巴戟天多糖對大鼠骨質疏松的作用機制研究

張民珍,羅 文,楊黎艷,鄺慧芳

(海南醫學院第一附屬醫院,海南 ?？?570102)

骨質疏松(Osteoporosis,OP)是以低骨質量和骨組織細微結構遭破壞為臨床表現的全身性疾病[1]。OP具有較高的發病率、復發率,降低患者生活質量[2]。中醫學并無OP病名,醫學古代經典文獻中有相仿癥狀的病癥記載,例如“骨痿”“骨枯”等。中醫認為,腎精充足則“齒更發長”,腎精的盛衰關乎骨的生長、發育、強弱,骨骼強健有力,腎精虧損,骨骼失養,產生骨病。中藥巴戟天用來健骨保腎、消腫止痛,治療骨質疏松、股骨頭壞死等骨科疾病。巴戟天為雙子葉屬茜草科植物,又名雞眼藤、三角藤、雞腸風等,張景岳在《景岳全書》中記載:“雖曰足少陰腎經之藥,然亦能養心神,安五臟,補五勞,益志氣,助精強陰。治陰痿不起,腰膝疼痛及夜夢鬼交,遺精尿池,小腹陰中相引疼痛等證”。陶弘景在《名醫別錄》中謂其具有“頭面游風,小腹及陰中相引痛,下氣,補五勞,益精,利男子”?，F代中藥學總結了前人的記錄,巴戟天其味甘、辛,性微溫,歸腎、肝經,具有補腎陽、強筋骨、祛風濕之功效,用于陽痿遺精、月經不調、宮冷不孕、少腹冷痛、筋骨痿軟、風濕痹痛。近年來,中醫在OP治療中呈現顯著優勢,OP發病機制復雜,體內環境、作息規律、新陳代謝水平及基因遺傳等因素都可能引發OP[3]。巴戟天多糖為巴戟天的有效活性成分,臨床試驗及動物模型均證實,其改善骨質量作用明顯,且不良反應輕微[4-5]。因OP患者的骨密度和骨質量下降,增加了骨折風險,骨折并發癥多發生在50歲以上人群中,男女分別占比1/3、1/5,嚴重影響患者健康狀態?？谇恢械膹U用殘根會吸收剩余牙槽骨,降低剩余牙槽骨形態,因長久缺少咀嚼力刺激,骨小梁密度降低、疏松,骨髓間隙變大,弱化甚至喪失咀嚼功能。鈣結合蛋白-D9k(Calbindin-D9k,CaBp-D9k)是一種與腸道中鈣具有高度貼合性的細胞內蛋白質,主要集中在杯狀細胞與小腸刷狀緣的吸收細胞中,參與小腸鈣細胞內轉運過程,受活性維生素D調節[6]。骨生物力學將骨強度和抗骨折能力通過指標檢測直接反映出來,具有評價骨骼特性和抗OP藥物療效作用。本文主要研究巴戟天多糖對OP大鼠廢用殘根咀嚼功能、CaBp-D9k、骨生物力學的作用機制,為相關研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物:30只SPF級SD雌性大鼠,鼠齡4～6周,平均體重(220±20)g,由河北醫科大學動物實驗中心提供,大鼠[合格證號708068、許可證號SCXK(冀)2018-2-017],大鼠于海南醫學院實驗動物中心飼養,平均溫度(24±2)℃,濕度50%～80%,12 h晝夜交替,正常飲食及攝水,按照《實驗動物管理條例》規定進行實驗。

1.1.2 實驗藥物:干燥巴戟天根莖購自美國 Signal Chemical公司,用10倍溫水浸泡1 h后于75 ℃下熱煎,冷卻得到巴戟天浸膏,加入95%乙醇,配比為1∶4,置于2 ℃冰箱沉淀,經離心得巴戟天多糖,經低壓凍干、去蛋白、膜濾過及凝膠柱分離程序得到白色粉末狀巴戟天多糖成品,濃度2.0 g/ml溶液,4 ℃密封保存備用,結構分析由海南醫學院中心實驗室完成。

1.1.3 實驗試劑:TNF-α試劑盒(貨號ml002953,上海酶聯生物科技有限公司);IL-6試劑盒(貨號ml102828,上海酶聯生物科技有限公司);ALP試劑盒(貨號ml092964,上海酶聯生物科技有限公司);CaBp-D9k一抗(貨號D9K12-S,北京達科為生物技術有限公司);鈣結合蛋白-D28k(Calbindin-D28k,CaBp-D28k)一抗(貨號PRO-400,上海淳麥生物科技有限公司);二抗IgG[貨號A21020-1,亞科因(武漢)生物技術有限公司];GAPDH(批號C1319-100,北京普利萊基因技術有限公司)。

1.1.4 實驗儀器:高速離心機(型號GDR525C,深圳市三莉科技有限公司);雙能X線掃描骨密度儀(型號Dexa Pro-L,徐州品源電子科技有限公司);酶標分析儀(型號RT-6100,Rayto公司);三點彎曲實驗機(型號 shqx,上海企想檢測儀器有限公司);顯微CT(型號nanoVoxel-1000,天津三英精密儀器股份有限公司);免疫分析儀(型號UNION-A,深圳市亞輝龍生物科技有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型建立:對參與實驗的大鼠常規飼養,除正常組外,其余均建立OP大鼠模型。用110 mg/kg苯巴比妥鈉對大鼠進行腹腔注射麻醉,麻醉完成后將大鼠固定于動物手術臺,常規消毒后從大鼠腰背側取切口,順子宮切除雙側卵巢,縫合皮膚,以云南白藥粉做傷口預防感染藥物,術后分籠飼養。術后第4周,采用數字化快速雙能X線掃描骨密度儀檢測大鼠右側股骨的骨密度(Bone mineral density,BMD)值,OP模型均已建立成功[7]。

1.2.2 分組及給藥:30只大鼠按照隨機數字表法分為正常組、模型組、巴戟天多糖低劑量組、巴戟天多糖中劑量組、巴戟天多糖高劑量組,每組6只。建模成功后,根據人與大鼠表面積換算法[8]計算給藥劑量。對巴戟天多糖低劑量組、巴戟天多糖中劑量組、巴戟天多糖高劑量組大鼠分別用1 ml注射器灌胃,濃度為50 mg/ml的1、2、3 ml巴戟天多糖溶液,其余組大鼠灌胃約2 ml的蒸餾水。各組大鼠均按每天2次灌胃,連續7 d。

1.2.3 ELLSA法檢測:檢測各組大鼠血清腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素6(Interleukin-6,IL-6)、堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)水平。末次灌胃結束后,抽取各組大鼠腹腔動脈血3 ml,取30 μg勻漿離心,15 min后分離上清液,設置標準品孔、空白孔、反應孔并加入不同濃度梯度的標準品、稀釋樣品和蛋白裂解物,各50 μl,加酶密封,培養箱37 ℃孵育,1 h后棄去孔內液體,甩干洗滌加DAB顯色底物,再入培養箱37 ℃孵育,15 min后加入終止液,多功能酶標儀檢測波長在450 nm處吸光度值,用ELLSA試劑盒檢測各組大鼠血清TNF-α、IL-6、ALP水平。

1.2.4 股骨頸BMD、骨鈣、骨磷含量測定:采用雙能X射線骨密度儀檢測各組大鼠股骨頸BMD值,BMD測定完成后,收集股骨置于800 ℃馬弗爐中高溫灰化,采用灰化的標本中用乙二胺四乙酸(Ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)滴定法,通過與金屬離子發生絡合反應,利用金屬指示劑的光學方法滴定終點處,根據用量測定股骨頸中骨鈣、骨磷含量。

1.2.5 廢用殘根牙槽骨骨小梁解剖結構形態計量學指標測定:采用顯微CT掃描大鼠牙槽骨,記錄廢用殘根牙槽骨骨體積分數、骨小梁數量、骨小梁分離度、骨小梁厚度骨形態計量學指標。

1.2.6 骨生物力學參數測定:取大鼠股骨,剔除附著的肌肉組織并用0.9%氯化鈉溶液紗布和錫紙包裹,置于-20 ℃冰箱保存,測定時,取出放入0.9%氯化鈉溶液于室溫下浸泡,3 h后取流變儀,對解凍的股骨進行加載速度為5 mm/min、跨距為8 mm的三點彎曲實驗。通過載荷-變形曲線計算最大載荷、最大橈度、彈性載荷及剛性系數。

1.2.7 股骨組織CaBp-D9k和CaBp-D28k蛋白表達測定:取大鼠股骨組織標本剪切為細小碎片,加入裂解液,于12000 r/min離心10 min,留取上清液,收集蛋白。每100 μl的蛋白混合等體積5×上樣緩沖液,浴箱中100 ℃加熱5 min,待變性發生后進行10%的SDS-PAGE凝膠電泳,通過轉膜、封閉、洗膜后加一抗CaBp-D9k(1∶200)、CaBp-D28k(1∶200),溫度選擇4 ℃孵育過夜,加入過氧化物酶抗兔IgG二抗(1∶2500),選擇時間2 h封閉完成后加入洗滌液進行洗滌,10 min/次,重復3次。用DAB顯色試劑盒在X線膠片感光、顯影、定影完成后在暗室中完成顯色。內參以GAPDH蛋白為標準,IPP 6.0軟件檢測蛋白電泳帶灰度值、GAPDH條帶灰度值比值,比較對比值。

2 結 果

2.1 各組大鼠血清TNF-α、IL-6、ALP水平比較 見表1。與正常組比較,模型組大鼠TNF-α、IL-6水平升高,ALP含量降低,差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較,巴戟天多糖低劑量組、巴戟天多糖中劑量組、巴戟天多糖高劑量組大鼠TNF-α、IL-6水平逐漸降低,ALP含量逐漸升高,差異有統計學意義(P<0.05)。巴戟天多糖低劑量組、巴戟天多糖中劑量組、巴戟天多糖高劑量組大鼠組間比較,TNF-α、IL-6水平逐漸降低,ALP含量逐漸升高,差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 各組大鼠血清TNF-α、IL-6、ALP比較

2.2 各組大鼠股骨頸BMD及骨鈣、骨磷含量比較 見表2。與正常組比較,模型組大鼠股骨頸BMD、骨鈣、骨磷含量降低,差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較,巴戟天多糖低劑量組、巴戟天多糖中劑量組、巴戟天多糖高劑量組大鼠股骨頸BMD、骨鈣、骨磷含量逐漸升高,且巴戟天多糖高劑量組大鼠BMD、骨鈣、骨磷含量最高(P<0.05)。

表2 各組大鼠BMD及骨鈣、骨磷含量比較

2.3 各組大鼠骨形態計量學指標比較 見表3。與正常組比較,模型組大鼠廢用殘根牙槽骨骨體積分數、骨小梁厚度、骨小梁數量降低,骨小梁分離度升高,差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較,巴戟天多糖低劑量組、巴戟天多糖中劑量組、巴戟天多糖高劑量組大鼠廢用殘根牙槽骨骨體積分數、骨小梁厚度、骨小梁數量逐漸升高,骨小梁分離度逐漸降低,且巴戟天多糖高劑量組大鼠骨體積分數、骨小梁厚度、骨小梁數量最高,骨小梁分離度最低,差異有統計學意義(P<0.05)。

表3 各組大鼠骨形態計量學指標比較

2.4 各組大鼠骨生物力學參數比較 見表4。與正常組比較,模型組大鼠股骨頸最大載荷、最大橈度、彈性載荷、剛性系數均低,差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較,巴戟天多糖低劑量組、巴戟天多糖中劑量組、巴戟天多糖高劑量組大鼠股骨頸最大載荷、最大橈度、彈性載荷、剛性系數逐漸升高,且巴戟天多糖高劑量組大鼠組的最大載荷、最大橈度、彈性載荷及剛性系數最高,差異有統計學意義(P<0.05)。

表4 各組大鼠骨生物力學參數比較

2.5 各組大鼠股骨組織CaBp-D9k與CaBp-D28k蛋白表達比較 見表5(圖1)。與正常組比較,模型組大鼠股骨組織CaBp-D9k與CaBp-D28k蛋白表達均低,差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較,巴戟天多糖低劑量組、巴戟天多糖中劑量組、巴戟天多糖高劑量組大鼠股骨組織CaBp-D9k與CaBp-D28k蛋白表達逐漸升高,且巴戟天多糖高劑量組大鼠CaBp-D9k與CaBp-D28k蛋白表達最高,差異有統計學意義(P<0.05)。

圖1 各組大鼠CaBp-D9k、CaBp-D28k蛋白電泳圖

表5 各組大鼠股骨組織CaBp-D9k與CaBp-D28k蛋白表達比較

3 討 論

OP主要表現為BMD減少,骨微結構斷裂[9-10]?，F代醫學認為,巴戟天所含β-蒽醌、2,4-二乙基膽固醇、多糖等活性成分可預防組織氧化,保護腎臟,提高成骨細胞活性[11]。中醫認為,OP由腎精弱骨骼失養引發[12-13]。巴戟天可滋補腎陽,益氣強筋骨,平和臟器。巴戟天的多種提取物包括醚類化合物、寡糖及多糖等均可以刺激體外培養成骨細胞增殖,對骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化發揮誘導作用,其中巴戟天多糖能夠上調骨骼內礦物質及微量元素含量,效果明顯。巴戟天為我國南方藥材之中較為著名者,以肉質根入藥,始載于《神農本草經》:“巴戟天,味辛,微溫。生山谷。治大風邪氣,陰痿不起,強筋骨,安五臟,補中增志益氣”[14]?！侗静菥V目》曾介紹:巴戟天,性味甘辛,溫,具有補腎壯陽、益精血、強筋骨、明目、消腫等功效,主治腎虛陽痿、遺精、早泄、腰膝冷痛、四肢無力、耳聾、目暗、久咳、癲癇等癥狀。巴戟天包含糖類、有機酸類以及微量元素等多種功能因子,除具有補腎壯陽、祛風濕等作用外,在抗抑郁、炎癥、痛感、氧化、衰老及免疫調節等方面均有影響。巴戟天為雙子葉屬茜草科植物,屬于酸性多糖,具有糖的特性和三股螺旋結構,溶解性較好,不含蛋白質或多肽,可強筋骨、安五臟,其有效成分中的巴戟天多糖可刺激成骨細胞合成、分泌和礦化,恢復骨骼重建的動態平衡,改善OP。巴戟天從中藥藥理的角度來看屬于補虛藥,其現代藥理作用的臨床應用也很廣泛,對骨生長是其重要作用之一。巴戟天含有直接刺激體外培養成骨細胞增殖的成分,能夠促進成骨細胞分泌ALP、骨鈣素。巴戟天多糖作為巴戟天活性成分,對體外培養成骨細胞增殖具有促進作用,提高分化中成骨細胞分泌ALP水平,增加骨鈣素,使局部磷酸根PO43-濃度升高,破壞鈣化抑制劑,啟動鈣化,增加鈣含量。

本文研究結果顯示,與模型組比較,巴戟天多糖低劑量組、巴戟天多糖中劑量組、巴戟天多糖高劑量組大鼠BMD、骨鈣、骨磷、ALP含量及CaBp-D9k與CaBp-D28k蛋白逐漸升高,血清TNF-α、IL-6水平逐漸降低,且生物力學功能改善明顯,說明巴戟天多糖可抑制炎癥因子活化,增加大鼠BMD、骨鈣、骨磷及ALP含量,增強廢用殘根的咀嚼功能,并呈劑量依賴性。BMD可反映OP發展程度,與ALP共同由成骨細胞分泌合成,作為骨轉換和骨形成的特異性指標出現。OP發生后,骨總量減少,骨鈣、骨磷喪失明顯,血清TNF-α、IL-6表達增高,對成骨細胞成熟進行抑制,加重骨吸收。咀嚼過程中,廢用殘根通過牙周膜作用,將垂直壓力轉換成拉力于牙槽骨上,牙槽骨骨小梁受拉力刺激增加,增強骨組織致密性,延緩患牙的牙槽骨吸收。研究表明,巴戟天多糖能夠有效升高OP大鼠BMD含量,恢復血清磷水平,增加ALP分泌[15]。巴戟天多糖能升高OP大鼠BMD,增加尿鈣、血鈣、血磷含量,促進OP恢復[16]。文獻證實,對切除卵巢后OP大鼠給予巴戟天多糖干預后,BMD升高,血清IL-6、TNF-α水平得到抑制,增加血清鈣、磷等微量元素,并呈劑量依賴性,說明巴戟天多糖能提高切除卵巢后大鼠BMD,可能通過降低血清IL-6、TNF-α表達,刺激成骨細胞成熟,改善OP作用[17]。巴戟天含有豐富的多酚類化合物,如黃酮類和酚酸類,這些化合物具有強大的抗氧化作用,可以中和自由基,增強機體免疫功能,減少炎癥反應和損傷。通過觀察廢用殘根的骨小梁參數,可以了解骨小梁微觀結構反映的咀嚼能力退化情況。骨生物力學將經典力學與骨科學相結合,對骨的力學問題進行分析,直接反映骨的結構與骨強度、硬度、韌性之間的關系,最大載荷、彈性載荷反映抵抗破壞能力,剛性系數、彈性模量代表骨抵抗變形能力。OP會引發鈣吸收障礙,降低營養物質生物利用度,而CaBp-D9k、CaBp-D28k是腸道鈣主動吸收的協助蛋白,CaBp-D9k、CaBp-D28k活性下降會加重鈣吸收障礙,促進OP發展。巴戟天具有激活維生素D受體作用,維生素D在人體內被激活后,能夠增加腸道對鈣的吸收。因此,巴戟天通過激活維生素D受體,可促進鈣吸收。研究表明,對OP大鼠主動增強咀嚼功能后,骨體積分數增加,骨小梁厚度、骨小梁數量升高明顯,降低了骨小梁分離度[18]。咀嚼負荷減小會降低生長期大鼠下頜骨的力學性能,弱化咀嚼功能[19]。目前,臨床應用巴戟天多糖對OP廢用殘根咀嚼功能的研究較少,巴戟天多糖可能通過改善OP大鼠廢用殘根牙槽骨骨小梁解剖結構形態計量學指標,提升咀嚼功能。有研究發現,對大鼠進行彎曲實驗后,正常對照組大鼠彎曲破壞載荷、彎矩、彎曲應力、彈性模量等彎曲性能指標均大于OP組,說明OP會對骨結構力學產生影響[20],這與本文研究一致。巴戟天多糖可增加大鼠椎骨松質骨骨小梁面積,增加股骨最大負荷和模數,改善去卵巢OP大鼠模型的骨物理學骨生物力學和形態學指標,具有治療OP作用[21]。研究顯示,OP大鼠模型的小腸黏膜CaBP-D9k mRNA、CaBP-D28k mRNA表達水平下降[22]。有研究發現,維生素D3的活性代謝產物1,25二羥維生素D3[1,25-dihydroxy vitamin D3,1,25(OH)2D3]可與維生素D受體結合,提升CaBp-D9K活性水平,延緩OP發展,增加CaBp-D9K基因轉錄[23]。研究表明,與空白組、假手術組相比,OP組大鼠血清1,25(OH)2D3水平和小腸CaBp-D9k mRNA表達降低,說明去卵巢大鼠OP的發生可能與腸黏膜CaBp-D9k mRNA表達降低所致的鈣吸收障礙密切相關[24]。通過增加OP大鼠腸道CaBP-D9k基因表達,增強CaBP-D9k合成,可平衡負鈣狀態,抑制破骨,促進成骨形成[25]。本文認為,巴戟天多糖通過抑制炎癥因子活化,增加骨鈣、磷及BMD、ALP含量,增加鈣離子在機體彌散速度,促進鈣吸收,改善骨生物力學功能,實現治療骨質疏松目的。

本研究表明,巴戟天多糖對骨質疏松具有明顯保護作用,為臨床治療OP提供理論依據,但本文存在一定不足,存在時間及樣本量不足,未進行更多實驗組別及實驗內容,可能對結果產生一定影響,后期應加強合作,擴大樣本量,充實內容,為OP研究提供實驗依據。