利用CRISPR/Cas9 技術構建Pmepa1 基因敲除的TCMK1 小鼠腎小管上皮細胞系

張宏民 龍雯 勞筱清 陳雯妍 商雪梅 王洪連 王麗 粟宏偉沈宏萍 沈宏春，

（1.西南醫科大學中西醫結合學院，瀘州 646000；2.西南醫科大學附屬中醫醫院，瀘州 646000）

數據表示，慢性腎病已影響全球近10%的人，是低、中等收入國家發病率和死亡率的主要原因之一［1］。腎纖維化是所有慢性腎臟疾病及終末期腎病的共同病理特征［2］，主要表現為腎間質成纖維細胞的活化和細胞外基質的過度積累，導致正常腎小管和間質結構的破壞［3-4］。隨著腎纖維化的進行性發展，慢性腎病患者的腎功能逐漸惡化最終導致腎衰竭［5］。因此，研究腎纖維化的機制對尋找積極有效的治療策略以改善或延緩腎纖維化的進展尤為重要［6］。

前列腺跨膜蛋白雄激素誘導1（prostate transmembrane protein androgen induced 1，Pmepa1）又稱TMEPA1、STAG1、ERG1.2 或N4wbp4，是一種I 型跨膜蛋白，可與HECT 型E3 泛素連接酶相互作用［7］。研究表明，Pmepa1 參與p53 介導的細胞凋亡和細胞生長抑制，并與多種實體腫瘤（包括腎癌、膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌和宮頸癌）的發生有關［8-9］。Pmepa1 作為多種信號通路的調節器，有助于維持細胞內穩態［10］。最近發現Pmepa1 通過負反饋回路抑制雄激素和TGF-β 信號傳導［11］，并且Pmepa1 在TGF-βI 型受體信號傳導的控制中發揮作用［12］。

CRISPR/Cas9 是一種RNA 引導的核酸內切酶，通過核苷酸堿基配對特異性切割DNA 序列的基因編輯技術［13］。由于其高效、易用和準確性，CRISPR/Cas9 在基因編輯研究中被廣泛應用，并在人類疾病治療方面表現出巨大潛力［14］。CRISPR/Cas9 技術于2013 年首次用于哺乳動物細胞（人和小鼠細胞），此后被廣泛應用于生物研究、生物技術、醫學、農業等各種研究領域［15-16］。

本研究將基于CRISPR/Cas9 技術將Pmepa1 敲除載體轉染至TCMK1 小鼠腎小管上皮細胞，聯用流式細胞分選技術和PCR 擴增片段測序，篩選建立Pmepa1 敲除TCMK1 細胞系，并在敲除Pmepa1 的TCMK1 細胞中驗證TGF-β1 刺激下細胞纖維化的改變，為研究Pmepa1 在腎纖維化的功能提供細胞模型。

1 材料與方法

1.1 材料

鼠源腎小管上皮細胞系TCMK1 細胞源于西南醫科大學附屬中醫醫院中西醫結合實驗室；pX333骨架質粒購于Addgene 公司；用于sgRNA 克隆及Real-Time PCR 引物的寡脫氧核苷酸鏈由上海生工生物有限公司合成；質粒提取試劑盒；膠回收試劑盒和細胞基因組DNA 提取試劑盒購自于北京天根生物有限公司；Bbs I 限制性內切酶、T4 DNA 連接酶、PNK 磷酸化酶、逆轉錄試劑盒、胎牛血清（Gibco）購自于Thermo Scientific 公司；Real-Time PCR 所用SYBR 預混擴增試劑購自于天津諾唯贊生物有限公司；RNA 提取試劑Trizol 購自于生工生物工程（上海）；DMEM 高糖培養基購自于上海培源生物科技有限公司；Pmepa1 抗體（武漢三鷹生物技術有限公司）、GAPDH 抗體（Thermo Fisher Scientific，MA5-15738），SMAD2 抗體、SMAD3 抗體、P-SMAD2 抗體、P-SMAD3 抗體（Cell Signaling TECHNOLOGY）。

1.2 方法

1.2.1 sgRNA 設計與寡核苷酸鏈的合成 根據CRISPR/Cas9 工作原理，在CRISPR 在線設計網站輸入鼠源Pmepa1 編碼基因序列（https://zlab.bio/guide-design-resources），搜尋符合“G（N）19NGG”模式的sgRNA 靶點序列（其中NGG 為PAM 序列），并保證所選sgRNA 序列符合以下要求：1）所選靶點位于外顯子區段；2）靶點所選外顯子為所有已發現Pmepa1 選擇性間接體所共有。最終選擇靶點位于第2 號外顯子，序列為：5'-GCCGACACAGCCAGGCCAGGAGG-3'（最后3 個堿基為PAM 序列）。為了將sgRNA 序列克隆至pX333 載體Bbs I 酶切位點，在sgRNA 序列兩端添加黏性末端，并合成以下寡脫氧核苷酸序列：sgRNA-F:5'-CACCGCCGACACAGCCAGGCCAGG-3'；sgRNA-R:5'-AAACCCTGGCCTG GCTGTGTCGGC-3'。

1.2.2 pX333-Pmepa1 質粒的 構建將sgRNA-F 和sgRNA-R 單鏈寡脫氧核苷酸在T4 連接酶緩沖液中按照5℃/min 的速率從95℃梯度退火至25℃，從而形成雙鏈寡聚脫氧核苷酸，再加入PNK 磷酸化酶于37℃孵育30 min 進行雙鏈寡脫氧核苷酸5'末端磷酸化修飾。然后通過T4 DNA 連接酶將雙鏈寡聚脫氧核苷酸克隆至Bbs I 內切酶線性化的pX333 載體，重組載體轉化入E.coli DH5α 感受態細菌中，于含有氨芐青霉素抗性瓊脂固體培養基中篩選。第2 天，挑取瓊脂平板中數個單克隆菌落進行擴增培養、質粒提取和測序，對于測序正確的質粒（pX333-Pmepa1）進行大量擴增，制備質粒用于下游細胞轉染。

1.2.3 TCMK1 細胞培養與pX333-Pmepa1 質粒轉染 TCMK1 細胞培養在補充有10%胎牛血清的DMEM 高糖培養基中，培養條件為37℃、5% CO2和100%濕度。待細胞密度生長至90%匯合度時消化接種至6 孔板，接種量1×106個/孔，當細胞達到80%匯合度時，采用陽離子轉染試劑聚乙烯亞胺（PEI）轉染500 ng pX333-Pmepa1，轉染后6 h 更換新鮮培養基，并在48 h 后于熒光顯微鏡下觀察載體熒光蛋白標簽mCherry 的表達，以判斷轉染是否成功。

1.2.4 流式分選、單克隆細胞擴增和測序鑒定Pmepa1 敲除細胞 將轉染后的細胞采用流式分選技術篩選出轉染成功的TCMK1 細胞，按照0.5 個細胞/孔的接種比例接種于96 孔板進行5-10 d 培養，每5 d 更換新鮮培養基。將96 孔板中成功生長的單克隆細胞消化，并分別接種于24 孔板，待24 孔板的細胞長滿，繼續消化并分別接種于6 孔板，待6孔板細胞長滿，將其消化下來，一半細胞凍存，一半細胞采用基因組提取試劑盒提取DNA，采用PCR擴增Pmepa1 敲除位點附近基因組片段，PCR 產物送生工生物工程（上海）進行測序分析。若Pmepa1靶點出現序列突變，且兩個等位基因均出現移碼突變（缺失或插入堿基數非3 的倍數）時，即判定為潛在的表達缺失突變。PCR 鑒定引物為：F,5'-GTTCGTGCAAATCGTGGTCA-3';R,5'-TCATACCTG ACACTTCCTGC-3'。

1.2.5 Western blot 檢測Pmepa1 敲除細胞Pmepa1 蛋白的表達 正常TCMK1 細胞和上述Pmepa1 突變TCMK1 細胞分別種于6 孔板，待細胞長滿，棄去培養基，PBS 清洗，加入100 μL RIPA 裂解液，靜置5 min，充分裂解，用細胞刮將細胞刮下，超聲后冰上靜置30 min，離心取上清，測定蛋白濃度。向10%的聚丙烯酰胺凝膠中加入各組蛋白樣品進行電泳分離，并轉印至PVDF 膜上。印跡膜采用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，然后，采用含兔抗Pmepa1 抗體（1∶1 000 稀釋于2.5% BSA 中）4℃孵育過夜。第2 天，除去一抗，TBST 溶液清洗3 次，每次5 min，加入稀釋后的HRP 標記羊抗兔二抗，室溫孵育1 h，TBST 洗膜3 次，每次5 min，采用超敏ECL 化學發光底物曝光并上機檢測。

1.2.6 PCR、Western blot 檢測Pmepa1 敲除后TGF-β1誘導的R-Smad 活化和纖維化表型 將Pmepa1 敲除細胞和正常的TCMK1 細胞接種于6 孔板，培養至細胞匯合度至90%，更換0.5%胎牛血清培養基，饑餓6 h，加入5 ng/mL TGF-β1 刺激 24 h，Trizol 法提取細胞總RNA，取1 μg RNA 逆轉錄為cDNA，采用RT-PCR 檢測 Collagen I 和 Fibronectin 的表達。擴增引物為 Collagen I: F,5'-ATCCAACGAGATCGAGCTCA-3';R,5'-AAGGGAGCCACATCGATGAT-3'，Fibronectin: F,5'-ATGTGGA CCCCTCCTGATAGT -3';R,5'-GCCCAGTGATTTCAGCAAAGG -3'。內參引物為GAPDH: F,5'-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG -3';R,5'-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG -3'。將Pmepa1 敲除細胞和正常的TCMK1 細胞接種于6 孔板，培養至細胞匯合度至90%，更換含0.5% 胎牛血清的培養基饑餓6 h，然后加入5 ng/mL TGF-β1 刺激30 min，提取細胞蛋白。如上采用Western blot 實驗檢測Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3 的表 達，采用GAPDH 為內參。

1.2.7 統計學分析 采用SPSS23.0 或GraphPad Prism8.0 軟件進行統計分析，所有的數據結果均表示為均數±標準差（SD），兩組間比較采用Student’s t-test 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（one-way，ANOVA），以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 成功構建靶向Pmepa1基因CRISPR/Cas9敲除質粒

根據spCas9 G（N19）NGG 的序列識別原則，sgRNA 序列選擇在小鼠Pmepa1 基因組第2 個外顯子上（圖1-A），序列為5'-GCCGACACAGCCAGGCCAGG -3'，鄰近PAM 序列為5'-AGG -3'，該序列經過NCBI BLAST 軟件比對分析，確證在小鼠基因組范圍內不存在其他非靶向性位點。構建好的載體（pX333-Pmepa1）經測序顯示，sgRNA 成功克隆到pX333 載體gRNA 骨架序列5'端，U6 啟動子完整驅動gRNA 序列的表達以及CAG 啟動子驅動的spCas9 蛋白和mCherry 熒光示蹤蛋白同時表達，表明sgRNA 序列克隆成功（圖1-B）。

圖1 Pmepa1 sgRNA 靶向位置和質粒構建結果Fig.1 Pmepa1 sgRNA targeting location and plasmid construction results

2.2 Pmepa1敲除TCMK1細胞系的構建和鑒定

將構建好的pX333-Pmepa1 質粒轉染入TCMK1細胞48 h 后，如圖1-B 所示，可以觀察到轉染成功細胞出現mCherry 熒光蛋白表達（圖1-C），流式細胞術顯示轉染效率約為17%（圖1-D）。進一步，采用流式分選技術分析出轉染成功（mCherry 陽性）的TCMK1 細胞，按照0.5 細胞/孔的比例稀釋接種于96 孔板中進行單克隆細胞培養擴增，最終獲得19 個細胞克隆。對這些細胞克隆基因組Pmepa1 位點Cas9 靶向位點序列進行PCR 擴增，最終16 個細胞克隆PCR 擴增成功（圖2-A）。經測序分析發現，16 個細胞克隆中2 個克隆的Pmepa1 基因Cas9 靶向位點出現序列突變。且兩個突變克隆中序列突變在Pmepa1 兩個等位基因位點上序列一致，均為純合突變。其中clone 4 插入突變1 個堿基，clone 16 缺失突變74 個堿基（圖2-B）。由于兩個突變細胞克隆缺失/插入堿基數不是3 的倍數，預計會出現開放式閱讀框移位，引起后續多肽序列的紊亂和/或蛋白翻譯提前終止，從而導致Pmepa1 蛋白序列和功能的缺失。進一步，Western blot 分析發現，clone 4和16 Pmepa1 蛋白表達缺失（圖2-C）。這些結果提示，TCMK1 細胞克隆clone 4（KO-4）和16（KO-16）Pmepa1 基因敲除成功。

圖2 Pmepa1 基因敲除效果驗證Fig.2 Validation of Pmepa1 gene knockout

2.3 Pmepa1敲除后TCMK1細胞中TGF-β信號的活化和纖維化

為了研究Pmepa1 敲除是否影響TCMK1 細胞TGF-β 信號的活性，我們采用RT-PCR 及Western blot 方法檢測了纖維化相關蛋白及Smad2/Smad3通路相關蛋白。RT-PCR 結果顯示，雖然TGF-β1均可以刺激正常和敲除（KO-4/16）TCMK1 細胞Fibronectin 和Collagen I 的表達，但Pmepa1 敲除細胞中Fibronectin 和Collagen I 表達水平顯著高于正常TCMK1 細胞,差異均有統計學意義（圖3-A）。同時，Western blot 結果顯示，TGF-β1 可以刺激TCMK1 細胞中Smad2/3 的活化（磷酸化），但敲除Pmepa1 細胞中（KO-4/16）TGF-β1 誘導的Smad2/3 磷酸化水平更高（圖3-B）。因此，PCR 及Western blot 結果表明，Pmepa1 的敲除促進了TCMK1 細胞中TGF-β信號活化和纖維化。

圖3 RT-PCR 和Western blot 驗證Pmepa1 敲除后TGF-β信號的活化和纖維化蛋白表達結果Fig.3 RT-PCR and Western blot validation of TGF-β signaling activation and fibrotic protein expression after Pmepa1 knockdown

3 討論

CRISPR/Cas9 技術利用sgRNA 對基因組靶位點序列的識別引導Cas9 核酸酶進行特異性DNA 剪切實現基因敲除［17］。本研究利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術敲除TCMK1 細胞Pmepa1 基因，相比其他傳統基因編輯技術，CRISPR/Cas9 基因編輯技術具有設計簡單、周期快、高切割率、高精度的特點［18］。實驗表明CRISPR/Cas9 技術在小鼠上建立基因敲除模型最快6-8 周，而且成功率較高［19］。陳漢宗等［20］成功利用CRISPR/Cas9 技術穩定構建了anxa6 基因敲除的Caco-2 細胞株。劉鐵柱等［21］建立了SNX11基因穩定敲除的A549 細胞系。CRISPR/Cas9 基因編輯技術目前已被廣泛應用于基因的篩選、動物基因的敲入等實驗以及各遺傳疾病的治療中［22］。

Pmepa1 又稱TMEPA1，在TMEPA1 家族分子中發現，C18ORF1 與TMEPA1 一樣具有兩個PY基序和一個Smad 相互作用基序（SIM）結構域，C18ORF1 可以阻斷TGF-β 信號傳導，但不能阻斷骨形態發生蛋白信號傳導［23］。C18ORF1 通過SIM與Smad2/3 結合，并與Smad2/3 的受體激活，以減弱Smad2/3 向TGF-I 型受體的募集，其對TGF-β信號傳導的抑制功能與TMEPAI 方式相似［24］。但C18ORF1 與TMEPAI 相反的是，TGF-β 信號傳導沒有誘導C18ORF1，而當細胞受到高水平的TGF-β刺激時，TMEPAI 可能會幫助C18ORF1 以協調的方式 抑制TGF-β 信號傳導［25］。Pmepa1 表達 在細胞膜和亞細胞細胞器中，其表達可以被雄激素、TGF-β、EGF 和Wnt 等多種細胞內信號通路誘導［26］。Pmepa1 基因首次發現于前列腺癌癥中，在前列腺癌癥中具有雙重作用。Pmepa1 可以促進雄激素受體陽性前列腺癌細胞增生，并且通過抑制Smad3/4 來減少雄激素受體陰性前列腺癌細胞的增生［27］。此外，Pmepa1 可以促進其他癌癥的發展，如肺癌、卵巢癌、胃癌等［28］。實驗證明，Pmepa1 在卵巢癌癥中的抗癌作用可以促進凋亡［29］。這些差異可能由組織的特異性引起的。Pmepa1 的不同作用可以通過Pmepa1和TGF-β 的關系來解釋。Pmepa1 是由TGF-β 信號傳導誘導的，是TGF-β 信號傳導的直接靶基因。但同時，它抑制典型的Smad 信號傳導，實驗證明Pmepa1 通過抑制Smad2 和Smad3 的磷酸化以對抗TGF-β 信號傳導［30］。TGF-β1 是組織修復、炎癥和纖維化的主要調節因子，也有大量的實驗數據表明腎纖維化與TGF-β 有關［31］?？紤]到Pmepa1 和TGF-β 信號傳導的關系，我們為此驗證了Pmepa1 在TGF-β 信號活化的TCMK1 細胞中是否發揮抗纖維化的作用。

本實驗利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術聯合流式細胞分選，成功建立了2 株Pmepa1 基因敲除TCMK1 細胞系，敲除細胞經過Western blot 驗證了Pmepa1 蛋白表達的缺失，單細胞克隆篩選成功率約10%。為明確Pmepa1 基因的敲除與TCMK1 細胞中TGF-β 信號的活化和纖維化的關系，通過RT-PCR及Western blot 兩種方法檢測了纖維化相關蛋白及Smad2/Smad3 通路相關蛋白，結果表明Pmepa1 的敲除促進了TCMK1 細胞中TGF-β 信號活化和纖維化。

4 結論

本實驗通過CRISPR/Cas9 基因編輯技術成功構建了Pmepa1 敲除的TCMK1 細胞系，并且針對兩株敲除細胞系通過RT-PCR 及Western blot 兩種方法驗證 了Pmepa1 敲除后TCMK1 細胞中TGF-β 信號的活化和纖維化，結果顯示Pmepa1 的敲除促進了TCMK1 細胞中TGF-β 信號活化和纖維化。不僅為Pmepa1 蛋白在TCMK1 小鼠腎小管上皮細胞中的作用以及在腎纖維化中提供細胞模型，也為后續進一步研究腎臟組織中Pmepa1 基因與腎臟疾病的關系奠定基礎。