水產品過敏原及其檢測技術概述

劉 紅，陳一瑜，劉慶梅，張凌晶，曹敏杰，劉光明*

（1 集美大學海洋食品與生物工程學院 廈門市海洋功能食品重點實驗室福建省海洋功能食品工程技術研究中心 福建廈門361021 2 華僑大學材料科學與工程學院 福建廈門 361009）

水產品因鮮美的味道和豐富的營養而深受消費者青睞。其中，魚和甲殼類水產品屬于聯合國糧農組織和世界衛生組織認定的過敏食物[1]。流行病學及食物過敏調查發現，水產品是我國過敏人群的主要致敏物[2-4]。近年來我國水產養殖業和水產食品加工業發展迅猛，2021 年我國水產品總產量達到6 693 萬t，食用消費量2 965 萬t，加工消費達到2 783 萬t，消費總量6 888 萬t[5]。隨著水產品消費量出現的大幅度增長，隨之引發的水產品過敏問題也日益嚴峻。除了水產品本身外，其作為原料或配料被廣泛添加到各類食品中，由此擴大了含有水產品致敏成分的食物種類，導致出現許多潛在的水產品過敏原組分[6-7]。截至2021 年3 月，世界衛生組織和國際免疫學會聯合會過敏原命名小組已命名1 036 種過敏原[8]，同時指出應在產品標簽中提示過敏原信息；我國也頒布預包裝食品標簽通則，增加了致敏物質的標識[9]。事實上水產食品在加工、運輸、貯藏過程中有可能受到外來過敏原的污染，標簽中難以對交叉污染產生的過敏原進行標注。消費者僅根據明確的標簽標識，難以預防對過敏原的攝入[10]。由此水產食物過敏引起的食品安全問題日益嚴峻，嚴重制約了行業的發展。明確水產食品中的過敏原，利用適當的檢測技術對水產品及其加工、運輸、貯藏過程中所含過敏原進行檢測、監控，有利于評估水產品過敏的潛在風險，預防過敏疾病的發生。根據近年的研究報道，本文概述水產品過敏原及其檢測技術。

1 水產品過敏原概述

水產品過敏原，來自水產品中的蛋白質，能夠誘導人體產生特異性IgE 抗體應答的抗原性物質[11]，一般分子質量為10～100 ku，且相對分子質量越高，結構越復雜，其致敏性越強。其多為酸性糖蛋白，具有酸性等電點。由于過敏原的糖基化作用可能在一定程度上使其維持更為穩定的結構，因此普遍具有較好的耐酸堿和熱穩定性，耐胃腸液中消化。在食品加工處理和人體消化過程中過敏原不易被破壞，相關過敏人群一旦食用，極易引發水產食物過敏性疾病，發病癥狀也趨于復雜化和嚴重化，在皮膚、胃腸系統、呼吸系統方面會出現不同程度的過敏癥狀，嚴重時甚至昏厥、休克[12]。不同水產過敏原可能存在相同的抗原決定簇，從而發生免疫交叉反應，使過敏患者在食用不同的水產品時均發生過敏反應，且因個體差異，最低食用量各異，過敏癥狀通常伴隨終身[13-15]。

水產品富含蛋白質，其中只有極少數蛋白質能夠引發過敏反應。通常將能誘發50%過敏患者產生過敏反應的蛋白質稱為主要過敏原，而次要過敏原即其它引起過敏反應的蛋白質。目前已發現并鑒定的魚類過敏原有小清蛋白（Parvalbumin，PV）、魚類膠原蛋白（Collagen，CO）、β-烯醇酶（β-Enolase）、醛縮酶A（Aldolase A）、魚卵中的β′-組分（β′-Component，β′-c）及魚精蛋白（Protamine）等；甲殼類水產品過敏原有原肌球蛋（Tropomyosin，TM）、精氨酸激酶（Arginine kinase，AK），肌質鈣結合蛋白（Sarcoplasmic calcium-binding protein，SCP）、磷酸丙 糖異構 酶（Triosephosphate isomerase，TIM）、肌球蛋白輕鏈（Myosin light chain，MLC）、細絲蛋白c（Filamin C，FLN c）、肌鈣蛋白C（Troponin C，TnC）和血藍蛋白（Hemocyanin，HMC）等[16]，其理化性質和生物學功能詳見表1。目前，關于水產品過敏原的檢測類研究主要集中在魚類主要過敏原PV、甲殼類及軟體類動物泛過敏原TM 中。

表1 水產品過敏原的理化性質和生物學功能Table 1 Physicochemical properties and biological functions of aquatic products allergens

2 水產品過敏原檢測技術

水產品過敏原的檢測技術是基于生物標志物（DNA 或蛋白質）開發的[50-51]，主要有基于基因水平的核酸檢測技術和基于蛋白水平的免疫檢測技術及質譜檢測技術。核酸檢測技術是通過測定擴增的過敏原DNA 片段來實現，主要包括聚合酶鏈式反應（PCR）、實時熒光PCR 技術、環介導等溫擴增（LAMP）技術等。免疫檢測技術是通過抗原和抗體的特異性結合產生的變化來實現，主要包括酶聯免疫吸附（ELISA）技術、免疫印跡技術、免疫層析技術、免疫傳感器技術等。質譜檢測技術是通過測定過敏原完整蛋白或酶解肽段的離子質荷化來實現，主要包括自上而下（Top-down）分析策略、自下而上（Bottom-up）分析策略。

2.1 基于基因水平的核酸檢測技術

2.1.1 PCR 技術 根據編碼過敏原的DNA 序列，設計特異性引物，使用DNA 聚合酶進行變性-退火-延伸多次循環擴增，利用擴增后的核酸產物進行測定，從而實現水產品過敏原的定性分析。該技術的特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。Phan 等[52]設計了特異性引物Tropo-F 和Tropo-R，建立了用于檢測蝦源主要過敏原TM 基因的PCR 檢測方法，可以成功識別加工食品中的TM 基因。常規PCR 技術主要對單一過敏原進行定性檢測，若在同一PCR 反應體系中加上多對特異性引物，即可實現多重PCR 反應，可對水產品中多種過敏原進行定性檢測[53]。Suh 等[54]利用多重PCR 技術并與毛細管電泳技術相結合，對牡蠣、貽貝、鮑魚、蛤蜊TM 基因進行測定，DNA 的檢測限（LOD）為16 pg/mL。然而，多重PCR 易受引物間競爭擴增的影響，方法體系優化相對復雜。PCR技術不會嚴格要求模板DNA 的純度及其完整性，所需PCR 儀造價較便宜，然而后續的基因分析還需借助電泳、熒光檢測或測序技術才能實現最終檢測任務，檢測流程繁瑣，不能準確定量，而且極微量的污染即可造成假陽性。

2.1.2 實時熒光PCR 技術 通過在PCR 反應體系中加入熒光基團，利用熒光檢測系統實時監測累積的熒光強度，從而實現對水產品中過敏原的定性、定量分析。其中特異性的熒光探針Taqman探針法和非特異性的SYBR Green I 熒光染料法是常用的熒光標記方法。Sun 等[55]建立了一種基于TaqMan 標記探針技術的實時熒光PCR 檢測魚類主要過敏原PV 的方法，DNA 的靈敏度達5 pg/mL。Prado 等[56]建立了同時檢測鯖魚和金槍魚DNA 的實時熒光PCR 方法，靈敏度高達5 pg/mL。該技術把核酸擴增、雜交、光譜分析和實時檢測技術結合在一起，實現了從定性到定量的飛躍，自動化程度更高，避免了交叉污染，省去了后續染色及熒光檢測等步驟，節省人力，準確度更高，然而需要實時熒光定量PCR 儀，設備成本相對較高。

2.1.3 LAMP 技術 LAMP 技術是一種新型的核酸擴增技術，針對靶基因的6 個區域設計4 條特異性引物，等溫條件下在鏈置換型DNA 聚合酶作用下，可將目標基因在15～60 min 內擴增9～10倍，根據產物渾濁度或綠色熒光等的指標，實現水產品中過敏原的定性、定量分析。Sheu 等[57]利用LAMP 技術30 min 內可以檢測出含有0.01%的蝦類DNA，與螃蟹、龍蝦等其它甲殼類動物的DNA無交叉反應，可用于對食品中蝦類過敏原的鑒定。張懿翔等[58]利用LAMP 技術檢測出含牡蠣過敏成分0.1%，DNA 質量濃度為0.01 pg/mL 的樣品。該技術縮短了檢測時間，可在微量體系下完成，對儀器、設備的要求降低，只需水浴鍋或恒溫箱就能實現反應，產物易檢測，簡便、快捷，適合基層快速診斷，然而引物設計難度較大，較高的擴增效率也易引起環引物間的非特異性配對，導致假陽性的結果。

2.2 基于蛋白水平的免疫技術

2.2.1 ELISA 技術 ELISA 技術是將免疫反應的特異性和酶的高效催化作用相結合的檢測技術。將已知的抗原或抗體吸附在聚苯乙烯微量反應板表面，利用酶標記抗體與之發生特異性結合，并以酶作用底物后的顯色深淺來實現對水產品中過敏原的定性、定量分析。主要有競爭法、雙抗體夾心法、間接法等。Cai 等[59]制備了鰱魚細小蛋白單克隆抗體，建立了一種競爭ELISA 法測定鰱魚體內PV，LOD 為0.04 μg/mL。Koppelman 等[60]用大西洋蛤和海洋圓蛤混合蛋白免疫兔和綿羊，制得包被抗體和二抗，建立雙抗體夾心ELISA 檢測食品中蛤蜊過敏原，LOD 為2.5 mg/kg。雙抗體夾心ELISA法靈敏度和特異性更高，被廣泛用于水產品過敏原的篩選和常規檢測領城，然而所檢測的抗原必須擁有兩個以上的抗體結合部位，制備抗體比較困難。ELISA 技術目前只能針對一種過敏原的分析，無法進行多殘留檢測，對具有抗原決定簇類似結構的過敏原存在一定的交叉反應。目前，快速和高通量的過敏原ELISA 檢測試劑盒已商業標準化[61]。只需1 臺酶標儀即可大批量檢測樣品，方法簡便，易于推廣，然而受樣本基質、試劑以及試驗操作等因素影響較大。

2.2.2 免疫印跡（Western blot）技術 免疫印跡技術是將特異的固相免疫和高分辨率的凝膠電泳相結合的檢測技術，通過單向或二維凝膠電泳技術將需要測定的蛋白轉移到硝酸纖維素膜等固相載體上，利用抗原和抗體在固定相上發生免疫反應，再與酶標記的抗體反應，并通過底物顯色完成水產品中過敏原的定性或半定量分析。汪寧等[62]應用抗蛙PV 單克隆抗體，利用Western blot 分析5 種魚、2 種魚糜制品和3 種魚罐頭中PV，結果顯示該方法能有效確定魚類制品中的PV。該技術主要用于發現和鑒定新的過敏原，通常與斑點免疫印跡法（Dot blot）相結合進行聯合確認。Dotblot 樣品不需通過電泳轉膜，直接點在固相載體上，根據斑點的強度實現水產食品中過敏原的半定量檢測。Han 等[36]對葡萄牙牡蠣SCP 的過敏原性研究，采用Western blot 及Dot blot 聯合分析SCP 的免疫結合活性。Western blot 技術先利用電泳的方式可分離不同分子質量的蛋白質組分，再進行過敏原的確認，可有效避免蛋白質抑制劑存在的影響。對于復雜的樣品，可采用雙向電泳實現更高程度的分離。免疫印跡技術對試劑需求量少，分析容量大，檢測流程繁瑣，分析時間長，易受水產品基質的影響。

2.2.3 免疫層析技術 免疫層析技術是將免疫技術和色譜層析相結合的檢測技術，將抗體固定于硝酸纖維素膜的某一區帶，把干燥的一端浸入待測物后，樣品沿膜向前運動達到檢測區，與標記的抗體捕獲物特異結合而聚集顯色，從而實現水產品中過敏原的定性分析。檢測的關鍵在于著色標記物的靈敏度，常用免疫膠體金或免疫酶染色作為標記物，一些新型材料如超順磁性納米微球具有較高的靈敏度。Zhang 等[63]以Fe3O4/Au 納米微球為標記物，制備的免疫層析試紙條可在15 min 內檢測魚過敏原PV，具有良好的檢測特異性及穩定性，LOD 為2 ng/mL。利用該技術制備的檢測試紙，對待測物進行快速、準確顯色，不需要其它儀器、設備和專業臨檢人員，用于現場快速檢測，操作簡單，攜帶方便，基層可以開展，然而檢測結果靠肉眼判斷，存在靈敏度較低，難于定量化的局限，同時標記物制作成本較高。

2.2.4 免疫傳感器技術 免疫傳感器技術是將免疫反應的特異性與傳感技術的高靈敏度相結合的檢測技術，將抗體作為識別元件，利用抗原-抗體發生的特異性結合所產生的物理、化學信號的變化來實現水產品中過敏原的定性或定量分析[64]。Angulo 等[65]將絲網印刷電極結合羧甲基化磁珠作為抗體固相，將辣根過氧化物酶標記二抗構建在磁珠上，并與電化學傳感系統耦合，研制出一種用于微量檢測蝦TM 電化學免疫傳感器，3 h 內的LOD 為47 pg/mL，磁珠的使用提高了捕獲抗原的效率，利用磁珠修飾絲網印刷電極提高了電極的導電率。Zhou 等[66]將抗TM 單克隆抗體固定在納米金薄膜傳感器芯片表面，建立表面等離子共振免疫傳感器技術，實現貝類樣品中TM 的實時檢測，LOD 為1.0 μg/mL。免疫傳感器技術利用傳感器記錄、檢測和分析抗原抗體反應的結果，簡化了分析過程，減少了分析時間，降低了檢測下限，提高了靈敏度，具有設備小型化，測量過程自動化的特點，然而生物傳感器制作較為復雜，費用較高。

2.3 基于蛋白水平的質譜技術

2.3.1 Top-down 分析策略 Top-down 分析策略是將完整蛋白碎裂后進行全局分析。該分析策略樣品制備相對簡單，無需進行蛋白質酶解，也不依賴抗原抗體的制備，試驗耗時減少，具有高分辨率、高靈敏度、蛋白序列覆蓋率高等優點。該策略主要用于完整過敏原蛋白的定性確認，定量分析應用較少。Top-down 定性確認策略通常將完整的過敏原離子化后引入到質譜，通過碎片裂解技術最終得到完整蛋白和碎片離子的質荷比信息，最后采用生物信息檢索推演多肽序列和修飾位點，可以鑒定出相關的蛋白質亞型和翻譯后修飾位點，實現水產品中過敏原的定性鑒定。一般利用分離技術（如液相色譜或2-D 凝膠電泳）從復雜樣品中分離出完整的過敏蛋白，選擇高分辨率和精確質量的質譜儀進行分析，如傅里葉變化離子回旋共振質譜儀（FTICR-MS）或靜電場軌道離子阱質譜儀（Orbitrap-MS）。常見的離子化技術有：電噴霧電離（ESI）、基質輔助激光解吸電離（MALDI）等。常見的碎片離子裂解技術主要有：碰撞誘導解離（CID）、電子捕獲解離、高能碰撞引入解離、紫外光解離等[67]。Carrera 等[68]通過ESI-FTICR-MS 對鱈魚過敏原小清蛋白PV 直接測定，多重電荷態分布顯示了具有不同的PV 亞型，并對所有PV 亞型進行準確分子量測定。Top-down 定性確認可獲得蛋白質的完整形態特征，檢測具有二硫鍵的四級結構，以及蛋白質翻譯后修飾位點和修飾模式之間的關系數據。然而該策略存在得到的信息相對有限、分析通量相對較低等缺點，樣品需高度純化，且較難分析大分子量的蛋白質，靈敏度通常因為蛋白質帶電量不同而受限。

2.3.2 Bottom-up 分析策略 Bottom-up 分析策略是通過分析酶解肽段來解析蛋白序列，該分析策略具有高自動化、高分辨率、高靈敏度、樣品用量少、分析速度快、高特異性、高通量、分離和鑒定同時進行等優點，也是目前蛋白質組學分析最常用的分析方法。該策略可用于過敏原酶解肽段的定性確認和特征肽段的定量檢測。

Bottom-up 定性確認策略利用特異性酶將過敏原酶解成多肽片段的混合物，根據一級質譜或串聯質譜檢測到的各種多肽的準分子、離子或碎片離子信息，與已知蛋白數據庫進行檢索匹配，結合匹配度打分及錯配過濾，利用得到肽段的確切序列拼接出各蛋白的完整序列，從而實現水產品中過敏原的定性鑒定。定性鑒定方法常采用肽質量指紋圖譜（PMF）和肽片段指紋圖譜（PFF）。PMF是肽段進行一級質譜分析后與數據庫匹配的最佳結果，適用于單一蛋白質分析?；旌系鞍踪|酶解后可能存在相同的肽段，會增加分析的復雜性，質量相似的肽段亦會增加匹配的難度。PMF 分析常使用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀（MALDI-TOF-MS），如Liu 等[69]對淡水魚團頭魴中主要存在的過敏原進行分離后，通過雙向電泳膠內酶切結合MALD 鑒定出過敏原AK 和烯醇酶。PFF是肽段進行二級碎裂質譜分析后與數據庫匹配的最佳結果，通過串聯質譜碎裂分析可以獲得豐富的肽段碎片離子信息，可用于表征多個蛋白酶解的混合物，對于質量相似的肽段確認更準確，極大地增加了數據庫檢索結果的可靠性。PFF 多使用具備CID 功能的質譜，如潘曉東等[70]采用超高效液相色譜-四極桿靜電場軌道離子阱質譜儀（UPLC-Q-Orbitrap-MS）鑒定了沼蝦中的4 種過敏原，分別為TM、AK、SCP 和HMC，肽段覆蓋率分別為53%，36%，12%和12%。由于樣品經過酶解，Bottom-up 定性確認不僅增加了檢測時間，還會破壞蛋白質不穩定結構，導致無法識別蛋白質變異，無法正確分析蛋白質翻譯后修飾之間的關系，蛋白序列覆蓋率相對較低。

Bottom-up 定量分析策略常使用穩定同位素標記法，根據定性檢測結果結合相關蛋白質組學軟件挑選1 條或多條特征肽段，將同位素標記的特征肽段作為內標，酶解肽段混合物經超高效液相色譜（UPLC）分離，利用串聯質譜的選擇反應監測/多反應監測/平行反應監測（SRM/MRM/PRM）模式對目標特征肽指定離子對強度進行監測，從而實現水產品中多種過敏原的同時定量分析[71]。Stella 等[72]篩選TM 兩個特征肽，分別為限定肽和量化肽，采用UPLC-Q-Orbitrap-MS 在PRM 模式下檢測甲殼類水產品的TM，LOD 為5 μg/mL。Fan等[73]選擇靈敏度高的ANIQLVEK 作為定量標記肽，利用高效液相色譜-三重四極桿質譜（UPLCQqQ-MS）在MRM 模式下檢測蝦、蟹中TM 的LOD 為0.1 μg/mL。孟佳等[74]利用UPLC-Q-Orbitrap-MS 實現了南美白對蝦、大閘蟹、青蟹、金槍魚、大西洋鮭魚的7 種過敏原蛋白的快速篩查，并選取30 個特征肽，利用UPLC-QqQ-MS 建立MRM 定量檢測方法，LOD 為2.0～3.5 μg/mL。Bottom-up 定量分析利用液相色譜的高效分離和質譜的高分辨率，通過對所選的特征肽段進行檢測，有效避免其它肽段的干擾，提高重現性、靈敏度和特異性。使用穩定同位素標記的特征肽可解決基質效應，建立的方法更加準確可靠。

2.4 水產品過敏原檢測技術的比較

過敏原檢測手段多樣，各種檢測技術的分析要求、所需設備、優缺點各異[75]，詳見表2?；诨蛩降暮怂釞z測技術不易受熱處理和壓力等作用的影響，更加靈敏可靠，且對于缺乏特異性單抗的過敏原，可利用已知過敏原的基因序列進行檢測。由于核酸檢測技術屬于間接性檢測，檢測對象是DNA 非致敏蛋白，因此不能真正反映水產品過敏原的致敏性?；诘鞍姿降拿庖邫z測技術特異性高、操作簡便、無需復雜的試驗操作，然而制備抗體比較困難，且水產品在實際加工生產中，各種加工處理會破壞致敏蛋白的結構，從而破壞其抗原決定簇，導致分析準確度降低，并且因樣本、試劑及操作等因素而造成檢測結果的偏差，穩定性較差[76]?；诘鞍姿降馁|譜檢測技術具有高自動化、高分辨率、高靈敏度、高特異性、高通量、樣品用量少、分析速度快、分離和鑒定同時進行等優點，是分析水產品過敏原的有力工具，既克服了核酸檢測技術不能直接分析致敏蛋白的缺點，又改善了免疫檢測技術存在的檢測低通量和交叉干擾的弊端。質譜檢測在鑒定過敏原蛋白中起重要作用，無需制備抗原抗體，尤其在復雜基質中多種過敏原的定量檢測方面具有很大的優勢，依賴的特征肽段幾乎不受加工影響，穩定性高，可以滿足直接檢測目標蛋白和變性蛋白的要求[77-78]。然而，質譜檢測技術需要昂貴的設備和專業技能，限制了該技術的廣泛應用。

表2 水產品過敏原檢測方法比較Table 2 Comparison of allergen detection methods for aquatic products

3 結語

水產品過敏原種類眾多，過敏原檢測手段多樣，單一檢測方法很難做到普遍適用性。利用適當的技術來對水產過敏原進行準確檢測、監控，結合試驗條件和成本，選用經濟、可靠又快速、明確的識別與定量的方法，準確檢測水產食品中隱藏的過敏原，降低生產過程中的交叉污染，有利于評估水產品過敏的潛在風險，預防水產食物過敏疾病的發生。

現有過敏原的檢測集中在少數主要過敏原中，針對新型或次要過敏原的檢測有待進一步探究。未來水產品中過敏原檢測將向更加準確、快速、經濟、普遍適用、高自動化、高通量、高靈敏性的方向發展。同時，多種方法聯用將在水產品中的過敏原甚至是潛在過敏原的高效檢測中發揮更重要的作用，以更好的保障過敏人群的生命健康。