獼猴桃BBX 基因家族成員鑒定與轉錄特征分析

路喻丹 劉曉馳 馮新 陳桂信 陳義挺

（1.福建農林大學園藝學院，福州 350002；2.福建省農業科學院果樹研究所，福州 350013；3.福建省落葉果樹工程技術研究中心，福州 350013）

2009 年，Khanna 等［2］首次從擬南芥（Arabidopsis thaliana）中獲得了32 個N 末端具有 B-box 結構域的蛋白，分別命名為AtBBX1-AtBBX32。根據 B-box結構域的數目、序列特征以及蛋白質是否含有 CCT結構域，將其分為5 個組。前期研究表明，植物BBX 基因家族的功能具有多樣性，可應答植物的生物脅迫（如細菌脅迫［3］）和非生物脅迫（如干旱［4］、低溫［5］、鹽脅迫［6］等）。BBX 也參與光形態建成，如在不同光質條件下介導矮牽牛（Petunia hybrida）花瓣對不同光質信號的轉導［7］；通過藍光處理，抑制草莓（Fragaria×ananassa Duch.）開花負調控因子FaBBX28c1 的表達水平，可以促進栽培草莓的開花［8］等。BBX 可以參與植物的次生代謝物的合成，如通過光誘導蘋果（Malus pumila Mill.）MdBBX21 的表達，促進果皮花青苷的生物合成［9］。BBX 在植物的不同組織部位有特異性表達，如辣椒（Capsicum annuum L.）CaBBX19 在種子中表達量極高，而CaBBX4 和CaBBX20 在植株除了種子外的所有組織中表達，且在果實特別是果皮中表達最高［10］；二倍體草莓（Fragaria vesca）‘Ruegen’和‘Yellow Wonde’中，FveBBX13 和FveBBX16 均僅在成熟果實中表達［11］。BBX 還可以對植物的生長發育進行調控，如月季（Rosa chinensis Jacq.）花瓣中PIF8-BBX28 通過響應晝夜節律信號并調節RhAPX1 基因表達，來控制H2O2含量的晝夜動態平衡，進而維持花瓣體內氧化還原平衡，防止花瓣過早衰老［12］；葡萄（Vitis vinifera L.）VvBBX22 在果實經外源ABA 和乙烯處理后表達上調，表明VvBBX22 參與調節葡萄果實成熟并起積極作用［13］。

獼猴桃（Actinidia chinensis）為原產于中國的獼猴桃科獼猴桃屬落葉藤本植物，具有極高的營養價值，豐富的生物活性和綜合利用潛能［14］。近年來，我國各地獼猴桃產業發展迅速，栽培面積和產量均居世界首位。然而，作為呼吸躍變型果實，果實貯藏方式選擇不當所造成的損耗制約了獼猴桃產業的發展。目前BBX 基因家族已從水稻（Oryza sativa）［15］、馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）［16］、小麥（Triticum aestivum L.）［17］、玉米（Zea mays L.）［18］、香蕉（Musa nana Lour.）［19］等植物中陸續被鑒定。已有研究表明植物BBX 基因家族參與植物生長發育的調控，而獼猴桃BBX 基因家族未見系統研究。

為了解獼猴桃BBX 基因家族生物學功能，本文從獼猴桃全基因組水平鑒定BBX 家族基因，系統分析其基因進化關系、蛋白理化性質特征、蛋白質保守結構域以及同源特性等，并研究其在獼猴桃不同組織部位及果實貯藏期間不同處理下的轉錄表達模式，為果實后熟軟化機制及保鮮技術研發提供基因資源，為進一步開展獼猴桃BBX 基因功能研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究以福建省農業科學院果樹研究所基地種植的4 年生‘米良1 號’獼猴桃為材料。于2017 年6-9月選取健康、長勢相當、無病蟲害的獼猴桃植株進行樣品采集，期間的土水肥、花果等田間管理參照行業標準NY/Y 5108-2002《無公害食品獼猴桃生產技術規程》進行統一管理。

1.2 方法

1.2.1 獼猴桃BBX 基因家族成員鑒定 從Ensembl Plants（http://plants.ensembl.org/）下載獼猴桃基因組信息，包括DNA、GFF、GTF、CDS、cDNA 和蛋白質文件。通過Phytozome（https://phytozome-next.jgi.doe.gov/）下載擬南芥、番茄（Solanum lycopersicum L.）、馬鈴薯及水稻基因組數據。以擬南芥和番茄BBX 家族成員蛋白序列為模板，使用TBtools 軟件對獼猴桃全基因組蛋白質序列同源檢索，刪去冗余序列后獲取候選獼猴桃BBX 家族蛋白序列。通過DNAMAN比對篩選以避免重復。采用NCBI 的在線工具CDD（conserved domain database）（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）分析蛋白質序列中的保守結構域，剔除不含B-box 保守結構域的蛋白質序列，并將篩選后獲得的序列上傳到PFAM（http://pfam-legacy.xfam.org/）、SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）進一步驗證其結構域，獲得獼猴桃BBX 基因家族成員。

1.2.2 獼猴桃BBX 基因系統發育分析 利用MegaX（https://www.megasoftware.net/）內置的ClustalW 進行多重對比，通過鄰接NJ（neighbor-joining）算法對48 個獼猴桃BBX 家族成員和32 個擬南芥BBX 家族成員構建系統發育進化樹，校驗參數Bootsrtrap 重復1 000 次。

1.2.3 獼猴桃BBX 基因理化性質及蛋白結構域分析 采用NCBI 在線工具CDD 分析獼猴桃BBX 基因家族的保守結構域，采用weblogo（http://weblogo.berkeley.edu/）對結構域保守基序進行在線分析，使用TBtools 繪制基因結構域圖。使用TBtools 繪制基因在染色體上的分布圖及密度。應用Expasy（https://web.expasy.org/protparam/）分析等電點、相對分子質量、氨基酸數量、不穩定指數等。利用WoLF PSORT（https://wolfpsort.hgc.jp/）預測亞細胞定位。

創設是生成的基礎，生成的結果和課堂創設密切相關。在英語詞匯課堂中，創設包含兩方面的含義，首先是課堂預設，即計劃性，它包括教學目標、內容、教學方法和模式的制定等活動。其次，這些活動不同于傳統意義上教師對課堂模式化和固定性的預設，而要具有一定的創造性，即教學設計要考慮學生主動參與性、師生的互動性、課堂的生態性等。以創設為基礎，英語詞匯課堂的動態生成過程避免了盲目性，具有科學性、計劃性和系統性。

1.2.4 獼猴桃BBX 基因結構及蛋白保守結構分析 采用TBtools 繪制基因在染色體上的分布圖及外顯子-內含子結構圖。利用MEME（https:// memesuite.org/meme2/tools/meme）分析蛋白保守基序，并利用TBtools 繪制保守基序圖。

1.2.5 獼猴桃BBX 基因啟動子順式作用元件及種內共線性分析 提取基因組中翻譯起始點ATG 上游2 000 bp 的啟動子序列，并提交Plant CARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/）順式作用元件分析，通過TBtools 進行可視化。利用TBtools 軟件進行物種內共線性分析。

1.2.6 獼猴桃BBX 基因的轉錄分析 將獼猴桃根、莖、葉、花、幼果（花后16 d）和成熟果（花后160 d）的組織進行液氮速凍，保存-80℃冰箱備用，每組樣品3 次重復。通過轉錄組測序分析獼猴桃BBX 基因家族在不同組織器官的表達特征。

選用大小和成熟度近似、無病蟲害、無表面機械損傷的獼猴桃成熟果（花后160 d）為材料，分為5 組，分別進行鮮果取樣（CK）、采后室溫貯藏1周（RT_1W）、采后經50 mg/L 的ABA 浸泡2 min 后室溫貯藏1 周（ABA_1W）、采后4℃條件下貯藏1（Four_1W）、2（Four_2W）、3 周（Four_3W）處理，每組30 個果，3 次生物學重復，處理結束后，取中果皮進行液氮速凍，用于轉錄測序和獼猴桃BBX 基因家族在果實貯藏過程的轉錄模式分析。

使用Illumina/Solexa Hi Seq 2000 進行轉錄組測序，獲得的原始數據去除帶接頭、含N 和低質量的reads 后，采用HISAT2 v2.0.5 軟件進行注釋，并通過featureCounts 程序計算映射到每個基因的讀數，然后根據基因的長度計算基因的FPKM 值，最后提取獼猴桃BBX 基因家族基因的FPKM 值，采用TBtools 繪制表達量聚類熱圖。

1.2.7 數據統計分析 采用Excel 2019 進行數據統計，SPSS（v24.0）軟件進行方差分析，通過TBtools、Adobe Photoshop CC 2019、Adobe Illustrator 2020 進行圖形繪制。

2 結果

2.1 AcBBX基因鑒定與系統發育分析

以擬南芥、番茄和土豆的BBX 基因作為種子序列對獼猴桃基因組進行檢索，獲得79 條候選序列，經保守域篩查并去除冗余序列后，共鑒定到48 條BBX 基因。根據它們在染色體上的分布，分別命名為AcBBX1-AcBBX48。

通過構建獼猴桃與擬南芥中BBX 蛋白序列的系統發育進化樹（圖1），分析BBX 家族間進化關系。所有BBX 成員聚為5 個分支（組I-V），每個分支均包含2 個物種的BBX 蛋白。組I 的6 個AcBBXs含有2 個B-box 結構域和1 個CCT 結構域；組II 的13 個AcBBXs 含有2 個B-box 結構域；組III 的13個AcBBXs 含 有1-2 個B-box 結構域 和1 個CCT 結構域，在結構上第2 個B-box 結構域與組I 有所差別，其中AcBBX2、AcBBX22、AcBBX23、AcBBX25和AcBBX29 沒有第2 個B-box 結構域；組IV 的5 個AcBBXs 含有1 個B-box 結構域和1 個CCT 結構域；組V 有11 個AcBBXs，僅含有1 個B-box 結構域。

圖1 獼猴桃與擬南芥BBX 基因的系統進化樹Fig.1 Phylogenetic analysis of the BBX genes between kiwifruit and Arabidopsis

2.2 AcBBX基因家族成員的理化性質分析

48 個AcBBXs 的基因大小存在較大差異（附表1），AcBBXs 蛋白長度在126（AcBBX21）-515（AcBBX23）aa 之間，編碼區序列長度最短為381 bp，最長為1 548 bp。分子量介于14 172.09（AcBBX33）-57 905.84 Da（AcBBX23）之 間，蛋白理論等電點（pI）為4.1-9.75，其中43 個為酸性蛋白，5 個為堿性蛋白。親水性平均指數為-0.981--0.109，脂肪系數在48.11-86.99 之間，不穩定指數均大于40，說明所有AcBBXs 均為親水性不穩定蛋白。亞細胞定位預測顯示，組I 除AcBBX3（細胞核）外，其他基因均定位于葉綠體；組III 所有成員均定位于細胞核；組II、IV 和V 的成員主要定位于細胞核、葉綠體和細胞質，僅有組IV 的AcBBX47 定位于線粒體。

2.3 AcBBX基因家族成員的motif分析及基因結構

以20 個motif 作為查詢上限，結果（圖2-A）顯示，AcBBXs 不同聚類組間的motif 分布差異較大，組III 擁有最多的motif 數量（6-9 個），而組V 的數量最少（1-3 個）。除組V 的11 個成員缺少motif 5 外，其余組的成員均有近5'端的motif 5 和motif 1。不同組內部的motif 分布較為均勻，具有較高的保守性，推測其結構域和功能單位基本相似。

圖2 AcBBX 基因家族的motif（A）、基因保守域（B）及基因結構（C）Fig.2 Motif（A）,conserved domains（B）and gene structures（C）of AcBBX gene family

AcBBXs 的保守結構域分析表明（圖2-B），組I、III 和IV 均具有CCT-superfamily 保守域。此外，AcBBX23 的保守域除了包含2 個B-box 外，還存在一個類似HinP1I 限制性核酸內切酶的結構域，該現象在其他成員中未發現。

進一步分析AcBBX 基因家族48 個成員的基因結構（圖2-C），AcBBXs 有1-5 個外顯子，不同聚類組的外顯子內含子組成差異較大，各組內成員的基因結構具有相似性。除AcBBX43（組IV）外，組I 和組IV 的AcBBXs 均包含2 個外顯子，組II 包含3 或5 個外顯子；組III 包含4 或5 個外顯子；組V 的AcBBX10、AcBBX21、AcBBX26、AcBBX33、AcBBX39 和AcBBX41 只包含1 個外顯子，其余5 個成員均包含2 個外顯子。

2.4 AcBBX基因家族成員的順勢作用元件分析

AcBBX 基因家族成員啟動子區除啟動子核心的基礎元件TATA-box、CAAT-box 外，共包含63 種順式作用元件（圖3），以光反應、植物激素調控、逆境脅迫響應及生長發育調控元件為主。100%的家族成員含有光反應和植物激素調控相關元件，91.67%的家族成員含有逆境脅迫響應元件，81.25%的成員含有生長發育調控元件，75%的成員均含有上述4 種元件。所有成員中，AcBBX45 所含光反應元件GT1-motif 元件數量最多（20 個），推測光照對其表達的影響較大。85.42%的家族成員含有光反應元件G-box，其中AcBBX19 所含元件數量最多（13 個）。植物激素調控相關元件中，有79.17%的成員包含有脫落酸響應元件ABRE，AcBBX19 所含元件數量最多（11 個），推測AcBBX19 對激素調節和光照方面均有響應。逆境脅迫響應相關元件中，AcBBX47 含有干旱脅迫響應元件MBS 最多（7 個），同時還有抗氧化反應元件ARE（3 個）。生長發育調控元件中，AcBBX27 含有最多的分生組織表達相關元件CATbox（4 個）。組IV 相較于其他4 個組所含順勢作用元件數量少。

圖3 AcBBX 基因的順勢作用元件分析Fig.3 Analysis of cis-acting elements in AcBBX genes

2.5 AcBBX基因家族成員的染色體定位、基因重復事件與種內同源性分析

染色體定位結果（圖4）顯示，48 個AcBBXs不均勻地分布在22 條染色體上，其中17 號和23 號染色體上的獼猴桃BBX 成員數量最多（均有6 個），而大部分染色體（11 條）均只含1 個BBX 基因。

圖4 AcBBX 基因的種內共線性、染色體密度及染色體定位Fig.4 Intraspecific collinearity of AcBBX genes and their chromosome density and locations

AcBBXs 中有3 組串聯基因，包括7 號染色體的AcBBX7 和AcBBX9，10 號染色體的AcBBX15和AcBBX16，13 號染色體的AcBBX21、AcBBX22和AcBBX24。共線性分析得到22 個片段重復對，共有29 個基因發生片段復制，其中AcBBX6 與AcBBX7 和AcBBX14 分別具有共線性關系。AcBBX24與AcBBX31 和AcBBX38 兩個基因存在片段重復，AcBBX31 同時與AcBBX38 存在片段重復，同樣的情況 發生于AcBBX40、AcBBX19 和AcBBX20。AcBBX36 分別與AcBBX47 和AcBBX48 有片段重復，AcBBX42 也分別與AcBBX47 和AcBBX48 有片段重復，AcBBX48 又與AcBBX43 有片段重復，且這5 個基因均屬于組IV 成員。

2.6 AcBBX基因家族成員轉錄水平表達分析

2.6.1 AcBBXs 在不同組織部位的表達分析 表達量熱圖顯示（圖5），AcBBXs 在獼猴桃葉、莖、花、幼果、成熟果中的表達量差異明顯。7 個成員（AcBBX6、AcBBX8、AcBBX14、AcBBX17、AcBBX21、AcBBX30、AcBBX39）在成熟果中表達較其他部位高，3個成員（AcBBX9、AcBBX16、AcBBX35）在幼果中表達較其他部位高，5 個成員（AcBBX3、AcBBX27、AcBBX34、AcBBX47、AcBBX48）在葉中表達較其他部位高，3 個成員（AcBBX11、AcBBX37 和AcBBX40）在花中表達較其他部位高。AcBBX35 在成熟果中的表達量明顯低于其他部位。AcBBX13 在獼猴桃不同組織部位中都有較高表達，AcBBX42、AcBBX34 在葉中的表達量最高，其次是幼果和莖。9 個成員（AcBBX5、AcBBX10、AcBBX12、AcBBX15、Ac-BBX19、AcBBX22、AcBBX41、AcBBX43、AcBBX46）在各個部位基本不表達（0 ≤FPKM ≤1），10 個成員在獼猴桃各部位的表達量均較低（1 ≤FPKM ≤8）。不同AcBBX 成員在各組織部位的差異表達，可能與其在特定組織部位行使的功能有關。

圖5 AcBBX 基因在獼猴桃不同組織部位的表達模式Fig.5 Expression patterns of the AcBBX genes in different tissues of kiwifruit

2.6.2 AcBBXs 在果實貯藏過程的表達分析 果實貯藏過程的表達量熱圖結果（圖6）顯示，除AcBBX48 沒有測到表達，其余47 個成員在不同采后處理過程中表達量差異較大。3 個成員（AcBBX27、AcBBX34 和AcBBX40），在ABA_1W 時的表 達量高于其他處理組且高于對照，其中AcBBX34在ABA_1W 時的表 達量是CK 的14.62 倍，推測與其啟動子含有脫落酸響應元件有關。6 個成員（AcBBX17、AcBBX23、AcBBX29、AcBBX31、AcBBX32、AcBBX39）在RT_1W 時的表達量高于其他處理組且高于對照，其中AcBBX39 在RT_1W 時的表達量是CK 的6.61 倍，說明這6 個成員參與室溫貯藏下的果實后熟。4℃低溫貯藏處理下，10個成員（AcBBX2、AcBBX4、AcBBX13、AcBBX17、AcBBX20、AcBBX23、AcBBX24、AcBBX31、AcBBX32、AcBBX38）的表達量隨低溫貯藏時間的增加而上調，其中AcBBX24 在Four_3W 時的表達量是Four_1W 的2.56 倍，AcBBX21 在低溫處理下3 個時間點的表達量均高于100，在Four_2W 時的表達量（177.89）最高，是CK（17.42）的10.21 倍；而5個成員（AcBBX8、AcBBX11、AcBBX19、AcBBX25、AcBBX27）的表達量隨低溫貯藏時間的增加而逐漸下調，說明這15 個成員參與低溫貯藏過程的果實后熟。AcBBX7、AcBBX13、AcBBX18、AcBBX35 和Ac-BBX37 在CK 時的表達最高，在ABA 處理、室溫貯藏處理和低溫處理后表達量均下調。12 個成員基本不表達（0 ≤FPKM ≤1）。AcBBXs 在采后不同貯藏處理中的表達模式的差異，表明不同成員可能在不同貯藏條件下參與果實的后熟軟化過程的調控。

圖6 AcBBX 基因在獼猴桃果實不同貯藏處理下的表達模式Fig.6 Expression patterns of the AcBBX genes under different storage treatments

3 討論

3.1 AcBBXs成員特征概述

本研究篩選出了48 個獼猴桃BBX 基因家族成員。已報道植物中，水稻有30 個［15］、小麥87個［17］、香蕉38 個［19］、葡萄25 個［20］，表明植 物BBX 基因家族成員的數量在不同植物中有較大差別。AcBBXs 的理化性質特征，如編碼區長度、親水性、等電點和亞細胞預測等與已報道的擬南芥［2］和番茄［21］BBX 基因家族成員特性相似。AcBBX 的組III（2 個B-Box 結構域和1 個CCT 結構域）中有5 個成員缺少1 個CCT 結構域，同樣的情況發生于矮牽牛BBX 基因家族的G2 組中［7］。AcBBX 不同組間的外顯子和內含子的數量存在一定差異，組V 中 的AcBBX10、AcBBX21、AcBBX26、AcBBX33、AcBBX39 和AcBBX41 沒有內含子，這在已報道的雙子葉植物BBX 基因家族中較為少見。

3.2 AcBBXs具有高度同源性

AcBBXs 具有3 個串聯基因簇（共7 個AcBBX基因），基因數量占AcBBXs 的14.56%；29 個片段重復基因組成了22 個片段重復對，重復基因占AcBBXs 的60.42%。這種家族內大量基因復制現象在植物界并不少見，StGAUT 基因家族存在12 對片段重復基因且均在純化選擇下進化［22］。AcCAT 的串聯基因簇和片段復制基因的比例分別達到55.56%和66.67%［23］。小麥MADS-box 轉錄因子的復制在一定程度上增加了其對不同環境的適應性［24］。本研究中獼猴桃BBX 基因家族組IV 的5 個成員均與組內其他成員有片段重復，可以推測獼猴桃BBX 基因特別是組IV 的進化過程高度保守，各個基因的功能和結構可能具有關聯性和相似性，后續可以進行挖掘。

3.3 AcBBXs在植物不同部位和果實貯藏過程中發揮重要作用

根據AcBBXs 啟動子的順式元件歸類結果推測，AcBBXs 可能對光照作出響應，并受到低溫、干旱、缺氧等非生物脅迫環境因子及內源激素的調控，同時參與調節生長發育過程。這也與現有的植物BBX基因家族功能分析和驗證報道結果相一致［25-28］。此外，在AcBBXs 中還發現有柵欄葉肉細胞分化、胚乳表達等元件，在后續研究中可以深入發掘并驗證。

本研究中，48 個獼猴桃BBX 基因參與了獼猴桃不同組織部位的生長發育，47 個AcBBXs 參與了獼猴桃果實貯藏過程的后熟，表達均有明顯差異。AcBBX6 在成熟果中、AcBBX42 在葉中、AcBBX11 在花中有較高表達。在不同貯藏處理中，AcBBX34 在ABA_1W 時的表達量最高，而AcBBX39 在RT_1W時的表達量最高。AcBBX21 在Four_2W 處理下的表達量最高，推測該基因對于果實貯藏期間的低溫脅迫環境可作出積極應答?；虻谋磉_模式在一定程度上可以反映基因的功能。蠟梅（Chimonanthus praecox）CpBBX19 在開花初期表達水平最高，其次是開花后期和盛花期，在萌芽期、花蕾期、展花期和花后枯萎階段表達水平最低［29］；鐵皮石斛（Dendrobium officinale）DoBBX07 在莖葉中具有最高的轉錄本豐度，但其同源基因DoBBX18 卻在葉中表達最低，在根中最高，這些基因可能直接或間接參與器官的發育建成［30］。部分基因的高表達說明AcBBXs 可能在獼猴桃成熟果、葉及花中扮演重要角色。作為呼吸躍變型果實，分析結果可以解釋獼猴桃部分AcBBX 基因在果實貯藏期間響應激素、溫度變化以及在果實呼吸作用過程中的潛在作用，但各成員的具體功能需要通過進一步的分子生物學研究進行驗證。

4 結論

本研究從中華獼猴桃全基因組中鑒定出48 個BBX 基因，AcBBXs 均為親水性不穩定蛋白，同源性高，具有3 個串聯基因簇和29 個片段重復基因，組間基因結構差異大。AcBBX42 在葉中、AcBBX11在花中表達量較高，AcBBX34 在果實處理后高度響應外源激素調控，AcBBX21 高度響應低溫脅迫。

文章所有附表數據請到本刊官網下載（http://biotech.aiijournal.com/CN/1002-5464/home.shtml）。