‘紅滿堂’蘋果MbbZIP43 基因的克隆與功能研究

楊艷 胡洋 劉霓如 殷璐 楊銳 王鵬飛 穆霄鵬 張帥 程春振 張建成

（山西農業大學園藝學院，太谷 030801）

堿性亮氨酸拉鏈（basic leucine zipper,bZIP）家族是植物最大的轉錄因子家族之一［1］。其典型特征是包含高度保守且富含堿性氨基酸殘基的DNA 結合域和亮氨酸拉鏈結構域［2］。bZIP 轉錄因子通常以同源或異源二聚體形式結合到下游基因啟動子的G-box、C-box 和ABRE 等元件上［3］，廣泛參與植物器官和組織的分化［4］、種子成熟［5］、光反應［6］以及光信號調節［7］、抗逆防御［8］、ABA 信號傳導［9］和生物脅迫［10］等多種生物學過程。

花青素屬于類黃酮類化合物，通過苯丙烷代謝途徑合成。參與該途徑中的關鍵酶由早期生物合成基因（CHS、CHI、F3H 和F3'H）和晚期生物合成基因（F3',5'H、DFR、ANS 和UFGT 等）編碼［11-12］。研究表明，bZIP 在植物花青素等類黃酮類物質的生物合成過程中也發揮著重要調控作用。其中，與植物光形態建成密切相關的bZIP 基因HY5（Elongated hypocotyl 5），在植物花青素合成中的調控作用在多種植物中被證實。例如擬南芥HY5 可通過結合PAP1 啟動子區的G-box 和ACE 元件調節PAP1 基因的表達，進而影響花青素生物合成［13］。桃PpHY5通過激活花青素生物合成相關基因的表達，來調節花青素積累［14］。梨PyHY5 通過與PyMYB10 和PyWD40 啟動子的G-box 基序結合，增強它們的表達進而促進紅‘云紅梨1 號’果皮花青素的積累［15］。草莓FaHY5 與FaBBX22 相互作用促進草莓果實花青素的積累［16］。過表達FaHY5-VP16 和FaBBX22 可以促進轉基因草莓和擬南芥植株花青素的積累［17］。除HY5 外，其他bZIP 轉錄因子也被證實參與植物花青素合成調控。光照條件下，梨PybZIPa 通過與花青素合成相關的轉錄因子（PyMYB114、PyMYB10和PyBBX22）和結構基因（PyUFGT）啟動子上的G-box 元件結合調控它們的表達，從而促進花青素的生物合成［18］。番茄SlAREB1 通過影響SlDFR 和SlF3'5'H 的表達調節幼苗花青素積累［19］。

蘋果（Malus spp.）屬薔薇科（Rosaceae）蘋果屬（Malus）落葉喬木。根據葉片與果實形態結構，蘋果屬植物可被分為真蘋果組、花楸蘋果組和移海棠組3 組。其中，由山荊子系（M.baccata（L.）Borkh.）和蘋果系（M.domesica Borkh.）組成的真蘋果組被研究最多。bZIP 在調控蘋果屬植物花青素合成中的作用已有報道，但多集中于真蘋果組蘋果系的栽培蘋果。如ABA 處理后，蘋果MdbZIP44可與花青素合成調控關鍵MYB 轉錄因子MdMYB1互作，并增強其與下游靶基因啟動子MdDFR 和MdUF3GT 的結合能力，進而正調控花青素積累［20］。MdABI5 通過增強MdbHLH3 與MdMYB1 之間的相互作用，參與ABA 誘導的花青素生物合成調控［21］。MdbZIP23 可通過與編碼基因受ABA 強烈誘導的MdNAC1 互作，進而促進MdMYB10 和MdUFGT 的表達和花青素的積累［22］。目前尚無關于真蘋果組山荊子系bZIP 調控花青素相關的報道。

‘紅滿堂’蘋果系從‘舞美’蘋果（Malus×domestica Borkh.‘Maypole’）和‘山定子’（Malus baccata（L.）Borkh.）雜交F1代群體中選育的果肉全紅株系，其果實幼果期果皮和果肉均為紅色（俗稱“胎里紅”），至成熟期果皮和果肉轉為深紅色［23］?！t滿堂’果實富含花青素、類黃酮等物質［24］，是研究蘋果花青素等黃酮類物質代謝的理想材料。前期研究發現一個‘紅滿堂’bZIP 基因（C1H46-028789），在果實成熟過程中差異表達顯著，且與花青素含量顯著相關［25］。本研究對該基因進行克隆和序列分析，利用洋蔥表皮細胞瞬時轉化研究其編碼蛋白亞細胞定位情況，利用實時熒光定量PCR 研究其在不同成熟時期‘紅滿堂’果實中的表達情況，并對其表達水平與果實總黃酮、總酚、黃酮醇和花青素含量進行相關性分析。此外，為驗證該基因在花青素合成調控中的作用，構建該基因的過表達載體，并基于煙草葉片、蘋果葉片和果實瞬時轉化體系，研究其對花青素合成的影響。本研究可為揭示bZIP 轉錄因子調控‘紅滿堂’蘋果花青素生物合成中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

‘紅滿堂’蘋果果實采自山西農業大學果樹研究所蘋果資源圃。于花后7 周（PS1）、11 周（PS2）、15 周（PS3）、19 周（PS4）、23 周（PS5）選取大小均勻一致、無病蟲害和機械傷的果實，液氮速凍后迅速轉移至-80℃超低溫冰箱保存備用。本氏煙草和‘八棱海棠’蘋果植株培養于人工培養室中，培養室溫度為（25±2）℃，濕度為80%-85%、光周期為光照16 h/黑暗8 h，光強為1 500 lx。

1.2 方法

1.2.1 核酸提取及反轉錄 使用多糖多酚植物基因組DNA 提取試劑盒（天根）提取‘紅滿堂’果實gDNA。使用多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒（離心柱型）（天根）提取5 個時期的‘紅滿堂’果實RNA，采用PrimeScriptTMII 1ststrand cDNA Synthesis（TaKaRa，大連）試劑盒反轉錄獲得cDNA。

1.2.2 基因全長克隆與載體構建 使用NCBI 設計基因全長擴增引物（表1）用于基因克隆。PCR 反應體系：Dream TaqTMGreen PCR Master（2X）12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，gDNA/cDNA 模板及上下游引物各1 μL。反應條件：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸1 min，34 個循環；72℃終延伸10 min。膠回收PCR 產物后進行TA 克隆并轉化大腸桿菌DH5α 感受態細胞。將菌液PCR 檢測為陽性的克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序驗證。根據測序結果進一步設計基因載體構建的引物（表1）用于擴增帶有同源臂序列基因，使用生工生物工程（上海）股份有限公司生產的即用無縫克隆試劑盒連接到BamH I 和Spe I雙酶切的pBI123 載體，獲得35S∷MbbZIP43-GFP重組質粒并轉化農桿菌GV3101。

表1 本研究所用引物信息Table 1 Information for the primers used in this study

1.2.3 生物信息學分析 從薔薇科基因組官網（https://www.rosaceae.org/）下載‘山荊子’蘋果基因組CDS、cDNA 和蛋白序列文件，利用TBtools［26］預測MbbZIP43 基因結構及其編碼蛋白理化性質；利用CDD 在線網站進行MbbZIP43 保守結構域驗證。參考劉嘉鵬等［27］的方法對MbbZIP43 進行亞細胞定位、跨膜結構、信號肽、蛋白磷酸化位點、蛋白二級結構、蛋白三級結構等進行預測。從基因組提取MbbZIP43 起始密碼子上游2 000 bp 的序列的片段作為啟動子，利用PlantCARE 預測其啟動子順式作用元件分布情況。利用NCBI BLASTP 搜索并下載MbbZIP43 同源蛋白，同時從NCBI 下載已報道花青素相關bZIP 蛋白序列，利用Jalview 繪制多序列比對圖；利用MEGA X 軟件進行系統發育樹構建（neighbor-joining tree,bootstrap 設定初始值為1 000次）；采用在線軟件MEME 分析MbbZIP43 保守基序（基序數目閾值設為15，其余為默認值）；采用在線軟件TFBS 預測花青素合成結構基因啟動子區轉錄因子結合位點進行預測。所用生物信息學網址信息如表2 所示。

表2 本研究所用生物信息學分析網站信息Table 2 Information for the software used for the bioinformatic analysis in this study

1.2.4 亞細胞定位 分別將攜帶35S∷MbbZIP43-GFP 重組質粒的農桿菌培養至OD600=0.8，6 000 r/min離心5 min 后棄上清液。隨后采用農桿菌介導法侵染預培養24 h 的洋蔥表皮細胞，吸干菌液后培養于MS 培養基上，23℃下暗培養24-36 h 后，在正置熒光顯微鏡（Leica DM6B）下觀察GFP 熒光信號并拍照［28］。

1.2.5 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）基于測序結果，使用Primer3（https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/）設計MbbZIP43 基因定量引物（表1）。RT-qPCR 反應體 系：TB Green?Premix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）熒光染料（TaKaRa）10 μL，ddH2O 7 μL，上下游引物各0.8 μL，cDNA 模板1 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL。反應程序為95℃預變性30 s；95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共45 個循環。使用QuantStudio 3 實時熒光定量PCR 儀（Ap-plied Biosystems）進行RT-qPCR。以Actin 作為內參基因，使用2-ΔΔCt法計算基因在不同時期果實中的相對表達量［29］。使用SPSS 分析各樣品中MbbZIP43表達差異顯著性并使用Graphpad Prism 作圖。

1.2.6 總酚和黃酮類物質含量測定 將‘紅滿堂’果實樣品液氮速凍后研磨成粉末，取2.5 g 溶于10 mL 80%乙醇中，超聲提取15 min 后4℃條件下5 000 r/min 離心10 min 后收集上清液至25 mL 棕色容量瓶中，重復提取一次后定容至20 mL，即獲得提取液，用于總酚和總黃酮含量測定?？偡雍繙y定采用福林酚法，具體步驟參照Slinkard 和Singleton方法［30］?？傸S酮含量測定參照Zheng 等［31］的方法。使用蘇州科銘生物技術有限公司生產的黃酮醇含量測定試劑盒（分光光度計法）測定‘紅滿堂’果實總黃酮醇含量?；ㄇ嗨靥崛∨c測定參考仝月澳等［32］的方法。

1.2.7 MbbZIP43 基因瞬時轉化 分別將攜帶35S∷MbbZIP43-GFP 重組質粒和pBI123 空載體（EV）的農桿菌培養至OD600=0.6-0.8，6 000 r/min 離心5 min后棄上清液。使用MES 緩沖液（含10 mmol/L MES、10 mmol/L MgCl2和200 μmol/L 乙酰丁香酮（AS），pH 為5.8 左右）重新懸浮，調節至OD600=0.8，然后于28℃下200 r/min 振蕩培養30 min 后用于瞬時轉化。

煙草葉片瞬時轉化參照Wang 等［33］的方法。用針頭輕輕刺破本氏煙草的葉片，并用1 mL 注射器從背面注射40 μL 的農桿菌菌液。隨后，將煙草移至培養室［（25±2）℃，相對濕度約80%］中暗培養2 d 后恢復正常光照，5 d 后測定葉片花青素含量。

采用真空滲透法進行蘋果葉片瞬時轉化［34］。將‘八棱海棠’葉片分別浸入攜帶35S∷MbbZIP43-GFP重組質粒和pBI123 空質粒的農桿菌侵染液中，真空滲透40 min 后使用濾紙吸干葉片表面菌液，平鋪于鋪有無菌水濕潤的濾紙的培養皿上。暗培養1 d后恢復正常光照，9 d 后收集葉片用于RNA 提取和花青素含量測定。蘋果果實瞬時轉化參照An 等［35］的方法。使用1 mL 注射器注射50 μL 農桿菌菌液至套袋未轉色的成熟‘嘎啦’蘋果，隨后將果實置于培養室［（25±2）℃，相對濕度約80%］暗培養2 d后恢復正常光照，5 d 后收集蘋果果皮用于RNA 提取和花青素含量測定。此外，為研究MbbZIP43 瞬時過表達影響蘋果花青素積累的機制，參照Yu 等［36］的方法利用RT-qPCR 分析蘋果葉片和果實中花青素合成結構基因的相對表達情況。

1.2.8 數據統計分析 運用IBM SPSS Statistics 25 對實驗數據差異顯著性進行單因素方差（ANOVA）分析，使用GraphPad Prism8 和Origin 軟件進行數據統計分析及圖形繪制。

2 結果

2.1 基因克隆和序列分析結果

以gDNA 和cDNA 為模板均克隆獲得長度為522 bp 的目的片段（圖1-A），說明該基因不含內含子。該基因與基因組參考序列（C1H46-028789）存在4 個堿基差異，相似度達99.23%（圖1-B）。NCBI BLAST 比對結果顯示，該基因與MdbZIP43（XP_008393381.1）的相似度最高（98.27%），故命名為MbbZIP43。

圖1 MbbZIP43 基因PCR 產物電泳檢測（A）及序列比對（B）結果Fig.1 Electrophoresis detection（A）and sequence alignment（B）results of PCR products for the MbbZIP43

MbbZIP43 預測可編碼包含173 個氨基酸的蛋白質。蛋白理化性質分析結果顯示，MbbZIP43 分子量為19.8 kD，等電點為7.93，脂肪系數為73.87，不穩定系數為56.37，總平均親水性為-0.887，屬于不穩定親水蛋白。MbbZIP43 不含信號肽和跨膜結構，說明其屬于非分泌和非跨膜蛋白。CDD 預測結果顯示，MbbZIP43 含有bZIP_plant_GBF1 結構域。蛋白磷酸化位點預測結果顯示，MbbZIP43 含有12 個絲氨酸、3 個蘇氨酸和1 個酪氨酸磷酸化位點。蛋白二級結構預測結果顯示，MbbZIP43 二級結構主要由α-螺旋（52.60%）、無規則卷曲（46.24%）、β-折疊和延伸鏈（各占0.58%）組成。三級結構預測結果顯示，MbbZIP43 蛋白與桃環形結構域蛋白（A0A2N517U0.1.A）的三維結構最為接近，相似度為72.73%。

啟動子順式作用元件預測結果顯示，MbbZIP43啟動子區含有8 種14 個光響應相關元件（其中GT1-motif 元件有6 個，Box 4 元件有2 個，其余6種光響應相關元件各1 個）、2 種生長發育相關元件（分生組織表達和胚乳表達元件各1 個）、4 種激素相關元件（茉莉酸甲酯響應元件最多有4 個，其次是赤霉素響應元件3 個，脫落酸和水楊酸響應元件各1 個）和8 種20 個逆境響應相關元件（包括防御脅迫元件8 個，其中包含4 個MYB 元件、2 個W box 元件、各1 個DRE core 元件和TC-rich repeat元件，干旱和高溫脅迫元件各4 個，傷害響應元件2 個以及低溫和厭氧誘導元件各1 個）（表3）。

表3 MbbZIP43 啟動子區順式作用元件預測結果Table 3 Predicted cis-regulatory elements in the promoter region of MbbZIP43

利 用NCBI-blastp 對‘紅滿堂’MbbZIP43 同源蛋白進行了搜索發現，MbbZIP43 蛋白與蘋果MdbZIP43、白梨PbbZIP43、沙梨PybZIP43、甜櫻桃PabZIP43、扁桃PdbZIP43 和桃PpbZIP43 相似度較高，分別為98.27%、94.80%、93.06%、81.50%、80.92%和80.92%。將MbbZIP43 同源蛋白及已報道的花青素合成相關bZIP 蛋白進行多序列比對發現，這些bZIP 均具有典型的bZIP 保守結構（圖2）。系統進化分析結果顯示（圖3），MbbZIP43 與MdbZIP43 親緣關系最近，與其他物種bZIP43 蛋白聚為一支；MdbZIP44 單獨一支，而已報道的花青素相關HY5蛋白聚為一支。

圖2 不同植物bZIP43 以及已知花青素調控相關bZIP 蛋白多序列比對結果Fig.2 Multiple sequence alignment results for bZIP43 proteins and bZIP proteins related to known anthocyanin biosynthesis from different plant species

圖3 不同植物bZIP 蛋白保守基序（A）及motif1 序列Logo 圖（B）Fig.3 Conserved motifs in bZIP proteins from different plant species（A）and sequence Logo for the motif1（B）

保守基序分析結果顯示（圖3），所有成員均含有motif1。PFAM 預測結果顯示，motif1 具有堿性區域和亮氨酸拉鏈區域，說明motif1 對應典型的bZIP保守結構域。除RcbZIP43、MdbZIP44 和GbHY5 外，所有蛋白均含有motif6。進化關系近的成員具有相似的保守基序，如所有bZIP43 蛋白均有motif1、motif2、motif3、motif4 和motif8，而所有的HY5 均含有motif1 和motif7，說明這些bZIP43 蛋白與HY5蛋白序列和保守基序存在較大差異。

2.2 MbbZIP43亞細胞定位分析

亞細胞定位預測結果（圖4）顯示，MbbZIP43定位于細胞核。進一步利用洋蔥表皮細胞瞬時轉化驗證該蛋白亞細胞定位情況。結果顯示，在瞬時表達35S∷MbbZIP43-GFP 融合蛋白的洋蔥表皮細胞中，僅在細胞核檢測到熒光信號；而瞬時表達35S∷GFP的洋蔥表皮細胞各部位均有熒光信號分布。

圖4 MbbZIP43 蛋白亞細胞定位分析結果Fig.4 Subcellular localization analysis results of Mbb-ZIP43 protein

2.3 MbbZIP43基因表達和相關性分析

利用RT-qPCR 研究MbbZIP43 在5 個發育時期‘紅滿堂’果實中的表達情況發現，隨著果實的生長發育，該基因的相對表達量呈先升后降的趨勢。在PS1 階段表達量最低，在PS2 階段表達量最高，其次為PS3 階段，分別是PS1 階段的7.11 和1.83 倍（圖5-A）。

圖5 不同發育時期‘紅滿堂’蘋果MbbZIP43 相對表達量、總酚含量、總黃酮含量、總黃酮醇含量和花青素含量Fig.5 Relative expressions of MbbZIP43,total phenol content,total flavonoid content,total flavonol content and anthocyanin content in ‘Hongmantang’ apple fruits at different ripening stages

隨著果實發育，‘紅滿堂’果實總酚含量呈下降趨勢，在PS1 階段含量最高（6.695 mg/g FW），PS5 含量最低（1.804 mg/g FW）（圖5-B）?？傸S酮含量先上升后下降，在PS2 階段含量最高（4.800 mg/g FW），PS5 含量最低（0.644 mg/g FW）（圖5-C）?？傸S酮醇含量先下降后上升，在PS5 階段含量最高（4.629 mg/g FW），PS2 最低（1.450 mg/g FW）（圖5-D）?；ㄇ嗨睾砍省吧?降-升”的趨勢，在PS5 階段含量最高（24.065 OD·mL/100 g FW），在PS1 含量最低（13.478 OD·mL/100 g FW）（圖5-E）。

相關性分析結果（表4）顯示，‘紅滿堂’果實總黃酮含量與總黃酮醇含量顯著負相關（相關性系數為-0.97），與總酚含量正相關（0.69）。MbbZIP43表達量與總黃酮含量、花青素含量和總酚含量正相關，與總黃酮醇含量負相關，相關性均不顯著。

表4 MbbZIP43 基因表達水平與總黃酮、總酚、總黃酮醇和花青素含量相關性分析結果Table 4 Correlation analysis results among the MbbZIP43 expressions,total flavonoids content,total phenolic content,total flavonol content and anthocyanin content

2.4 MbbZIP43基因瞬時轉化

為驗證MbbZIP43 對花青素合成的調控作用，利用煙草葉片瞬時轉化研究其過表達對花青素積累的影響，結果（圖6-A）顯示，瞬時過表達MbbZIP43基因的煙草葉片中花青素含量顯著高于空載對照（EV），較EV 提高了17.42%。進一步利用‘八棱海棠’葉片瞬時轉化研究其過表達對花青素積累的影響（圖6-B）發現，瞬時過表達MbbZIP43 基因的蘋果葉片中花青素含量顯著高于空載對照（EV）（圖6-D），較EV 提高了25.66%。利用‘嘎啦’蘋果果實進行瞬時轉化研究其過表達對花青素的積累（圖6-C），結果（圖6-F）顯示，瞬時過表達MbbZIP43 基因的蘋果果實花青素含量顯著高于空載對照（EV），較EV 提高了48.99%。

圖6 MbbZIP43 瞬時過表達對花青素積累的影響Fig.6 Influences of transient overexpression of MbbZIP43 gene on anthocyanin accumulations

瞬時過表達MbbZIP43 的蘋果葉脈及蘋果果皮有較為明顯的顏色變化（圖6-B,C）。RT-qPCR 結果顯示，瞬時過表達MbbZIP43 的‘八棱海棠’葉片和‘嘎啦’蘋果果皮中MbbZIP43 基因的表達水平約為EV的28.12 倍和7.85 倍。利用RT-qPCR 進一步研究了瞬時過表達MbbZIP43 的‘八棱海棠’葉片和‘嘎啦’果皮中花青素合成相關結構基因（CHI、F3'H、DFR和UFGT）的表達情況發現，瞬時過表達MbbZIP43的‘八棱海棠’葉片和‘嘎啦’果皮中這些基因的表達量顯著提高。其中，‘八棱海棠’葉片中CHI、F3'H、DFR 和UFGT 分別提高了2.27 倍、1.84 倍、2.39倍和2.89 倍；‘嘎啦’果皮中CHI、F3'H、DFR 和UFGT 分別提高了1.79 倍、1.70 倍、1.35 倍和1.51 倍。說明瞬時過表達MbbZIP43 對花青素積累的促進作用是通過誘導這些基因的表達實現的。通過預測這4 個花青素合成相關結構基因啟動子上TFBS 分布情況發現，CHI 和UFGT 啟動子區均含有bZIP 轉錄因子結合位點。過表達MbbZIP43 的‘八棱海棠’葉片和‘嘎啦’果皮中這兩個基因的上調倍數均較高，推測MbbZIP43 主要通過誘導它們的表達促進花青素積累。

3 討論

轉錄因子在花青素生物合成過程中扮演著重要調控作用［37］。其中，被研究最多的當屬MYB、bHLH 和WD40 三類轉錄因子。這三類轉錄因子通過蛋白互作形成的MYB-bHLH-WD40（MBW）復合體被認為在調控植物花青素合成過程中發揮著關鍵作用［38］。栽培蘋果MdMYB1［39］、MdMYB10［40］和MdMYBA［41］被證實可以通過上調花青素結構基因的表達促進果皮花青素的積累。An 等［42］發現過表達MdMYC2 的‘Orin’愈傷組織中花青素生物合成基因MdDFR、MdUF3GT、MdF3H 和MdCHS 的轉錄水平顯著上調。WD40 蛋白對花青素的調控多需要同MYB 或bHLH 蛋白互作實現。如蘋果WD40 蛋白MdTTG1 與bHLH 互作進而在調節花青素積累中發揮作用［43］。此外，MdHY5［44］和MdbZIP44［20］等bZIP 轉錄因子也被證實參與蘋果花青素合成調控。

3.1 MbbZIP43與花青素合成調控相關HY5蛋白序列存在較大差異

Li 等［45］研究表明PsbZIP43 可能通過調節花青素生物合成結構基因的表達，參與‘黑寶石’李子果肉花青素的積累調控。本研究從‘紅滿堂’蘋果中克隆獲得一個CDS 長為522 bp 的MbbZIP43 基因。序列比對結果顯示，該基因編碼的蛋白與PsbZIP43和蘋果、白梨、沙梨、甜櫻桃和桃的bZIP43 序列相似度均高于80%，且這些蛋白含有相同的保守基序。系統進化分析結果顯示，MbbZIP43 與蘋果和梨等薔薇科植物的bZIP43 聚為一類，說明它們在進化過程中高度保守且可能具有相似的功能。MbbZIP43 與已報道的調控花青素合成的bZIP 蛋白MdbZIP44 及HY5 均不聚在一支說明它們的功能和作用機制可能不同。

3.2 MbbZIP43的表達可能受光、逆境等多種因素影響

花青素的合成和積累受光照條件影響顯著。光照條件下，MdHY5 可直接與MdMYB1 啟動子結合促進花青素的積累［44］。UV-B 處理被證實可以顯著促進蘋果花青素積累。UV-B 處理后，受UV-B 誘導的MdWRKY72 基因的編碼蛋白可以通過調節MdHY5和MdMYB1 的表達來促進花青素的積累［46］；An等［47］發現UV-B 處理誘導MdBBX22 的表達，該基因編碼的蛋白通過與MdHY5 互作增強MdHY5 與MdMYB10 和MdCHS 啟動子的結合能力，從而導致花青素積累。本研究發現，MbbZIP43 啟動子上存在大量光響應相關元件，暗示其可能參與光調控的蘋果花青素積累。

MeJA 和ABA 處理都可以促進蘋果花青素的積累［48-49］。MbbZIP43 啟動子上存在4 個MeJA 響應相關元件和1 個ABA 響應元件，說明其可能參與這兩種激素調節的花青素合成反應。

大量研究表明花青素的生物合成受環境因素影響顯著［50］。Ubi 等［51］發現低溫可以顯著提高花青素生物合成結構基因CHS、ANS 和UFGT 的表達，進而促進蘋果皮中花青素的積累；高溫抑制MdMYB10 的表達，導致花青素在蘋果皮中的生物合成和積累減少［52］；在干旱條件下，MdERF38 的過表達可通過提高花青素合成結構基因（MdCHS、MdCHI、MdDFR 和MdUF3GT）的表達，促進了花青素生物合成［53］。An 等［54］的研究指出機械傷誘導的花青素積累與MdWRKY40-MdMYB1 相互作用有關。本研究發現，MbbZIP43 啟動子上存在20 個逆境響應相關元件，其中包括干旱和高溫脅迫元件各4 個，傷害響應元件2 個以及低溫響應元件1 個，說明該基因的表達可能受溫度、水分、機械傷等逆境環境影響。

3.3 MbbZIP43的表達水平與花青素含量正相關，瞬時過表達該基因可以促進煙草葉片、蘋果葉片和蘋果果實花青素積累

通過分析MbbZIP43 基因在不同發育時期‘紅滿堂’果實中的表達情況發現，該基因隨著果實成熟呈先升后降的表達趨勢，表達水平與花青素含量呈正相關。瞬時表達結果顯示，瞬時過表達該基因的煙草、蘋果葉片和果皮中花青素含量分別提高了17.42%、25.66% 和48.99%。CHS、CHI、F3'H、DFR、ANS 和UFGT 是花青素合成的關鍵結構基因［55-56］。An 等［20］發現MdbZIP44 通過上調花青素生物合成相關基因（MdDFR、MdUF3GT、MdF3H、MdCHI 和MdCHS）的表達來促進蘋果果皮花青素積累。本研究通過利用RT-qPCR 研究瞬時過表達MbbZIP43 的蘋果葉片和蘋果果皮中花青素合成結構基因的表達情況發現，其過表達激活了CHI、F3'H、DFR 和UFGT 基因的表達，且對啟動子區含有bZIP結合位點的CHI 和UFGT 基因的誘導效果顯著，說明MbbZIP43 可能通過上調它們的表達促進蘋果花青素積累。

4 結論

從‘紅滿堂’蘋果中克隆獲得一個CDS 長為522 bp 的bZIP 基因MbbZIP43。該基因的編碼蛋白定位于細胞核，與多個植物bZIP43 蛋白高度同源但與已報道的花青素合成調控相關HY5 蛋白序列差異較大。MbbZIP43 瞬時過表達可以顯著提高煙草葉片、蘋果葉片和蘋果果實花青素的積累，MbbZIP43瞬時過表達激活了花青素合成相關結構基因CHI 和UFGT 等的表達，進而促進花青素的積累。