姜黃醇對大鼠抑郁的改善作用及機制實驗研究

李 玥,陳俊逾

(新疆醫科大學第四臨床醫學院神志科,新疆 烏魯木齊 830099)

抑郁癥是自殺率較高的疾病,發病率逐年上升,男女比例高達1.7∶1[1]。目前,治療抑郁癥的藥物根據不同作用機制分為選擇性5-羥色胺重攝取抑制劑(Selective serotonin reuptake inhibitor,SSRI)、5-羥色胺/去甲腎上腺素再攝取抑制劑(Serotonin-norepinephrine reuptake inhibitor,SNRI)和三環類抗抑郁藥(Tricyclic antidepressant,TCA)等,以上藥物均是基于抑郁癥單胺類遞質紊亂假說,主要作用于抑郁患者腦內單胺類神經遞質系統[2]。然而,多數藥物在治療過程中具有起效慢、效率低以及不良反應大等特點[3]。因此,需進一步探究抑郁癥的病因及發病機制,為研制出起效快、特異性高且不良反應小的藥物提供理論依據。鐵死亡是程序性細胞死亡過程,與鐵代謝紊亂密切相關[4]。已有研究[5]證實,鐵死亡可能成為研究抑郁機制和抗抑郁藥物的新靶點。在鐵死亡過程中核受體共激活因子4(Nuclear receptor coactivator 4,NCOA4)起到關鍵作用,其下調可以抑制鐵死亡誘導劑Erastin誘導的鐵積累和脂質過氧化,以及隨后鐵死亡的發生[6]。姜黃醇又稱莪術醇,是傳統中藥莪術、溫郁金的有效活性成分,是一種具有生物活性的小分子倍半萜化合物[7]。研究[8]發現,姜黃醇通過調控NCOA4抑制鐵蛋白吞噬,進而抑制非酒精性脂肪肝小鼠肝細胞衰老。研究[9]發現,溫郁金對抑郁癥的治療起到積極作用。因此,本研究探究姜黃醇是否可以通過調控NCOA4介導的自噬調控鐵死亡,進而起到抗抑郁的效果。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠90只,7周齡,體重220～235 g,購自浙江維通利華實驗動物技術有限公司,動物許可證號:SCXK(浙)2021-0006。飼養條件為溫度(25±1)℃,濕度(65±5)%,光照-黑暗循環12 h。本研究經本院動物倫理委員會批準。

1.2 主要試劑 姜黃醇(批號:HY-N0104)購自美國MCE公司;鐵死亡誘導劑Erastin(批號:S80804)購自上海源葉生物有限公司;NCOA4、微管相關蛋白輕鏈3-Ⅰ(LC3-Ⅰ)、LC3-Ⅱ、谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)、環氧合酶2(COX2)、長鏈脂酰輔酶A合成酶4(ACSL4)、環加氧酶2(PTGS2)抗體(批號:ab86707、ab245089、ab192890、ab125066、ab179800、ab155282、ab283574)購自Abcam公司;鐵含量測定試劑盒(批號:K390-100)購自武漢艾美捷科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型構建:采用Erastin誘導大鼠急性抑郁模型。用99.9%異氟醚麻醉大鼠后,將頭部放置在立體定位裝置中,顱骨暴露在外。在左、右半球分別鉆出小孔,以便給藥。插入一根26規格不銹鋼針(坐標:顱骨下3.5 mm,前囟后4.8 mm,中縫左、右2.5 mm)并連接Hamilton注射器。注射2.5 μl濃度為200 ng/μl的Erastin,將針頭放置5 min,使藥物擴散。另一半球重復上述操作。

1.3.2 分組及處理:根據隨機數字表法將大鼠分為假手術組、Erastin組、姜黃醇組、姜黃醇+pcDNA-NC組、姜黃醇+pcDNA-NCOA4組,每組18只。假手術組在模型構建時只放置針頭,不注射藥物。姜黃醇組腹腔注射姜黃醇10 mg/kg,每天1次,連續2周[10]。姜黃醇+pcDNA-NC組在腹腔注射10 mg/kg姜黃醇的基礎上通過尾靜脈注射pcDNA-NC,每周2次,注射2周,共4次。姜黃醇+pcDNA-NCOA4組在腹腔注射10 mg/kg姜黃醇的基礎上尾靜脈注射pcDNA-NCOA4,每周2次,注射2周,共4次。假手術組和Erastin組分別給予等量0.9%氯化鈉溶液腹腔注射(每天1次,連續2周)和尾靜脈注射(每周2次,注射2周,共4次)。

1.3.3 動物行為學評價

1.3.3.1 糖水偏好實驗(SPT):實驗前剝奪大鼠食物和水24 h。將每只大鼠單獨放在籠子里,分別放置一瓶水和一瓶1%蔗糖溶液。讓其自由飲水12 h,記錄蔗糖溶液和水的消耗量。蔗糖水偏好(%)=糖水消耗量/(糖水消耗量+純水消耗量)×100%。

1.3.3.2 曠場實驗(OFT):使用ANYmaze軟件中開放野外功能對大鼠進行監測。在軟件中,立方體開箱長度和寬度均50 cm,平均分為25個正方形,中間9個為中心區域,大鼠為監測點。將每只大鼠放入盒子后,記錄中心區域移動距離、靜止時間和5 min內交叉次數。每只老鼠完成測試后,用75%乙醇噴灑箱子并擦拭,避免氣味干擾。

1.3.3.3 懸尾實驗(TST):固定大鼠尾部使其頭部朝下,頭部距地面50 cm,記錄大鼠4 min內的靜止時間。

1.3.3.4 強迫游泳實驗(FST):實驗前給予5 d適應性訓練。訓練結束24 h后將大鼠放入高40 cm、直徑28 cm、水深30 cm的玻璃容器中,水溫25 ℃左右?？傆斡緯r間為6 min,記錄最后4 min大鼠的靜止時間。

1.3.4 線粒體形態觀察:每組取6只大鼠,麻醉并處死,將大鼠海馬組織(1 mm×1 mm×1 mm)用2.5%戊二醛在4 ℃下固定過夜。用磷酸緩沖液沖洗3次,經梯度乙醇脫水,然后包埋、切片,切片厚度為60～80 nm,通過透射電子顯微鏡觀察線粒體形態。

1.3.5 鐵含量測定:每組取6只大鼠,麻醉并處死,采用微波消化法對海馬組織樣品進行預處理,然后通過鐵含量測定試劑盒測定鐵含量。采用Multiskan GO檢測系統在波長593 nm處檢測平均光密度,根據標準曲線計算總鐵和亞鐵含量。

1.3.6 自噬以及鐵死亡相關蛋白檢測:將各組剩余6只大鼠海馬組織加入RIPA蛋白裂解液提取總蛋白,通過BCA法檢測蛋白質濃度。各組取20 μg總蛋白質,蛋白質樣品經SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后,轉移到PVDF膜上,用5%脫脂牛奶封閉膜2 h。加入自噬蛋白(NCOA4、LC3)、鐵死亡相關蛋白(GPX4、COX2、ACSL4、PTGS2)抗體在4 ℃孵育過夜,加入二抗室溫孵育2 h。加入ECL試劑顯色,采用Image J軟件分析目標蛋白的灰度值。

2 結 果

2.1 各組大鼠行為學指標比較 見表1。與假手術組比較,Erastin組大鼠蔗糖水偏好、OFT中心區移動距離、OFT交叉次數降低,FST靜止時間、TST靜止時間、OFT靜止時間升高(均P<0.05)。與Erastin組比較,姜黃醇組蔗糖水偏好、OFT中心區移動距離、OFT交叉次數升高,FST靜止時間、TST靜止時間、OFT靜止時間降低(均P<0.05)。與姜黃醇組、姜黃醇+pcDNA-NC組比較,姜黃醇+pcDNA-NCOA4組蔗糖水偏好、OFT中心區移動距離、OFT交叉次數降低,FST靜止時間、TST靜止時間、OFT靜止時間升高(均P<0.05)。

表1 各組大鼠行為學指標比較

2.2 各組大鼠海馬組織線粒體形態比較 見圖1。假手術組海馬組織線粒體結構正常。與假手術組比較,Erastin組線粒體腫脹,線粒體嵴丟失。與Erastin組比較,姜黃醇組線粒體腫脹、線粒體嵴丟失現象改善,線粒體結構與假手術組相似;姜黃醇+pcDNA-NCOA4組與Erastin組海馬組織線粒體損傷現象相似。

圖1 各組大鼠海馬組織透射電鏡下線粒體形態(×15000)

2.3 各組大鼠海馬組織總鐵和亞鐵含量比較 見表2。Erastin組大鼠總鐵及亞鐵含量較假手術組升高(均P<0.05)。姜黃醇組總鐵及亞鐵含量較Erastin 組降低(均P<0.05)。姜黃醇+pcDNA-NCOA4組總鐵及亞鐵含量較姜黃醇組、姜黃醇+pcDNA-NC組升高(均P<0.05)。

表2 各組大鼠海馬組織總鐵和亞鐵含量比較(μg/mg)

2.4 各組大鼠海馬組織自噬蛋白及鐵死亡相關蛋白表達水平比較 見表3。與假手術組比較,Erastin 組NCOA4、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、COX2、ACSL4、PTGS2蛋白表達水平升高,GPX4蛋白表達水平降低(均P<0.05)。與Erastin組比較,姜黃醇組GPX4蛋白表達水平升高,NCOA4、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、COX2、ACSL4、PTGS2蛋白表達水平降低(均P<0.05)。與姜黃醇組、姜黃醇+pcDNA-NC組比較,姜黃醇+pcDNA-NCOA4組NCOA4、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、COX2、ACSL4、PTGS2蛋白表達水平升高,GPX4蛋白表達水平降低(均P<0.05)。

表3 各組大鼠海馬組織自噬蛋白及鐵死亡相關蛋白表達水平比較

3 討 論

抑郁癥是一種常見的慢性精神障礙性疾病,影響著全球超過3.5億人[11-13]。2008年,世界衛生組織將抑郁癥列為全球疾病負擔的第三大因素[1]。到目前為止,相當多的抑郁癥患者對一線抗抑郁治療反應不佳,或出現不良反應,導致治療中斷或復發[14-15]。因此,需要尋找新的藥物來提高療效。

姜黃醇是一種天然化合物,大量研究[16-17]發現姜黃醇具有抗炎、抗氧化等藥理作用,在癌癥等多種疾病中發揮積極效果。姜黃醇可通過抑制神經元興奮性來抑制癲癇的疾病進展,抑郁癥和癲癇同屬于神經系統性疾病,故姜黃醇可能成為治療抑郁癥的潛在藥物[18]。本文的創新點在于首次探究了姜黃醇對抑郁癥的改善作用和具體作用機制。本研究發現,抑郁癥大鼠蔗糖水偏好、中心區移動距離、交叉次數顯著下降,FST靜止時間、TST靜止時間、OFT靜止時間顯著升高,提示Erastin誘導抑郁癥大鼠造模成功,而經姜黃醇處理后,大鼠蔗糖水偏好、中心區移動距離、交叉次數顯著升高,FST靜止時間、TST靜止時間、OFT靜止時間顯著下降,提示姜黃醇對大鼠抑郁癥起到改善作用。

鐵自噬是一種新型的自噬,鐵蛋白通過自噬溶酶體途徑降解釋放鐵到細胞質中,在調節鐵穩態中發揮重要作用[19]。越來越多的證據表明,鐵自噬參與了神經系統疾病的發病機制,包括阿爾茨海默病、帕金森病和抑郁癥[20]。NCOA4是一種普遍表達的細胞內蛋白,介導鐵蛋白(細胞鐵儲存復合物)的自噬降解,對于維持全身鐵平衡至關重要[21]。據報道,敲低NCOA4基因降低了鐵蛋白的降解,同時導致了鐵代謝紊亂。本研究通過檢測自噬標志因子發現,姜黃醇處理后抑郁癥大鼠NCOA4、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達水平、總鐵及亞鐵含量顯著降低,提示姜黃醇可能通過抑制NCOA4介導的鐵自噬對大鼠抑郁癥起到改善作用。

有研究[22]報道,自噬通過鐵蛋白和轉鐵蛋白受體調節細胞內鐵水平和鐵死亡。鐵死亡是一種依賴于鐵離子的非凋亡程序性細胞死亡模式。NCOA4使細胞內的鐵蛋白轉移至自噬溶酶體中并釋放游離鐵,在多種鐵依賴的生理過程中發揮作用。當鐵自噬過度激活時,細胞內的鐵過量沉積,誘導谷胱甘肽耗盡和GPX4表達降低,進而導致細胞膜結構破裂,最終引起細胞鐵死亡[23]。鐵死亡的發生與PTGS2的增加有關。PTGS2編碼的COX2基因在鐵死亡誘導劑的作用下顯著表達[24-25]。GPX4是一種硒蛋白,用于修復哺乳動物脂質細胞的氧化損傷,可以通過抑制鐵依賴性脂質過氧化防止鐵死亡的發展。增加GPX4蛋白水平,降低COX2、ACSL4、PTGS2蛋白水平可以抑制鐵死亡,改善暴露于氧葡萄糖剝奪/復氧的神經元損傷[26]。JIAO等[5]發現,抑郁癥大鼠COX2、ACSL4、PTGS2蛋白水平顯著升高,而GPX4蛋白水平顯著下降,與本研究結果一致。本研究發現姜黃醇處理后線粒體腫脹,線粒體嵴丟失現象改善,COX2、ACSL4、PTGS2蛋白水平顯著降低,GPX4蛋白水平顯著升高,提示姜黃醇可能通過抑制NCOA4介導的鐵自噬進而抑制鐵死亡,對大鼠抑郁癥起到改善作用。有研究[27]發現,姜黃醇通過促進NCOA4介導的鐵自噬誘導鐵死亡,進而起到抗纖維化的作用,與本文的結果相反,這可能是由于疾病類型不同導致的。為進一步證實,本研究過表達NCOA4后結果顯示,NCOA4消除了姜黃醇對抑郁癥大鼠的有利影響。

綜上所述,姜黃醇可能通過抑制NCOA4介導的鐵自噬抑制鐵死亡,對抑郁癥起到治療效果。