姜黃素對磨損顆粒誘導的體外破骨細胞的作用及機制實驗研究

劉子歌,袁 昂,王文鵬,陳德勝

(1.廣西醫科大學臨床醫學院,廣西 南寧 530020;2.寧夏回族自治區人民醫院骨科,寧夏 銀川 750002)

無菌性松動是人工全關節置換術后常見的長期并發癥,也是手術翻修的主要原因之一[1]。研究[2-4]表明,無菌性松動主要源于人工關節接觸面之間的相互移動摩擦,導致產生微小的磨損顆粒,磨損顆粒會被界面之間的巨噬細胞所吞噬,同時被激活釋放大量的炎性介質,這些細胞因子能激發破骨細胞產生骨吸收,造成假體周圍骨組織的溶解,即種植體周圍骨溶解 (Peri-implant osteolysis,PIO),最終導致無菌性松動。研究[4]發現,無菌性松動患者的免疫系統在這一過程中發揮了重要作用,人工關節產生的磨損顆?？梢l免疫系統的免疫反應,從而加劇炎癥。此過程包括T細胞和B細胞的激活,由此產生更多的炎癥因子,如腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素(Interleukin,IL)-1β、IL-6、前列腺素E2 (Prostaglandin E2,PGE2)等。免疫系統的參與不僅加劇了炎癥反應,還可能影響骨組織的局部免疫調節,導致骨組織損傷,導致PIO和無菌性松動[5]。

姜黃素(Curcumin,Cur)是一種天然的生物活性化合物,主要存在于姜、肉桂、胡椒等食物中[6]。研究表明Cur具有多種益處,包括抗氧化、抗炎和抗腫瘤作用。Cur被認為可以通過干預細胞信號通路,降低炎癥反應。有研究指出,Cur可以促進成骨細胞的發育和功能,同時抑制破骨細胞的生成。這意味著Cur可能有助于保護骨骼和延緩骨關節疾病的進展[7]?；谶@些發現,我們猜測Cur也可能對人工關節無菌性松動問題產生積極的影響。為了驗證這一假設,本研究探索Cur對磨損顆粒誘導的破骨細胞生成及功能的影響,并通過檢測核因子-κB(Nuclear factor-κB,NF-κB)信號通路來揭示其潛在的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞與主要試劑 小鼠巨噬細胞株RAW264.7購自中國科學院上海細胞庫。達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基(DMEM)高糖培養基(貨號:21331046)、胎牛血清(貨號:10099141C)購自美國Gbico公司;商品純化鈦(Ti)顆粒(貨號:7440-32-6)購自美國Alfa Aesar公司;Cur (貨號:458-37-7)購自美國MCE公司;抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色試劑盒(貨號:42010102)購自美國Sigma公司;TNF-α(貨號:bsk12002)、IL-1β(貨號:bsk12015)、基質金屬蛋白酶(MMP)-9(貨號:bsk12013) ELISA試劑盒購自北京博奧森生物技術公司;細胞計數(CCK-8)試劑盒(貨號:KGA317)購自江蘇凱基生物技術公司;Prime Script RT reagent Kit Perfect Real Time RNA反轉錄試劑盒(貨號:RR037Q)、Ultra SYBR One Step RNA PCR Kit熒光定量PCR試劑盒(貨號:RR064A)購自日本Takara生物公司;β-actin抗體(貨號:4967S)、p-p65(貨號:3033S)、磷酸化NF-κB抑制蛋白α(p-IκBα)(貨號:2859S)購自美國Cell Signaling公司;鬼筆環肽染色試劑(貨號:G1248-100T)購自武漢塞維爾公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 鈦顆粒準備:使用掃描電鏡檢查鈦顆粒的尺寸和直徑,以確保實驗所需的鈦顆粒符合要求。將鈦顆粒在180 ℃下焙烤6 h,然后浸泡在75%乙醇中,在水平搖床上搖動48 h。隨后離心處理,收集鈦顆粒并加入磷酸鹽緩沖液(PBS),進行高溫、高壓處理以再次確保無菌。使用PBS將高壓滅菌后的鈦顆粒重新懸浮。進行內毒素檢測,確保內毒素含量低于0.1 EU/ml,使Ti顆粒適用于細胞實驗。最終,實驗所使用的Ti顆粒濃度為0.1 mg/ml[8]。

1.2.2 CCK-8細胞增殖實驗:將RAW264.7細胞以5000個/孔的密度接種到96孔板中。加入不同濃度的Cur(0、1、5、10、15、20、30 μmol/L)進行干預。持續培養72 h后,加入10 μlCCK-8溶液,使用酶標儀在450 nm波長處測量吸光度值(A)。細胞增殖率(%)=[A(加藥)-A(空白)]/[A(未加藥)-A(空白)]×100%。以0 μmol/L濃度作為空白組,以確定RAW264.7細胞在沒有Cur干預情況下的基礎增殖率。后續選擇對RAW264.7細胞正常增殖沒有毒性效應的Cur濃度作為干預濃度。

1.2.3 細胞培養及分組:將RAW264.7細胞置于含有10%胎牛血清的DMEM培養基中,在5% CO2、37 ℃細胞培養箱中培養。將細胞分為空白組(完全培養基)、模型組(空白組+Ti 0.1 mg/ml)、低濃度Cur組(模型組+Cur 1 μmol/L)、中濃度Cur組(模型組+Cur 10 μmol/L)、高濃度Cur組(模型組+Cur 15 μmol/L)。

1.2.4 TRAP染色:將RAW264.7細胞以1×104個/孔接種于6孔板中,待細胞貼壁后按1.2.2方法分組處理,共培養5 d。然后用4%多聚甲醛固定細胞。加入TRAP染液在37 ℃生物培養箱中避光孵育1 h,堿性液沖洗干凈并晾干,在光鏡下觀察并計數。TRAP染色陽性的破骨細胞通常為體積大、多核且胞漿中通常含有紫紅色顆粒的細胞。

1.2.5 鬼筆環肽染色:固定前操作同1.2.4。0.1% Triton X-100穿膜5 min,加入鬼筆環肽染色液在37 ℃生物培養箱中避光孵育2 h。DAPI室溫染色細胞核 5 min。沖洗干凈后封片,在熒光顯微鏡下觀察并計數。鬼筆環肽染色用于標記和可視化破骨細胞內的肌動蛋白纖維(F-actin)。F-actin是肌動蛋白的一種聚合物,在破骨細胞中具有關鍵的作用,陽染細胞通過熒光的強度與F-actin環的大小判斷相關破骨細胞的骨吸收功能的強弱。

1.2.6 ELISA實驗:將RAW264.7細胞以5×103個/孔接種于96孔板中,5 d后收集細胞培養上清,以160 r/min離心以去除Ti顆粒和細胞。按照ELISA試劑盒說明書步驟檢測細胞培養上清液中TNF-α、IL-1β、MMP-9蛋白含量。

1.2.7 Western blot實驗:各組細胞培養5 d后提取蛋白,使用BCA蛋白定量試劑進行蛋白定量。配置12%分離膠溶液,每孔添加50 μg蛋白樣本。使用SDS-PAGE電泳技術進行蛋白分離,然后轉移到硝酸纖維素膜(NC膜)上。NC膜上的蛋白質用5%牛血清白蛋白(BSA)封閉1 h。將p-p65(1∶1000稀釋)和p-IκBα(1∶1500稀釋)的一抗進行冷藏過夜處理。將二抗(1∶10000稀釋)在室溫下孵育2 h。采用Image J軟件對圖像進行分析。

1.2.8 PCR實驗:各組細胞培養5 d后,按照TRIzol試劑說明書提取總RNA。用反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄成cDNA,放入反轉錄儀中進行反轉錄反應,檢測TRAP、TNF-α、活化 T 細胞核因子 1 (NFATc1)、IL-1β mRNA。以β-actin為內參,引物序列見表1。

表1 各基因引物序列

2 結 果

2.1 不同濃度Cur對小鼠RAW264.7巨噬細胞增殖活性的影響 見圖1。CCK-8結果顯示,Cur濃度小于15 μmol/L對RAW264.7巨噬細胞增殖活性的影響與空白組比較無統計學差異(均P>0.05),20、30 μmol/L Cur干預下RAW264.7細胞增殖率顯著性下降(均P<0.05)。因此,采用不高于15 μmol/L Cur進行后續實驗。

注:與空白組(0 μmol/L)比較,*P<0.05圖1 不同濃度Cur對RAW264.7巨噬細胞增殖活性的影響

2.2 不同濃度Cur對小鼠RAW264.7細胞分化的破骨細胞數目的影響 見圖2。TRAP染色結果顯示,模型組可觀察到許多體積較大、酒紅色、內含多個細胞核的破骨細胞。給予不同濃度Cur干預后,染色呈陽性的破骨細胞數目隨著藥物濃度的增加而減少。進一步在顯微鏡下計數TRAP陽性細胞,空白組未檢出,模型組成熟破骨細胞數量為(145.31±7.87)個,低、中、高濃度Cur組TRAP陽性細胞數量分別為(139.76±5.63) 個、(87.63±4.12)個和(45.51±3.65)個。中、高濃度Cur組TRAP陽性細胞數量低于模型組(均P<0.05) 。

圖2 不同濃度Cur干預5 d后各組破骨細胞TRAP染色結果(×200)

2.3 不同濃度Cur對破骨細胞環形成的抑制效應 見圖3。在模型組中觀察到了少量較大且呈綠色的F-actin環包圍著多核細胞,而細胞核則被DAPI染成藍色。此外,在細胞膜上觀察到一些偽足。在低、中濃度Cur組中,肌動蛋白骨架的環相對于模型組有所減少,且細胞核數量減少。而在高濃度Cur組中,多核細胞數量明顯減少。

圖3 不同濃度Cur對破骨細胞環形成的抑制效應(鬼筆環肽染色,×200)

2.4 不同濃度Cur對破骨細胞TNF-α、IL-1β和MMP-9表達的影響 見圖4。與模型組比較,不同濃度Cur組TNF-α、IL-1β和MMP-9表達降低(均P<0.05)。

注:與模型組比較,*P<0.05圖4 不同濃度Cur對破骨細胞RAW264.7細胞TNF-α、IL-1β和MMP-9表達的影響

2.5 不同濃度Cur對破骨細胞p-IκBα和p-p65蛋白表達的影響 見圖5。與模型組比較,低濃度Cur組、中濃度Cur組、高濃度Cur組p-IκBα和p-p65蛋白表達降低(均P<0.05)。

注:與模型組比較,*P<0.05圖5 不同濃度Cur對p-IκBα和p-p65蛋白表達的影響

2.6 不同濃度Cur對破骨細胞TRAP、TNF-α、IL-1β和NFATc1 mRNA表達的影響 見圖6。與模型組比較,不同濃度Cur組TRAP、TNF-α、IL-1β和NFATc1 mRNA表達降低(均P<0.05) 。

注:與模型組比較,*P<0.05圖6 不同濃度Cur對破骨細胞TRAP、TNF-α、IL-1β和NFATc1 mRNA表達的影響

3 討 論

研究[9]表明,骨溶解與過度活躍的破骨細胞和骨吸收密切相關。目前的研究發現,磨損顆粒的摩擦通常引發炎癥反應,破壞了機體內部骨吸收和骨形成之間的平衡,這是PIO的典型特征。雖然多種細胞類型參與這一病理過程,但破骨細胞是引起骨丟失和導致假體松動的主要骨降解細胞。一般來說,磨損顆粒主要由假體表面互相摩擦產生,在人工關節中這些磨損顆粒通常是金屬碎片或超高分子量聚乙烯顆粒。這些顆粒會引起免疫細胞(包括巨噬細胞和T淋巴細胞)聚集到骨-種植體界面,觸發一系列促炎細胞因子的釋放,從而加速周圍炎性微環境的形成[10]。在這些炎癥介質中,巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)和NF-κB受體活化因子配體(RANKL)在激活破骨細胞過程中起著關鍵作用。M-CSF促進單核/巨噬細胞生長和分化成破骨細胞前體細胞。一旦RANKL與破骨細胞前體細胞表面RANKL結合,就會激活下游信號傳導通路,主要包括NF-κB信號通路,導致成熟的破骨細胞分化和隨后的骨吸收活動[11]。因此,干預破骨細胞的主要信號通路有望成為治療PIO的有效策略。

本研究使用的RAW264.7細胞是一種常用于炎癥和免疫相關研究的小鼠巨噬細胞系,通常用于研究巨噬細胞的生物學特性、免疫反應以及與疾病相關的機制。這些細胞可在體外模擬炎癥反應,特別是與炎癥相關的細胞因子產生和巨噬細胞活性。在骨科研究中通常使用RAW264.7細胞來誘導它們分化為破骨細胞,然后研究破骨細胞的分化、功能以及它們與骨骼健康和疾病之間的關系。這些研究有助于深入了解骨骼代謝、骨質疏松癥、骨折愈合等方面的生物學過程,從而為骨科研究和治療提供了重要的信息。Cur是一種存在于多種植物中的天然化合物。近期研究表明Cur具有多種有益的潛在作用,包括心血管健康和癌癥預防。盡管如此,這些保護機制尚未得到詳盡的探討。有研究[12-13]表明,其中一個可能的保護機制是通過下調炎癥反應。這種下調包括抑制促炎介質的合成和釋放,影響二十烷類化合物的產生從而抑制某些免疫細胞的激活,也可通過Cur對NF-κB或激活蛋白1等轉錄因子的抑制作用減少促炎介質的合成[14]。這一機制可能有助于解釋Cur在多種疾病中的潛在益處,但仍需要進一步的研究來闡明其細節和潛在應用。

本研究采用磨損顆粒誘導的體外破骨細胞形成模型,以驗證Cur在PIO中的作用。為了排除Cur通過對RAW264.7細胞產生毒性作用來影響破骨細胞形成的可能性,我們首先對RAW264.7細胞進行了不同濃度Cur的處理,持續72 h,以評估Cur的細胞毒性水平。實驗結果表明,小于等于15 μmol/L Cur對RAW264.7細胞的增殖沒有影響,因此我們選擇了不高于15 μmol/L Cur作為后續實驗的干預濃度。

骨吸收標志酶TRAP通常被用來鑒定成熟的破骨細胞,具有3個或以上細胞核并且TRAP染色呈陽性(酒紅色)的細胞被識別為破骨細胞[15]。本研究通過TRAP染色實驗證實了不同濃度Cur對RAW264.7細胞向破骨細胞的分化產生了影響。隨著Cur濃度的增加,染色呈陽性的破骨細胞數量減少,這表明Cur可以抑制了體外破骨細胞的成熟。此外,F-actin環的形成被認為是破骨細胞發揮骨吸收功能的前提條件[16]。因此,本研究進行了鬼筆環肽染色實驗,以評估Cur對F-actin環形成的影響,結果與TRAP染色結果一致,模型組顯示出大且清晰的F-actin環。然而,在Cur干預后,F-actin環的大小隨著Cur濃度的增加而減小。綜合TRAP的結果,我們認為Cur在體外能夠抑制破骨細胞的功能和成熟度,并且這種抑制與Cur濃度呈正相關。

炎性骨溶解所誘導的炎性反應主要是通過磨損顆粒自身刺激巨噬細胞、成纖維細胞、成骨細胞及T淋巴細胞等分泌大量的TNF-α、IL-1β和IL-6炎性因子引起[17]。本研究用ELISA實驗檢測了模型中第5天上清培養液中TNF-α、IL-1β和MMP-9的表達量,顯示Cur能夠顯著抑制上述炎癥因子的表達,進一步證實Cur具有良好的抗炎效果。以前的研究已經證明活化NFATc1和TRAP,對破骨細胞的形成和激活至關重要[18]。NFATc1是RANKL誘導的破骨細胞分化的主要調節劑,并且通過上調負責破骨細胞黏附、遷移、酸化以及無機和有機骨基質降解的各種基因。RANKL與RANK的結合導致腫瘤壞死因子受體相關因子6(TRAF6)的募集,并導致下游分子如NF-κB和c-Jun的活化。NFATc2和NF-κB的協同作用激活了NFATc1,c-Jun信號與核因子相關的T細胞(NFAT)協同作用對RANKL調控的破骨細胞分化起到重要作用[19]。NFATc1轉錄因子常以高度磷酸化形式存在于細胞質中,當受到Ca2+刺激后,去磷酸化的NFATc1可以導致一系列破骨細胞特異性基因如MMP-9、TRAP、組織蛋白酶 K等的表達[20-23]。本研究PCR結果表明,Cur可顯著降低 NFATc1、TRAP mRNA的表達,表明Cur不僅可以影響 NFATc1 的表達,也可以影響其下游因子的表達。IκBα作為IκB家族中最重要的成員之一,調控NF-κB細胞通路中關于機體免疫與炎癥的途徑,其與p65/p50二聚體結合后活性將受到抑制[24-26]。本研究最后檢測了Cur處理后IκBα和p65磷酸化蛋白的表達,顯示Cur可能通過影響IκBα和p65磷酸化抑制了Ti顆粒誘導的小鼠RAW264.7巨噬細胞中NF-κB通路的活化。

綜上所述,磨損顆?？赡芡ㄟ^NF-κB的激活參與PIO和人工關節無菌性松動。Cur對體外磨損顆粒誘導的破骨細胞生成和破骨細胞功能有抑制作用,其抑制作用的機制可能是抑制NF-κB信號通路。因此,Cur可能是治療假體磨損顆粒引起的骨溶解的一種潛在治療藥物。