細菌裂解蛋白SALy102對偽中間型葡萄球菌的抗菌活性分析

朱文壯,楊 念,張躍平,張 迪

(1. 中國農業大學動物醫學院 獸醫公共衛生安全全國重點實驗室,北京 海淀 100193;2. 北京師范大學生命科學學院,北京 海淀 100875)

偽中間型葡萄球菌是一種凝固酶陽性的葡萄球菌,是犬、貓皮膚和黏膜的共生菌,是犬、貓正常菌群的一部分,寄生在犬、貓的口、鼻、頭部、腹股溝和肛門等皮膚和黏膜處[1]。其也是一種機會性致病菌,當犬、貓的抵抗力降低或各種原因導致皮膚的屏障功能減弱時,可引起感染,導致膿皮病和外耳炎等局部感染,以及泌尿道、呼吸道和生殖道等全身感染[2]。其中,皮膚感染最為常見,高達92%的膿皮病患犬中主要的病原體為偽中間型葡萄球菌[2]。此外,偽中間型葡萄球菌也被認為與大多數社會源和醫源性感染有關[3-4]。

由于抗生素的廣泛使用,獸醫臨床中偽中間型葡萄球菌的耐藥問題愈發顯著。目前已知葡萄球菌對臨床所有可用的抗菌藥均具有耐藥機制[5]。尤其是耐甲氧西林偽中間型葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphycoccuspseudintermedius,MRSP),在犬膿皮病中,MRSP占偽中間型葡萄球菌的比例高達59%以上[1]。如果耐藥問題得不到有效控制,臨床獸醫將面臨少藥甚至無藥可用的局面[6-7]。因此,人們開始將目光轉向尋找新的抗菌物質。細菌裂解酶可以裂解宿主細胞壁,導致細菌內部滲透壓過大,細胞膜破裂,細菌死亡,從而發揮殺菌作用[8]。細菌裂解酶具有高效、特異和不產生耐藥菌株等特點,且作用完畢后最終代謝成氨基酸,無毒無害,是替代抗生素的最佳候選之一,具有重要的臨床應用價值[9]。本試驗使用的細菌裂解蛋白SALy102為經過反復篩選得到的一種噬菌體裂解酶。前期試驗證明,SALy102對從牛乳腺炎中分離的金黃色葡萄球菌有較好的抑菌效果。

本試驗以偽中間型葡萄球菌為研究對象,探究SALy102對犬皮膚和耳道感染病灶分離的偽中間型葡萄球菌的抗菌活性,為SALy102裂解蛋白在偽中間型葡萄球菌感染的臨床應用提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 金黃色葡萄球菌標準菌株(ATCC29213),由中國農業大學動物醫學院外科實驗室提供。

1.2 主要試劑 SALy102凍干粉,通過大腸桿菌表達、鎳柱純化獲得SALy102蛋白后,使用凍干機制成。細菌培養所用BHI肉湯培養基、BHI瓊脂培養基和MHB培養基,均購自北京奧博星生物技術有限責任公司;PCR引物,由北京三博遠志生物技術有限責任公司合成;PremixTaq酶RR902(TaKaRa)和細菌基因組DNA快速提取試劑盒,均購自北京博邁德基因技術有限公司。

1.3 主要儀器 光學顯微鏡(ICC50 HD),購自德國徠卡(Leica)公司;PCR儀(C1000),購自伯樂(Bio-Rad)生命醫學產品(上海)有限公司;酶標儀(MuLtiiskan MK3),購自賽默飛世爾(上海)科技公司;電熱恒溫培養箱(HPX-9272MBE),購自上海博迅實業有限公司醫療設備廠。

1.4 細菌的分離和鑒定 臨床樣本采集自中國農業大學動物醫院已確診皮膚或耳道感染的患犬。將皮膚和耳道拭子接種于BHI瓊脂培養基上,37 ℃恒溫培養16～24 h。挑取單菌落于BHI瓊脂培養基上劃線,37 ℃恒溫培養16～24 h。直至獲得大小形態均一的單克隆。觀察菌落形態,挑取中等大小的白色、圓形、光滑、突起的菌落進行革蘭染色,在顯微鏡下觀察細菌形態,呈球形、藍色、排列呈葡萄串狀的細菌初步判定為葡萄球菌。使用細菌基因組DNA快速提取試劑盒提取菌株的DNA。經PCR擴增分離菌株的16S rRNA區域,所用引物序列為27F(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)。PCR產物經測序后,通過NCBI Blast比對分析,以鑒定細菌種類。

1.5 SALy102的抗菌活性 采用比濁法測定SALy102的抗菌活性[10]。當裂解蛋白發揮裂解活性時,細菌細胞壁和細胞膜破裂,細菌懸濁液濁度下降,因此,通過檢測細菌于600 nm處的光密度(Optical density in 600 nm,OD600 nm)值的變化情況即可確定SALy102是否發揮抗菌活性。分別取新鮮培養的偽中間型葡萄球菌和金黃色葡萄球菌標準菌株菌液,用BHI肉湯培養基稀釋至108CFU/mL,制備菌懸液。SALy102凍干粉用1×PBS溶解。在96孔板中加入50 μL菌懸液和10 μL SALy102溶液,使SALy102的終濃度為250 μg/mL,37 ℃培養箱中培養1 h。以相同體積的1×PBS代替SALy102溶液作為陰性對照孔。使用酶標儀檢測每孔培養前(初始)和培養后OD600 nm值,按公式(1)計算裂解率。

裂解率(%)=(試驗孔OD600 nm的減少值-陰性對照孔OD600 nm的減少值)÷初始OD600 nm×100%

(1)

1.6 SALy102對偽中間型葡萄球菌的時間-殺菌曲線 選取1株分離鑒定的偽中間型葡萄球菌繪制時間-殺菌曲線。偽中間型葡萄球菌菌懸液的制備同1.5。SALy102凍干粉用1×PBS梯度稀釋至不同初始濃度(1 500、750、375、187.50和93.75 μg/mL)。按照SALy102 10 μL/孔、菌懸液50 μL/孔先后加入至96孔板,使SALy102的終濃度為15.63、31.25、62.50、125和250 μg/mL(表1),于37 ℃培養箱中培養0、1、2、3和5 h,檢測每孔OD600 nm值。對照組中使用10 μL 1×PBS 替代10 μL SALy102溶液。

表1 細菌裂解蛋白SALy102體外抗菌試驗各組溶液配制方法

1.7 SALy102對偽中間型葡萄球菌的最小抑菌濃度(Minimal inhibit concentration,MIC)和最小殺菌濃度(Minimum bactericidal concentration,MBC) MIC和MBC的測定方法參照美國臨床和實驗室標準協會(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)推薦的微量肉湯稀釋法[11]。具體操作:偽中間型葡萄球菌于MHB培養液中37 ℃培養6 h,調整菌液濃度為1×106CFU/mL。將SALy102凍干粉用1×PBS倍比稀釋至濃度分別為512、256、128、64、32、16、8、4、2和1 μg/mL。于96孔板前10列各孔中加入50 μL倍比稀釋的SALy102,然后加入調整濃度的菌液50 μL。于第11列各孔中加入MHB培養基和調整濃度的菌液各50 μL,作為陽性對照。于第12列各孔中加入100 μL MHB培養基,作為陰性對照。37 ℃培養16～20 h,無渾濁或無菌體沉淀的孔對應的最小濃度即為MIC。從藥物濃度高于MIC的各孔中分別吸取50 μL混合液,涂布于BHI固體培養基中,37 ℃培養18～24 h后,觀察有無細菌生長,無細菌生長平板對應的最低濃度即為MBC。

1.8 統計學分析 每個試驗進行3次重復,數據以“平均值±標準差”表示。采用單因素方差分析進行數據統計學分析,以P>0.05為差異不顯著,P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著。

2 結果

2.1 細菌的分離和鑒定 經PCR擴增和序列比對,本試驗從皮膚或耳道感染的患犬中共分離鑒定出12株偽中間型葡萄球菌臨床分離菌株。

2.2 SALy102的抗菌活性 結果如圖1所示,培養1 h后,終濃度為250 μg/mL的SALy102裂解蛋白對12株偽中間型葡萄球菌的裂解率介于55.6%～93.4%,對金黃色葡萄球菌標準菌株的裂解率為72.6%。說明SALy102對12株偽中間型葡萄球菌和金黃色葡萄球菌標準菌株均有非常強的抗菌活性。

圖1 SALy102的抗菌活性

2.3 SALy102對偽中間型葡萄球菌的時間-殺菌曲線 結果如圖2所示,SALy102可以快速裂解偽中間型葡萄球菌,且SALy102終濃度為15.63 μg/mL時,也可在1 h內使偽中間型葡萄球菌的濁度明顯降低(P<0.05),說明SALy102對偽中間型葡萄球菌具有非常高的裂解活性。

圖2 SALy102對偽中間型葡萄球菌的時間-殺菌曲線

2.4 SALy102對偽中間型葡萄球菌的MIC和MBC 測定SALy102對12株偽中間型葡萄球菌臨床分離株的MIC和MBC,結果顯示,當SALy102的濃度為32 μg/mL時,孔中未見菌液渾濁和菌體沉淀,故SALy102對偽中間型葡萄球菌的MIC為32 μg/mL;從藥物濃度高于32 μg/mL的各孔中分別吸取混合液接種于BHI固體培養基上進行培養,當SALy102濃度為64 μg/mL時,未見細菌生長,故SALy102對偽中間型葡萄球菌的MBC為64 μg/mL。

3 討論

偽中間型葡萄球菌能夠引起皮膚、耳道和其他組織的嚴重感染,是犬膿皮病的主要病因[1]。隨著抗生素的廣泛使用,獸醫臨床中耐藥偽中間型葡萄球菌的情況也越來越嚴重,這給臨床治療帶來了極大的困難。因此,研發新型抗偽中間型葡萄球菌的藥物具有非常重要的意義。

裂解酶可以特異性水解細菌細胞壁的肽聚糖使細菌裂解。因肽聚糖結構在細菌中高度保守,且產生裂解酶抗性的突變對細菌來說非常有害,使得細菌對裂解酶產生耐藥性的可能性很小[12]。已有研究證明,裂解酶在體外能高效且特異性殺死耐藥細菌[13-14]。裂解酶的作用靶點在細胞外,其殺菌機制不依賴胞內靶蛋白,故不受細菌耐藥性的影響。研究發現,噬菌體裂解酶與抗生素聯合用藥可以降低抗生素的用量,降低細菌產生耐藥性的速率,也可以使耐藥細菌再次對抗生素敏感[15-16]。因此,裂解酶正逐漸成為預防和治療細菌感染的替代藥物。

本試驗使用比濁法測定SALy102裂解蛋白對偽中間型葡萄球菌的裂解活性,結果顯示,SALy102對偽中間型葡萄球菌具有較高的裂解率;MIC和MBC試驗結果也顯示,SALy102對從臨床中分離的偽中間型葡萄球菌表現出優良的抗菌活性;時間-殺菌曲線結果顯示,SALy102的裂解率在1 h內即可達到峰值,表明其可在1 h之內快速裂解偽中間型葡萄球菌。相較于抗生素需要數小時才能發揮抗菌作用,裂解蛋白的抗菌速度更快,這是SALy102在臨床應用中的優勢之一。值得注意的是,在時間-殺菌曲線中,當SALy102濃度為125和250 μg/mL時,隨著時間的延長,OD600 nm值未見明顯增加,說明SALy102在此濃度下可以較好的抑制和裂解偽中間型葡萄球菌。但當SALy102濃度≤ 62.5 μg/mL時,隨著時間的延長,OD600 nm值明顯增加,原因可能是SALy102在較低的濃度下無法完全裂解偽中間型葡萄球菌,故偽中間型葡萄球菌持續生長。這表明SALy102的殺菌效果具有劑量依賴性。此外,本試驗測定SALy102對偽中間型葡萄球菌的MBC為62.5 μg/mL,而在時間-殺菌曲線中,當SALy102濃度為62.5 μg/mL時,作用1 h后菌液OD600 nm值仍然增加,可能是因為在時間-殺菌曲線中的菌液濃度比MBC測定時的菌液濃度至少高100倍,導致MBC濃度菌液無法完全裂解偽中間型葡萄球菌,細菌繼續生長。

綜上所述,本試驗初步評估裂解蛋白SALy102對犬源偽中間型葡萄球菌的抗菌作用,結果顯示,SALy102對偽中間型葡萄球菌的抗菌作用顯著,具有用于臨床治療犬皮膚偽中間型葡萄球菌感染的潛力。下一步試驗將集中分析SALy102對偽中間型葡萄球菌的作用特點,為后續SALy102的臨床應用提供更完善的基礎數據。