長鏈非編碼RNA RP11-641D5.1通過靶向微小RNA-486-5p調控急性髓系白血病細胞增殖、細胞周期和免疫逃逸實驗研究

敖會芳,黃 華,王紅權,劉 俊,郭春梅,姚 云

(1.荊楚理工學院附屬中心醫院 荊門市人民醫院血液內科,湖北 荊門 448000;2.荊楚理工學院附屬中心醫院 荊門市人民醫院感染性疾病科,湖北 荊門 448000;3.大連醫科大學附屬第一醫院腫瘤科,遼寧 大連 116011)

急性髓系白血病是成年人常見的血液系統腫瘤,起源于髓系造血干/祖細胞,表現為異常的幼稚細胞和原始細胞過度增殖[1-2]。急性髓系白血病患者5年生存率較低,且發病率表現為逐漸上升趨勢,嚴重危害患者的生命健康[3]。目前,急性髓系白血病的發病機制并不清楚。長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)是一類無蛋白編碼功能的單鏈RNA分子,廣泛表達于真核細胞中,參與調控基因的轉錄和翻譯[4]。隨著生物信息學的發展,越來越多的研究[5-7]表明,lncRNA作為一種功能性RNA,影響多種腫瘤如黑色素瘤、骨肉瘤、膽管瘤、白血病的發生和發展。lncRNA不僅能夠作為急性髓系白血病的診斷標志物,還具有潛在治療價值,其在急性髓系白血病的靶向治療方面發揮重要作用[8-9]。根據lncRNAdb數據庫分析發現,RP11-641D5.1基因位于人染色體3q26.2區域,負責編碼長度為410個核苷酸長度的lncRNA。RP11-641D5.1在惡性腫瘤特別是急性髓系白血病中的表達和功能尚未明確。本研究基于基因表達綜合數據庫(Gene Expression Omnibus,GEO)分析顯示,急性髓系白血病患者骨髓組織中RP11-641D5.1表達明顯低于正常骨髓組織。因此,本研究通過上調RP11-641D5.1表達分析急性髓系白血病細胞增殖、細胞周期和免疫逃逸的變化及可能的分子機制,為尋找急性髓系白血病診療的潛在靶標提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞與主要試劑 人骨髓基質細胞HS-5和急性髓系白血病細胞株(HL-60、SKM-1、THP-1、KG-1、NB4)購自中科院上海細胞庫。微小RNA(miR)-486-5p、miR-NC、陰性質粒和RP11-641D5.1質粒(批號:STLC006、STLC008、MILC003、MILC004)購自廣州銳博生物公司;TRIzol試劑、細胞周期試劑盒(批號:631460、672349)購自日本Takara公司;熒光素酶野生型載體RP11-641D5.1-WT和突變型載體RP11-641D5.1-MUT(批號:KHC0532、KHC0648)購自武漢三鷹科技有限公司;酶聯免疫吸附試劑盒、Lipofectamine 3000、反轉錄試劑盒(批號:12356151、12445032、12749869)購自美國Invitrogen公司;雙熒光素酶報告基因試劑盒(批號:HZYY9684)購自杭州禹揚科技有限公司;磷酸化酪氨酸激酶(p-JAK)、磷酸化轉錄激活因子(p-STAT)、β-微管蛋白(β-Tubulin)、信號轉導和轉錄激活因子3(SOCS3)、核內原癌基因c-myc抗體(批號:ab32101、ab267373、ab18207、ab280884、ab185656)購自英國Abcam公司。

1.2 細胞培養與轉染 用含13%胎牛血清的DMEM培養基培養HS-5、SKM-1細胞,用含13%胎牛血清的IMDM培養基培養HL-60細胞,用含13%胎牛血清的RPMI-1640培養基培養THP-1、KG-1、NB4細胞,在恒溫和恒濕培養箱中常規培養。轉染前18 h,將對數生長期SKM-1細胞接種在24孔板,采用Lipofectamine 3000脂質體試劑分別將陰性質粒(NC組)和RP11-641D5.1質粒(RP11-641D5.1組)轉染到SKM-1細胞,最終濃度為50 nmol/L。

1.3 實驗方法

1.3.1 實時定量PCR(RT-qPCR)檢測RP11-641D5.1和miR-486-5p表達:用TRIzol試劑提取細胞總RNA,采用無核酸酶的雙蒸水溶解,通過Nano Drop分光光度分析總RNA的純度和濃度。采用反轉錄試劑盒反轉錄2.0 μg RNA為cDNA,在PCR擴增儀中進行RT-qPCR。以GAPDH或U6為內參,引物序列見表1。采用2-ΔΔCt法分析RP11-641D5.1和miR-486-5p表達。

表1 各基因引物序列

1.3.2 集落形成實驗檢測SKM-1細胞增殖:將轉染后的兩組SKM-1細胞分別以3000個/孔重新接種于6孔板,每組5個復孔。恒溫、恒濕培養11 d。采用2 ml無水甲醇固定SKM-1細胞,2 ml結晶紫染色,用雙蒸水充分洗滌,烘干后觀察兩組SKM-1細胞的集落形成,統計分析并拍照。

1.3.3 流式細胞術檢測SKM-1細胞周期:收集轉染后的兩組SKM-1細胞,制備為單細胞懸液。采用2 ml 75%乙醇在低溫下固定SKM-1細胞,加入300 μl PI試劑染色15 min。通過篩網充分過濾兩組細胞懸液,流式細胞儀分析SKM-1細胞的周期分布。

1.3.4 酶聯免疫吸附實驗檢測細胞因子表達量:收集轉染后的兩組SKM-1細胞,分別加入T淋巴細胞共培養48 h。加入150 μl生物素標記的抗體工作液,室溫下反應1.5 h。用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗5次,加入150 μl辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗工作液,室溫下反應1 h。用PBS溶液洗5次,加入150 μl四甲基聯苯胺(TMB)顯色液,室溫下反應1 h。加入150 μl終止液,采用全自動酶標儀分析各孔的光密度值,計算干擾素γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-2(IL-2)的含量。

1.3.5 雙熒光素酶報告實驗檢測RP11-641D5.1和miR-486-5p的靶向關系:用LncCeRBase軟件預測RP11-641D5.1和miR-486-5p的結合位點。分別共轉染RP11-641D5.1-WT與miR-NC、RP11-641D5.1-WT與miR-486-5p、RP11-641D5.1-MUT與miR-NC、RP11-641D5.1-MUT與miR-486-5p至對數生長期的SKM-1細胞,應用雙熒光素酶報告基因試劑盒處理各組SKM-1細胞,熒光發光檢測儀檢測螢火蟲熒光素活性以及海腎熒光素活性。

1.3.6 蛋白質印跡(Western blot)檢測JAK-STAT3信號通路蛋白表達:配制含2%蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液,提取轉染后兩組SKM-1細胞的總蛋白。取55 μg蛋白樣品在13% SDS-PAGE膠電泳3 h,用260 mA電流轉膜到聚偏二氯乙烯膜。加入快速封閉液,室溫下封閉20 min。制備一抗稀釋液,均按照1∶2000進行稀釋,低溫孵育一抗17 h。ECL顯影試劑處理2 min后,在暗室內曝光并顯影。

2 結 果

2.1 急性髓系白血病細胞株中RP11-641D5.1表達情況 見圖1。RT-qPCR結果顯示,相對于HS-5細胞,急性髓系白血病細胞株HL-60、SKM-1、THP-1、KG-1、NB4中RP11-641D5.1表達較低,且SKM-1細胞中表達最低(均P<0.05)。故后續采用SKM-1細胞進行實驗。

注:與HS-5比較,*P<0.05;與SKM-1比較,#P<0.05圖1 急性髓系白血病細胞株中RP11-641D5.1表達比較

2.2 兩組SKM-1細胞RP11-641D5.1表達量比較 轉染實驗結果顯示,NC組與RP11-641D5.1組中RP11-641D5.1相對表達量分別為1.03±0.25和10.17±0.79。與NC組比較,RP11-641D5.1組SKM-1細胞中RP11-641D5.1表達量升高(P<0.05)。

2.3 過表達RP11-641D5.1對SKM-1細胞增殖的影響 見圖2。集落形成實驗結果顯示,NC組和RP11-641D5.1組SKM-1細胞集落形成數量分別為(116.86±15.43)個和(42.70±11.14)個。與NC組比較,RP11-641D5.1組SKM-1細胞集落形成數量減少(P<0.05)。

注:左圖為兩組細胞結晶紫染色結果;右圖中,與NC組比較,*P<0.05圖2 過表達RP11-641D5.1對SKM-1細胞增殖的影響

2.4 過表達RP11-641D5.1對SKM-1細胞周期的影響 見圖3。流式細胞術結果顯示,與NC組比較,RP11-641D5.1組G0/G1期細胞比例升高,S期和G2/M期細胞比例降低(均P<0.05)。

注:與NC組比較,*P<0.05圖3 過表達RP11-641D5.1對SKM-1細胞周期的影響

2.5 過表達RP11-641D5.1對SKM-1細胞IFN-γ、TNF-α、IL-2含量的影響 見圖4。酶聯免疫吸附實驗結果顯示,與NC組比較,RP11-641D5.1組共培養的T淋巴細胞釋放的細胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-2含量升高(均P<0.05)。

注:與NC組比較,*P<0.05圖4 過表達RP11-641D5.1對SKM-1細胞IFN-γ、TNF-α、IL-2含量的影響

2.6 雙熒光素酶報告實驗結果 見圖5、6。LncCeRBase軟件預測結果顯示,RP11-641D5.1與miR-486-5p存在互補結合序列,miR-486-5p可能為RP11-641D5.1的靶基因。雙熒光素酶報告實驗結果顯示,與miR-NC比較,miR-486-5p能夠抑制RP11-641D5.1-WT的熒光素酶活性(P<0.05),而對RP11-641D5.1-MUT的熒光素酶活性無顯著影響(P>0.05)。

圖5 RP11-641D5.1與miR-486-5p的結合位點

2.7 過表達RP11-641D5.1對 miR-486-5p表達的影響 RT-qPCR結果顯示,NC組與RP11-641D5.1組SKM-1細胞中miR-486-5p相對表達量分別為6.15±0.37和0.98±0.30。與NC組比較,RP11-641D5.1組SKM-1細胞中miR-486-5p表達水平降低(P<0.05)。

2.8 過表達RP11-641D5.1對JAK-STAT3信號通路蛋白表達的影響 見圖7。Western blot結果顯示,與NC組比較,RP11-641D5.1組JAK-STAT3信號通路蛋白p-JAK、p-STAT、SOCS3、c-myc蛋白表達水平降低(均P<0.05)。

圖7 JAK-STAT3信號通路蛋白電泳圖

3 討 論

lncRNA是非編碼RNA家族的重要成員,參與細胞的各種活動如氨基酸代謝、脂肪消化、糖異生等[10-11]。近年來研究[12-13]發現,lncRNA在肺鱗癌、三陰性乳腺癌、鼻咽癌等多種腫瘤中異常表達,能夠促進或抑制腫瘤細胞的生長、凋亡和免疫逃逸。越來越多的lncRNA被證明參與急性髓系白血病的發生、發展過程,與患者預后呈負相關或正相關[14-15]。例如,lncRNA USP30-AS1在急性髓系白血病中高表達,其高表達與急性髓系白血病預后不良有關,lncRNA USP30-AS1可促進急性髓系白血病細胞活力、免疫逃逸并抑制細胞凋亡[16]。研究[17]發現,與正常骨髓組織相比,lncRNA MAFG-AS1在急性髓系白血病中過表達,通過海綿化miR-147b促進急性髓系白血病HL-60細胞生長、細胞周期進展和上皮間充質轉化。目前,RP11-641D5.1在腫瘤中的表達模式和作用研究較少。

GEO數據庫分析顯示,RP11-641D5.1在急性髓系白血病患者骨髓組織中呈低表達。本研究中,RP11-641D5.1在急性髓系白血病HL-60、SKM-1、THP-1、KG-1、NB4細胞中也呈低表達,其可能是急性髓系白血病診斷的分子標記。本研究結果顯示,過表達RP11-641D5.1的急性髓系白血病SKM-1細胞增殖活力顯著降低,同時細胞在G0/G1期發生阻滯,細胞IFN-γ、TNF-α、IL-2含量增加,表明細胞的免疫逃逸顯著被抑制,提示RP11-641D5.1在急性髓系白血病細胞中可能為抑癌基因。研究[18-21]證實,lncRNA主要作為競爭性內源性RNA充當分子海綿,定向結合miRNA。本研究利用LncCeRBase軟件分析發現,miR-486-5p與RP11-641D5.1存在結合位點。雙熒光素酶報告實驗檢測發現,RP11-641D5.1能夠靶向結合miR-486-5p。miR-486-5p在卵巢癌、胰腺癌、非小細胞肺癌等多種惡性腫瘤組織和細胞中高表達,能夠促進腫瘤細胞的生長和分化,在腫瘤發生及發展過程中發揮關鍵作用[22-24]。研究[25]表明,miR-486-5p在急性髓系白血病中表達上調,能夠顯著促進急性髓系白血病的惡性生物學行為。本研究采用RT-qPCR檢測發現過表達RP11-641D5.1后miR-486-5p表達量下調。以上實驗結果說明,RP11-641D5.1可作為miR-486-5p的競爭性內源性RNA發揮作用。多項研究表明,JAK-STAT3信號通路在急性髓系白血病細胞中異常表達,其激活能夠加速急性髓系白血病細胞周期進展,促進腫瘤細胞的增殖和免疫逃逸。已有研究[23]證實,miR-486-5p主要通過介導激活JAK-STAT3信號通路促進急性髓系白血病的發展。本研究又發現,過表達RP11-641D5.1后JAK-STAT3信號通路相關蛋白p-JAK、p-STAT、SOCS3、c-myc活性降低。進一步研究證明RP11-641D5.1通過調控miR-486-5p表達參與急性髓系白血病的發展。

綜上所述,RP11-641D5.1在急性髓系白血病中表達水平降低,可能通過下調miR-486-5p表達抑制急性髓系白血病細胞增殖、周期進展及免疫逃逸。RP11-641D5.1可能成為急性髓系白血病分子治療的潛在靶點。本研究的不足之處在于RP11-641D5.1是否在體內同樣對急性髓系白血病細胞的生長和免疫逃逸具有抑制作用,本研究下一步將通過建立急性髓系白血病小鼠模型探究RP11-641D5.1在體內的抑癌作用。