多次吸入七氟醚對幼鼠學習記憶的影響實驗研究

陳雅慧,馬芬芬,田藝苑,鄧智中,蘭忠平

(延安大學醫學院,陜西 延安 716000)

七氟醚是常用吸入麻醉藥,具有潛在神經元毒性作用,會導致認知功能障礙。有研究[1]發現,七氟醚可誘導新生大鼠神經元樹突棘發育異常,使大鼠發生認知障礙。有研究[2-5]發現,七氟醚可使腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白細胞介素(Interleukin,IL)-1β過度表達而損傷神經元,其損傷神經元的機制與誘導皮質神經元發生鐵死亡有關。然而,七氟醚對發育期大鼠學習記憶功能的影響是否與吸入時間、次數相關,目前研究報道較少。因此,本研究針對這一問題進行實驗研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD大鼠40只,雌雄各半,3周齡,體重45～55 g,由西安交通大學實驗動物中心提供,合格證號:SCXK(陜)2022-010。

1.2 主要試劑 吸入七氟醚(國藥準字H20070172)購自上海恒瑞醫藥有限公司;乙酰膽堿酯酶(AchE)檢測試劑盒(批號: 20220515)和一氧化氮合酶(NOS)檢測試劑盒(批號: 20220837) 購自南京建成生物工程研究所;半胱氨酸蛋白酶-3(Capase-3)和B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)試劑購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 不同時長七氟醚麻醉幼鼠模型制備:將SD幼鼠分為四組,每組10只。A組不吸入七氟醚;B組吸入3%七氟醚2 h;C組吸入3%七氟醚2 h,每周1次,共2次;D組吸入3%七氟醚2 h,每周1次,共3次。除A組外,將其余各組幼鼠置于麻醉箱中,自制透明麻醉箱上方接口與動物呼吸麻醉機通氣孔相連通,箱內通入3%七氟醚和30%氧氣(氧氣流量為3 L/min)混合氣體。麻醉期間仔細觀察幼鼠狀態如肢端皮膚和黏膜顏色。麻醉結束后打開麻醉箱,待幼鼠自然清醒后放回飼養籠中,其余時間正常飼養。

1.3.2 Morris水迷宮實驗:各組大鼠飼養至42日齡后,進行連續6 d的Morris水迷宮實驗。前5 d進行水迷宮定位航行實驗,第6天進行空間探索實驗。①水迷宮定位航行實驗:將平臺隱蔽水下2 cm,水中加入牛奶,掩蓋平臺分別從四個象限固定點。將大鼠放入水中,設定120 s,記錄大鼠找到平臺所需時間(潛伏期)。如果大鼠失敗,則將其引導至平臺,停留10～15 s,潛伏期記錄為120 s。將每天4次獲得的潛伏期求取平均值,所得數值即為大鼠當天的潛伏期。②空間探索實驗:讓大鼠從四個象限固定點入水,記錄大鼠平臺所在區域有效穿梭次數和停留時間,然后求取平均值。

1.3.3 海馬組織NOS含量和AchE活性測定:水迷宮空間探索實驗后, 1%戊巴比妥鈉麻醉49日齡大鼠后,迅速打開胸腔,暴露心臟,從右心室主動脈灌流PBS以去除腦組織中的血液,直至大鼠通體變白。冰盤上快速分離出海馬組織,稱重分裝后投入無RNA酶的1.5 ml EP管中,迅速放入液氮速凍和-80 ℃保存備用。加入預冷的0.9%氯化鈉溶液,用勻漿器按1∶9的比例制成10%組織勻漿,于4 ℃下3000 r/min離心10 min,提取上清液-20 ℃凍存待測。采用比色法檢測AchE活性和NOS含量。

1.3.4 海馬組織中凋亡蛋白水平檢測:取海馬組織約300 mg放入液氮預冷研缽中,加入含1%蛋白酶抑制劑RIPA裂解液2 ml,添加液氮并迅速研磨,此過程中不斷加入液氮以防止蛋白降解。將研磨液轉移至預冷離心管中,于冰盒中裂解20 min,4 ℃下12000 r/min離心30 min,吸取上清液后凍存于-80 ℃。收集蛋白上清于新的EP管中,加入上樣緩沖液,98 ℃變性10 min。BCA定量,電泳后轉移至PVDF膜,5%脫脂牛奶封閉1 h,孵育一抗,4 ℃過夜。TBST洗膜10 min×3次,室溫搖床孵育二抗1 h。TBST洗膜10 min×3次,化學發光顯色并使用Image J進行灰度值分析,計算Caspase-3和 Bcl-2蛋白相對表達量。

2 結 果

2.1 各組大鼠定位航行實驗潛伏期比較 見表1。第1天,各組大鼠尋找平臺的潛伏期比較差異無統計學意義(P>0.05) 。從第2天開始,B、C、D組潛伏期較A組明顯延長(均P<0.05)。在第3、4、5天,D組潛伏期較B組和C組明顯延長(均P<0.05)。

2.2 各組大鼠空間探索實驗穿越平臺次數和停留時間比較 見表2。在空間搜索實驗中,B、C、D組穿越平臺次數和停留時間與A組比較明顯減少(均P<0.05) 。D組與B、C組比較,穿越平臺次數和停留時間減少(均P<0.05)。

表2 各組大鼠空間探索實驗穿越平臺次數和停留時間比較

2.3 各組大鼠海馬組織NOS含量和AchE活性比較 見表3。B、C、D組大鼠海馬組織NOS含量低于A組,且C、D組低于B組,D組低于C組(均P<0.05)。B、C、D組大鼠海馬組織AChE活性高于A組,且C、D組高于B組,D組高于C組(均P<0.05)。

表3 各組大鼠海馬組織NOS含量和AchE活性比較

2.4 各組大鼠海馬組織Capase-3和Bcl-2蛋白表達比較 見圖1。B、C、D組大鼠海馬組織Capase-3蛋白高于A組,且C、D組高于B組,D組高于C組(均P<0.05)。C、D組大鼠海馬組織Bcl-2蛋白低于A、B組,且D組低于C組(均P<0.05)。

注:左圖為Capase-3和Bcl-2蛋白電泳圖。柱狀圖為各組大鼠海馬組織Capase-3和Bcl-2蛋白表達比較,與A組比較,*P<0.05;與B組比較,#P<0.05;與C組比較,&P<0.05圖1 各組大鼠海馬組織Capase-3和Bcl-2蛋白表達比較

3 討 論

認知是機體對獲取信息的加工過程,學習記憶是其重要的環節。七氟醚是一種臨床上兒科常用揮發性麻醉藥,吸入七氟醚對兒童遠期認知的影響目前研究尚無清晰的定論。幼兒時期吸入七氟醚對認知功能的影響可能是多方面的。本研究探索在幼兒期增加吸入七氟醚次數對幼鼠學習記憶的影響。Morris水迷宮實驗可以反映動物的認知功能、空間學習和記憶能力,也是常用的研究學習記憶的手段。Morris水迷宮實驗包括定位航行實驗和空間搜索實驗。定位航行實驗中的潛伏期反映大鼠學習成績,空間搜索實驗中大鼠穿越原平臺象限的次數反映大鼠的記憶保存能力。既往研究[6]發現,七氟醚可誘導幼年小鼠神經元凋亡,損傷其學習與記憶能力。晉菲菲等[7]研究發現,幼年動物在吸入性麻醉劑七氟醚中暴露時間越長,腦神經細胞死亡數越多,動物后來的學習記憶及行為發育越遲緩。

本實驗發現,幼鼠吸入七氟醚次數越多,幼鼠找到平臺的時間越長,吸入七氟醚的幼鼠找到平臺的潛伏期比對照組明顯延長,空間搜索實驗中吸入七氟醚的幼鼠穿越平臺次數減少,說明幼鼠吸入七氟醚次數越多,學習記憶能力越差。以往研究[8]發現,幼年小鼠連續3 d每天用七氟醚麻醉2 h,其空間記憶能力受損,Morris水迷宮實驗中學習記憶能力較差,本研究結果與之基本一致。

學習記憶的維持與腦神經突觸可塑性密切相關,而突觸可塑性與腦內神經遞質的變化有關。腦內遞質一氧化氮(NO)和乙酰膽堿(Ach)是進行及維持高級神經系統功能的重要介質。Ach水平與學習記憶的增強呈量效關系。研究[9]發現,七氟醚可導致基底前腦AchE的表達及酶活性下降,從而導致腦內Ach合成減少,最終導致幼鼠認知功能損害。學習記憶相關的長時程增強(LTP)的形成和建立離不開NO的參與。NOS是合成NO的關鍵酶,當NOS缺乏時NO生成不足,必將影響LTP的形成和突觸可塑性的建立,進而影響正常學習記憶行為。本研究發現,吸入七氟醚后大鼠腦內NOS含量降低,AchE活性增加。也有研究[10]認為,腦源性神經營養因子(BDNF)是大腦發育中影響突觸可塑性的主要分子介質,七氟醚能通過降低BDNF水平及其受體酪氨酸激酶B的磷酸化來抑制BDNF酪氨酸激酶B信號轉導,降低突觸密度,導致突觸超微結構發生改變,LTP減少,從而損害認知功能。SHEN等[11]研究發現,LTP減少還可能與突觸蛋白的異常表達有關,反復接觸七氟醚的大鼠海馬突觸后致密區G蛋白受體和谷氨酸受體1表達水平降低,導致突觸結構被破壞,LTP減少。

研究[12-16]發現,將幼齡動物重復多次或者長時間進行全麻藥物的暴露可以使大腦組織中凋亡蛋白 Bax-2和Caspase-3增加,使神經細胞中抗凋亡蛋白Bcl-2含量減少,從而促進神經細胞發生凋亡。PENG等[17]研究發現,暴露于七氟醚6 h會顯著增加Caspase-3和Bax蛋白的表達,從而抑制抗凋亡蛋白Bcl-2 表達,加速程序性細胞死亡。同樣,LEI等[18]將出生7 d的SD大鼠暴露于3%七氟醚6 h,發現幼鼠頂葉皮質Caspase-3蛋白表達增加,海馬DG區神經元祖細胞活性明顯降低,而水迷宮實驗發現七氟醚組潛伏期明顯長于對照組。研究[8]發現,幼鼠經七氟醚暴露后4周,學習和記憶出現障礙,海馬神經元干細胞凋亡數量增加。陳勇等[19]研究發現,大鼠吸入七氟醚濃度的增加會降低海馬去甲腎上腺素、5-羥色胺水平,增強對三磷酸腺苷受體P2X3表達的抑制作用,增加海馬區細胞凋亡,降低大鼠記憶行為能力。張晚來等[20]研究發現,七氟醚可以通過miR-21-5p/RTN4軸促進大鼠神經干細胞凋亡和抑制其增殖。本研究結果顯示,D組Caspase-3蛋白高于A組,Bcl-2蛋白低于A組,說明幼鼠吸入七氟醚次數越多,海馬中神經元凋亡越多,神經損傷越大。

為減輕七氟醚對神經元凋亡的影響,大多研究主要集中于聯合用藥。唐心愿[21]在探討七氟醚麻醉對小鼠神經元的興奮性作用及其對神經元凋亡的影響時發現,右美托咪定可以增強七氟醚的麻醉鎮靜效果,降低小鼠活動性,降低神經元蛋白C-Fos表達,減少細胞凋亡,減少小鼠腦皮質內磷酸化Tau蛋白含量。高榮等[22]研究認為,孕酮對孕中期吸入七氟醚致子鼠神經損傷的改善作用可能與其抑制小膠質細胞和星形膠質細胞活化介導的海馬細胞凋亡率上升和突觸相關蛋白表達水平下降有關。李珍等[23]研究發現,miR-124可以使海馬組織中BDNF、PI3K、AKT2蛋白表達升高,減少海馬神經元細胞凋亡。熊璐等[24]研究發現,神經生長因子(NGF)可減輕七氟醚誘導的基底前腦膽堿能系統退變及認知障礙。張力召等[25]研究發現,嬰幼兒磁共振成像檢查時七氟醚吸入麻醉聯合右美托咪定滴鼻可增強鎮靜效果,安全性更高。

綜上所述,吸入七氟醚次數增加會損傷新生幼鼠的學習記憶能力,臨床上應盡量減少七氟醚的使用次數,并聯合其他措施盡可能降低七氟醚對學習記憶能力的影響。