灰氈毛忍冬bZIP25基因的克隆及其表達模式分析

王珊，曾娟，謝瑜，周日寶，劉湘丹，童巧珍，龍雨青，陳言，劉小麗*（.湖南中醫藥大學第二附屬醫院，長沙 4000；2.湖南中醫藥大學藥學院，長沙 40208；3.湘產大宗道地藥材種質資源及規范化種植重點研究室，長沙 40208；4.湖南省普通高等學校中藥現代化研究重點實驗室，長沙 40208；.焦作市產品質量檢驗檢測中心，河南 焦作 44000）

灰氈毛忍冬LoniceramacranthoidesHand.-Mazz.是中藥材山銀花的主要來源，具有清熱解毒，疏散風熱的功效[1]，是治療內癰、外癰之要藥。隨著生物技術的快速發展，灰氈毛忍冬分子水平的相關研究也越來越多。其中對灰氈毛忍冬的基因研究多集中在參與其活性成分綠原酸生物合成[2-4]、黃酮類化合物合成[5-6]、植物激素乙烯合成[7-8]以及其花冠特殊表型等方面[9-11]，而關于其轉錄因子的相關研究報道則很少。

bZIP（basic leucine zipper）轉錄因子是植物中非常重要且常見的一類生物蛋白，由高度保守的堿性區和相對保守的亮氨酸拉鏈區組成。bZIP 轉錄因子通過與靶基因的啟動子區域結合，激活或抑制其轉錄，從而調控基因的表達，參與植物各種生物學過程，在植物的生長發育、次生代謝產物合成以及抵御逆境脅迫等方面都發揮著不可替代的作用[12-13]，如 bZIP 轉錄因子可以加速馬鈴薯生殖塊莖的生長和衰老[14]。蘋果MdbZIP44通過增加MdMYB1與下游靶基因啟動子的結合，促進了脫落酸誘導的花青素生物合成[15]。陸地棉GhVIP1過表達后，提高種子發芽率和改善根系發育，使其耐旱性增強[16]。有研究對金銀花五個花期的轉錄因子表達量進行差異分析，發現 49 個 bZIP 轉錄因子的表達量存在明顯差異，提示其可能參與金銀花的發育[17]。

本研究利用課題組前期研究獲得的灰氈毛忍冬轉錄組測序數據，篩選出在花不同發育階段具有顯著表達差異的bZIP25（log2Fold Change：2.12，P＜0.05），對其進行克隆及生信分析，并對其在不同器官、不同開花階段的表達量進行研究分析，為后續深入探索灰氈毛忍冬bZIP25在花發育方面的功能研究奠定基礎。

1 材料

1.1 藥材

灰氈毛忍冬花、葉及莖在湖南隆回采摘，經湖南中醫藥大學周日寶教授鑒定為灰氈毛忍冬的花、葉及莖，將采集的花樣品按不同花期分成七個階段（f1～f7）[5]。將樣品于封口袋中密封，裝入液氮罐中，帶回實驗室于－80℃冰箱保存。

1.2 試藥

多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（杭州博日科技有限公司）；RevertAid First Strand cDNA synthesis試劑盒（美國Thermo Fisher公司）；快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、TS-GelRed Ver.2 1000 x in Water、Trelief 5α感受態細胞（北京擎科新業生物技術有限公司）；SMARTer RACE 5'/3'試劑盒（日本Takara公司）；pEASY-Blunt Cloning試劑盒、pEASY-T1 Cloning試劑盒、TranStart Green qPCR SuperMix UDG（北京全式金生物科技有限公司）；2×Taq Master Mix（Dye）（康為世紀科技有限公司）。所用引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列如表1所示，濃度為10 μmol·L－1。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequence

2 方法與結果

2.1 bZIP25基因克隆

2.1.1bZIP25基因核心片段擴增 取適量灰氈毛忍冬花蕾，根據多糖多酚植物總 RNA 提取試劑盒的方法提取灰氈毛忍冬總 RNA，瓊脂糖凝膠電泳和核酸蛋白分析儀檢測合格后，參照 RevertAid First Strand cDNA synthesis試劑盒的步驟，用提取得到的RNA 逆轉錄合成灰氈毛忍冬 cDNA。根據前期的轉錄組測序結果，篩選出標注為 bZIP 的序列，設計引物bZIP25-S 和bZIP25-A（見表1），以上述步驟得到的cDNA為模板進行PCR擴增。PCR 體系共25 μL，其中cDNA 1 μL，2×Taq Master Mix（Dye）12.5 μL，bZIP25-S 和bZIP25-A 各 1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR 擴增條件為 94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃30 s，72℃，90 s，40 個循環；72℃ 10 min。PCR產物用瓊脂糖凝膠進行電泳分離，凝膠回收試劑盒回收目的條帶，與 pEASY-T1 克隆載體連接，轉化至感受態細胞后，涂抹于 LB 固體培養基進行藍白斑篩選，挑取出白斑進行菌落 PCR，得到約 300 bp的目的條帶（見圖 1A），送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，明確核心片段序列長為 286 bp。

2.1.2bZIP25基因RACE擴增 根據上述測序結果，設計 RACE 引物bZIP25-5'和bZIP25-3'（見表1）。參照 RACE試劑盒的步驟分別獲得bZIP25的 5'和 3'RACE-Ready cDNA。PCR體系包括5' 或 3' RACEReady cDNA 2.5 μL，Seq Amp DNA Polymerase 1 μL，bZIP25-5'或bZIP25-3'引物 1 μL，10×UPM 5 μL，PCR-Grade H2O補足 50 μL，以及 2×Seq Amp Buffer 25 μL。PCR 擴增條件為 94℃ 30 s，72℃ 2 min，5 個循環；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 2 min，5 個循環；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 2 min，40 個循環?；厥?、連接、克隆與測序等步驟同“2.1.1”項下，其中所用載體為 pEASY-Blunt 克隆載體。5'-端和3'-端RACE擴增結果顯示，分別在400 bp 和600 bp 左右有一明亮條帶（見圖 1B 和 1C）。

2.1.3bZIP25基因cDNA全長獲得及驗證 應用序列拼接軟件對 5'-端和 3'-端進行拼接，獲得灰氈毛忍冬bZIP25基因cDNA序列全長。根據全長序列設計驗證引物Y-bZIP25-F和Y-bZIP25-R（見表1），以“2.1.1”項下所得cDNA為模板進行全長驗證。PCR體系共包括cDNA 1 μL，Y-bZIP25-F和Y-bZIP25-R各 1 μL，2×Pfu Master Mix（Dye）12.5 μL，以及ddH2O 補足 25 μL。PCR 擴增條件為 94℃ 5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 90 s，40 個循環；72℃10 min?；厥?、連接、克隆與測序等步驟同“2.1.1”項下，其中所用載體為 pEASY-Blunt克隆載體。將5'-端、3'-端及核心片段序列的測序結果用 Conting Express 軟件拼接后，得到bZIP25基因cDNA全長序列共 892 bp。驗證 cDNA全長，發現在 900 bp 左右一明顯亮帶（見圖1D），經過回收、連接、克隆及測序，證實測序結果與拼接全長序列一致。

圖1 bZIP25 基因PCR產物Fig 1 PCR product of bZIP25 gene

2.2 bZIP25 基因生物信息學分析

對灰氈毛忍冬bZIP25進行生物信息學分析所用的在線軟件及具體網址見表2。

表2 生物信息學分析方法Tab 2 Bioinformatics analysis method

2.2.1 LmbZIP25 蛋白理化性質分析 灰氈毛忍冬bZIP25基因全長為892 bp，包含的ORF 區長度為576 bp，編碼191個氨基酸，命名為LmbZIP25，其GenBank 登錄號為：OR551766。

LmbZIP25蛋白分子式為C966H1525N305O295S7，相對分子質量為 22.35 kDa，理論等電點為 9.99。LmbZIP25蛋白的 191個氨基酸殘基中，精氨酸（Arg）和絲氨酸（Ser）含量最高，為11.5%；絡氨酸（Tyr）含量最低，僅 0.5%。LmbZIP25 蛋白不穩定系數為 72.09，大于閾值 40，屬于不穩定蛋白。LmbZIP25 蛋白的脂溶系數為 63.25，總平均疏水指數（GRAVY）為 －1.007，為親水性蛋白。通過 ProtScale 軟件分析，該蛋白親水/疏水氨基酸分布負值明顯大于正值，提示親水區占比遠大于疏水區，與ProtParam 預測的結果一致。

經 WOLF PSORT 在線分析，該蛋白定位于細胞核中。利用 TMHMM 2.0 在線分析，其編碼的氨基酸均在膜外，不具跨膜區域。通過 Signal P 4.1 Server 軟件可知該蛋白無信號肽序列，為非分泌蛋白。NetPhos 3.1 在線軟件分析提示，LmbZIP25中共有 28 個潛在磷酸化位點，其中有 22 個 Ser磷酸化位點、5 個 Thr 磷酸化位點及 1 個 Tyr 磷酸化位點。

2.2.2 bZIP25 蛋白結構分析 通過 CD-Search 在線分析，發現灰氈毛忍冬 bZIP25 蛋白在第 81～132 位氨基酸殘基上含有 bZIP_plant_GBF1 保守結構域（見圖2），提示其屬于 bZIP 家族，與家族中其他成員具有相同或相似的功能。

圖2 LmbZIP25 蛋白結構域分析Fig 2 Domain prediction of LmbZIP25 proteins

SOPMA在線預測LmbZIP25 蛋白二級結構。α螺旋為其主要結構組成元件，占46.07%；其次為無規則卷曲，占41.88%。通過SWISS-MODEL對LmbZIP25 蛋白進行同源建模，發現其與阿拉伯咖啡的bZIP蛋白在三級結構水平的相似度為53%，三級結構的覆蓋率達 99%，且以α螺旋和無規則卷曲為主，與二級結構預測結果相符，結果見圖 3。

圖3 LmbZIP25 蛋白三級結構預測Fig 3 Prediction of tertiary structure of LmbZIP25 proteins

2.2.3 氨基酸序列同源性比對、進化分析和基序分析 將LmbZIP25 編碼的氨基酸序列與 NCBI-Blast中的植物蛋白數據庫進行搜索比對，發現與可可Theobromacacao、哥倫比亞錦葵Herraniaumbratica、小蓬草Erigeroncanadensis、萵苣Lactucasativa、狹葉油茶Camellialanceoleosa和甜橙Citrussinensis等的同源性較高，下載上述植物的氨基酸序列，使用 DNAMAN 軟件進行多序列比對，結果見圖4。這些植物中均包含有符合 bZIP 轉錄因子的“N-X7-R-X9-L-X6-L-X6-L”特征結構，且堿性區的同源性非常高，亮氨酸拉鏈區相對稍低。

圖4 LmbZIP25 與其他植物bZIP 蛋白的多序列比對Fig 4 Multiple sequence alignment of LmbZIP25 with bZIP proteins of other plants

將在 NCBI-Blast 上下載的部分植物bZIP基因家族氨基酸序列，利用 MEGA 11.0 軟件構建系統進化樹。由圖 5A 可知，進化樹分為三支，灰氈毛忍冬LmbZIP25與芝麻SibZIP4、木犀欖OebZIP4、旋蒴苣苔DhbZIP5、小蓬草EcbZIP4、刺苞菜薊CcbZIP4、萵苣LsbZIP4和除蟲菊TcbZIP4聚為一支，說明與這些植物的親緣關系較近。茄科的3種植物，漸狹葉煙草NabZIP11、馬鈴薯StbZIP63和辣椒CabZIP11聚為一支，其余植物為另一支。

對參與分析植物的蛋白序列進行保守基序分析（見圖 5B），結果發現所有序列均具有 Motif 1、Motif 3、Motif 4 及 Motif 6 等4個保守基序，而不同進化分支 bZIP 的基序組成有較明顯的種屬特性，如第一大類均不含 Motif 8，第二大類的3個茄科植物NabZIP11、CabZIP11和StbZIP63均無 Motif 7，但具有 Motif 9。另外，同一種屬的植物保守基序也呈現出個體差異，如第三大類中的菊科植物EcbZIP4無Motif 8，同為菊科的CcbZIP4則無 Motif 5 和 Motif 7。

圖5 LmbZIP25 蛋白的系統進化樹（A）和基序（B）Fig 5 Phylogenetic tree（A）and motif（B）of LmbZIP25 proteins

2.3 bZIP25 基因的表達分析

基于bZIP25基因的全長序列，設計實時熒光定量PCR的引物Q-bZIP25-F和Q-bZIP25-R（見表2）。提取灰氈毛忍冬七個花期的花及莖、葉的總 RNA，定量后逆轉錄成 cDNA。將18SrRNA基因作為內參，設計引物18S-F、18S-R（見表 2）進行 qRT-PCR。反應體系包括 2×TransStart Green qPCR SuperMix UDG 10 μL，上、下游引物各 0.4 μL，cDNA 1 μL，ddH2O補足 20 μL。擴增條件為 50℃ 2 min，94℃ 10 min；94℃ 5 s，55℃ 15 s，72℃ 10s，40 個循環。重復 3次，進行熔解曲線分析，運用2－ΔΔCt法計算相對表達量，結果見圖6。不同花期中，LmbZIP25在黃色花蕾期的相對表達量最高，顯著高于其他花期；不同器官中，以花期黃色花蕾期為參照，LmbZIP25相對表達量在莖中最高，其次為花期黃色花蕾期，而在葉中最低。其中，在莖中的相對表達量為葉的20.67倍，為黃色花蕾期的2.07倍。

圖6 LmbZIP25 基因相對表達量Fig 6 Relative expression level of LmbZIP25 gene

3 討論

bZIP 家族作為最大的轉錄因子家族之一，具有多種生物學功能，廣泛地參與到植物的生命活動中。本研究為探索其在灰氈毛忍冬花器官發育中的功能克隆了bZIP25基因序列全長，開放閱讀框（ORF）為 576 bp，編碼 191個氨基酸，預測其為不穩定親水蛋白，無跨膜結構，為非分泌蛋白。研究顯示，bZIP 主要定位于細胞核中[18]，LmbZIP25 蛋白分析結果與之相符。結構域分析其含有 bZIP_plant_GBF1 保守結構域，推測其屬于 GBF1 類 bZIP 轉錄因子，與蓖麻[19]、橡膠草[20]和野菊[21]等 bZIP 編碼的結構域一致。同源性比對結果表明，同源性較高的區域主要位于保守結構域上。與灰氈毛忍冬LmbZIP25進化關系較近的芝麻、木犀欖、旋蒴苣苔、萵苣和除蟲菊等的 bZIP 蛋白在基序組成上高度保守，均含有Motif 1～Motif 8。

灰氈毛忍冬的入藥部位為花蕾或帶初開的花，為研究bZIP25在灰氈毛忍冬開花進程中的表達量差異，課題組將整個花期細分為七個階段。qRTPCR 結果顯示，LmbZIP25在灰氈毛忍冬七個花期、莖和葉中均有表達，表達量為莖＞黃色花蕾期＞葉，但表達量存在時空差異與組織特異性。bZIP 家族在不同的物種中具有不同的組織表達模式。如金銀花LjbZIP1表達量在葉中高于成熟花中[22]。牡丹PobZIP1在莖和葉中的表達量基本持平，在花芽中表達量最少[23]。紅花CtbZIP47在莖中的表達量高于花中，在葉中則最低[24]。

LmbZIP25在灰氈毛忍冬不同花期的表達水平整體呈先升后降的趨勢，其中黃色花蕾期的LmbZIP25表達量顯著高于其他花期。黃色花蕾期是灰氈毛忍冬開花前的最后階段，此時的LmbZIP25表達量突增，提示其很可能促進灰氈毛忍冬花的開放。在其他植物中，也發現不少此類現象。如大豆GmbZIP33在擬南芥中過表達后，轉基因擬南芥出現早花，并使FT等開花基因的表達量升高[25]。bZIP 轉錄因子GmFDL19能與開花基因GmFT2a和GmFT5a相互作用，GmFDL19在大豆中過表達時，能上調開花基因的轉錄水平，導致大豆出現早花[26]。水稻OsbZIP62不僅能夠調控水稻的成花轉變，還參與調控分枝、幼穗、花分生組織以及花器官的發育[27]。后續可通過獲得LmbZIP25基因的過表達植株或功能缺失突變株，為深入研究其對灰氈毛忍冬開花的調控機制及驗證其生物學功能提供參考。