 果

2.1 各組大鼠Morris水迷宮實驗結果比較 見表2(圖1)。術后4周,與假手術組比較,模型組、西藥組、溫肺降濁方各劑量組大鼠逃避潛伏期明顯延長,差異有統計學意義(P<0.01)。與模型組比較,穿越平臺次數明顯減少,差異有統計學意義(P<0.01),模型組、西藥組、溫肺降濁方各劑量組之間比較,差異無統計學意義(P>0.05)。術后8周,溫肺降濁方低劑量組逃避潛伏期、穿越平臺次數與模型組比較,差異無統計學意義(P>0.05)。溫肺降濁方中劑量組、溫肺降濁方高劑量組和西藥組逃避潛伏期均短于模型組,穿越平臺次數則增加,差異有統計學意義(P<0.05)。西藥組上述觀察項與溫肺降濁方高劑量組比較,差異無統計學意義(P>0.05)。

A:假手術組;B:模型組;C:西藥組;D:溫肺降濁方低劑量組;E:溫肺降濁方中劑量組;F:溫肺降濁方高劑量組

表2 各組大鼠逃避潛伏期和穿越平臺次數比較

2.2 各組大鼠病理學表現比較 見圖2、3。假手術組大鼠海馬CA1區神經元細胞排列規則緊密,細胞數目較多,形態大圓飽滿,胞漿滿布尼氏小體;模型組大鼠海馬CA1區神經元細胞排列雜亂松散,細胞數量較少,形態不規則,部分出現細胞核深染固縮,甚至破碎消失,尼氏小體含量明顯減少;與模型組比較,西藥組和溫肺降濁方各劑量組大鼠海馬CA1區神經元損傷減輕,細胞內部結構更加完整,存活的神經元數量增加,尼氏小體含量增多,其中以西藥組和溫肺降濁方高劑量組最顯著。

A:假手術組;B:模型組;C:西藥組;D:溫肺降濁方低劑量組;E:溫肺降濁方中劑量組;F:溫肺降濁方高劑量組

A:假手術組;B:模型組;C:西藥組;D:溫肺降濁方低劑量組;E:溫肺降濁方中劑量組;F:溫肺降濁方高劑量組

2.3 各組大鼠SIRT1、IRE1α、XBP1s、CHOP mRNA表達比較 見表3。與假手術組比較,模型組大鼠海馬組織SIRT1 mRNA表達下降,差異有統計學意義(P<0.01)。模型組IRE1α、XBP1s、CHOP mRNA表達高于假手術組,差異有統計學意義(P<0.01)。與模型組比較,西藥組、溫肺降濁方各劑量組大鼠海馬組織SIRT1 mRNA表達升高,差異有統計學意義(P<0.01)。與模型組比較,西藥組、溫肺降濁方各劑量組大鼠海馬組織IRE1α、XBP1s、CHOP mRNA表達降低,差異有統計學意義(P<0.01)。

表3 各組大鼠SIRT1、IRE1α、XBP1s、CHOP mRNA表達比較

2.4 各組大鼠SIRT1、IRE1α、p-IRE1α、XBP1s、CHOP蛋白表達比較 見表4(圖4)。與假手術組比較,模型組大鼠海馬組織中SIRT1蛋白表達下降,差異有統計學意義(P<0.01)。與假手術組比較,模型組大鼠海馬組織中p-IRE1α/IRE1α、XBP1s、CHOP蛋白表達升高,差異有統計學意義(P<0.01)。與模型組比較,西藥組、溫肺降濁方各劑量組大鼠海馬區SIRT1蛋白表達升高,且西藥組、溫肺降濁方高劑量組大鼠海馬區SIRT1蛋白表達最高,差異有統計學意義(P<0.01)。西藥組與溫肺降濁方高劑量組SIRT1蛋白表達比較,差異無統計學意義(P>0.05)。與模型組相比,西藥組、溫肺降濁方各劑量組p-IRE1α/IRE1α、XBP1s、CHOP蛋白下降,且西藥組、溫肺降濁方高劑量組大鼠各項蛋白表達最低,但兩組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

A:假手術組;B:模型組;C:西藥組;D:溫肺降濁方低劑量組;E:溫肺降濁方中劑量組;F:溫肺降濁方高劑量組

表4 各組大鼠海馬區各項蛋白表達量比較

3 討 論

VaD好發于老年人,且多繼發于腦血管病之后,隨著人口老齡化及社會科學技術發展,VaD的發病率逐年升高[10-11]。目前,西醫治療VaD主要是抗血小板聚集、預防腦血栓形成、擴張血管、改善腦供血和營養神經等,但其療效有限,且會產生一定不良反應,而中醫藥治療VaD,因其多靶點效應,治療效果較好,具有獨特優勢[12-13]。

中醫學中呆病多見呆傻愚笨、智能低下、善忘等神志異常癥狀,其病位主要在腦,與五臟功能失調相關[14]。本研究認為,肺臟功能失調與癡呆發病關系密切,肺藏氣,氣舍魄,肺氣虧虛,魄無所舍,可導致癡呆。肺主宣發肅降,參與全身水液代謝,若肺陽氣虧虛,則水液不能正常布散,聚濕生痰,蒙蔽清竅,導致癡呆。肺的肅降還影響腎的蟄藏功能,若肺失肅降,則腎不能正常藏精,無以濡養清竅,可發為癡呆。肺朝百脈,助心行血,肺陽氣虧虛,可導致血行不暢,血脈瘀滯,阻塞腦絡,清竅失養,發為癡呆。此外,肺與大腸相表里,肺失宣降則大腸傳導功能失司,糟粕結于腸道,化生濁毒,上干腦竅,亦可發為癡呆。故治療應予以溫肺降濁之法,方用溫肺降濁湯,方中附子、干姜溫肺散寒為君藥,黨參補益肺氣為臣藥;田七活血化瘀,酒大黃下瘀血、破積聚、蕩滌腸胃、推陳致新、通利水谷、安和五臟共為佐藥;炙甘草補中緩急、潤肺降逆、調和諸藥為使;全方共奏溫肺降濁之功。

Morris水迷宮試驗是檢測大鼠學習和記憶能力的首選試驗[15]。本研究結果顯示,術后4周模型組、西藥組和溫肺降濁方各劑量組大鼠逃避潛伏期較假手術組明顯延長,穿越平臺次數明顯減少,說明VaD大鼠學習和記憶能力明顯下降,造模成功。應用溫肺降濁方干預后,術后8周水迷宮結果顯示,溫肺降濁方中劑量組和溫肺降濁方高劑量組大鼠逃避潛伏期較模型組明顯縮短,穿越平臺次數明顯增加,且溫肺降濁方高劑量組療效與尼莫地平組相當,說明溫肺降濁方可改善VaD大鼠的學習和記憶能力。

海馬CA1區與學習和記憶能力密切相關[16]。本研究結果顯示,與假手術組比較模型組大鼠海馬CA1區病理損傷嚴重,神經元細胞明顯減少,且排列疏松紊亂。應用溫肺降濁方干預后,溫肺降濁方各劑量組大鼠海馬CA1區病理損傷較模型組不同程度減輕,神經元細胞明顯增加,且排列緊密有序,說明海馬CA1區病理損傷與VaD大鼠學習和記憶能力下降有關,且溫肺降濁方可減輕VaD大鼠海馬CA1區病理損傷。

有研究表明,ERS與VaD中的學習及記憶缺陷程度相關[17]。ERS通過激活未折疊蛋白反應(Unfolded protein response,UPR)來維持內質網內的細胞內穩態[18]。IRE1α是激活ERS的關鍵因子。當UPR發生時,蛋白激酶R樣內質網激酶、IRE1α和激活轉錄因子6(Activating transcription factor 6,ATF6)三條ERS途徑被激活以維持細胞內穩態[19-21]。當UPR超過內質網的負荷時,會激活XBP1s,并被轉移到細胞核以外進而激活CHOP蛋白,導致神經元凋亡[22]。SIRT1是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性脫乙酰酶,被認為參與細胞衰老和老化的調節,在神經變性疾病中起關鍵作用[23]。SIRT1可調節樹突和軸突生長,在神經系統的發育中發揮重要作用,并對記憶和突觸可塑性具有調節作用[24]。有研究發現,提高大鼠體內SIRT1表達可以改善其認知及學習水平,減少神經元損失,抑制炎癥,并且抑制VaD大鼠海馬中細胞凋亡和氧化應激。此外,多項報道已經證實,SIRT1的激活可以減輕由ERS引起的細胞損傷,并且下調ERS通路表達水平[17-19]。還有研究證實,SIRT1可以使真核生物起始因子2a脫乙?；?以減少神經細胞由ERS引起的損傷[25]。本研究顯示,在VaD模型組大鼠中SIRT1 mRNA和蛋白表達水平明顯下降,IRE1α、XBP1S、CHOP mRNA和XBP1S、CHOP蛋白以及p-IRE1α/IRE1α水平明顯升高,說明VaD發生時ERS被顯著激活。溫肺降濁方通過激活SIRT1,下調IRE1α/XBP1s/CHOP通路,從而抑制ERS。