基于5-LOX/LTB4信號通路探討黃芩苷/梔子苷對PM2.5暴露致血管內皮功能障礙的干預作用及其機制

孫欠欠，張行行，趙麓，趙安東，史永恒，王川，劉繼平，王斌*（1.陜西中醫藥大學藥學院，陜西 咸陽 712046；2.中醫藥腦健康產業陜西省高校工程研究中心，陜西 咸陽 712046；3.陜西省中醫藥管理局中藥藥效機制與物質基礎重點研究室，陜西 咸陽 712046）

大氣PM2.5可經呼吸直達肺泡，沉積于肺泡表面；其可溶性組分或PM0.1還可透過肺泡壁的生理屏障進入循環系統，隨血流而作用于全身的靶器官[1-2]。據大量流行病學及《中國心血管病報告2018》最新研究數據顯示，大氣PM2.5污染是引起我國居民心血管疾病發病率和死亡率持續增加的重要風險因素[3-5]。內皮細胞損傷是導致許多心血管疾病的起始環節和重要指標[6]，而進入血液循環系統的PM2.5顆?？赏ㄟ^多種途徑損傷血管內皮細胞，薛盼盼等[7]將PM2.5與人臍靜脈內皮細胞共培養后發現，PM2.5可誘導內質網應激并致其鐵死亡；張一凡等[8]研究發現，PM2.5可觸發氧化應激和炎癥反應，并激活P38MAPK信號通路促進內皮細胞損傷和凋亡。

課題組前期研究發現，PM2.5暴露可活化心肌組織NLRP3炎性小體，促進炎性反應和心肌細胞凋亡[9]，可以通過調節MAPK通路、AMPK通路、NF-κB通路與Sirt1通路，影響內皮舒張因子一氧化氮（NO）以及活性氧（ROS）的釋放，引發血管內皮損傷[10-11]。課題組一直致力于黃芩苷（baicalin，BC）、梔子苷（geniposide，GD）抗腦血管損傷藥效及機制研究，黃芩苷、梔子苷以最佳比例7∶3配伍，在30、60 mg·kg－1劑量應用時可有效抑制5-LOX/CysLTs/CysLTsR通路表達[12]、抗炎[13]、降低興奮性氨基酸毒性[14]、調節小膠質細胞極化狀態[15]等。課題組最新的研究表明，黃芩苷、梔子苷配伍可呈部分內皮依賴性地舒張由U46619預收縮的腦基底血管，其機制可能與調節NO表達有關；可通過調節HIF-1α/eNOS信號通路表達，保護由缺血缺氧誘導損傷的血管內皮損傷。因此，本實驗擬通過離體血管環實驗和在體動物實驗探討黃芩苷聯合梔子苷在30（低）、60 mg·kg－1（高）劑量對改善PM2.5誘導的血管內皮功能障礙作用及其機制。

1 材料

1.1 動物

SPF級SD大鼠32只，雄性，（220±20）g [成都達碩實驗動物有限公司，動物許可證編號：SCXK（川）2020-030]。飼養于陜西中醫藥大學中藥藥理實驗動物房內，溫度 23～25℃，相對濕度 45%～55%，自由攝食與飲水，晝夜各半，適應性飼養1周。實驗過程中對動物的處置符合3R原則，本實驗通過動物實驗倫理審查（倫理批件號：SUCMDL20220301001）。

1.2 試藥

一氧化氮合酶抑制劑（L-NAME）、環氧合酶抑制劑（INDO）、乙酰膽堿（ACh）、5-羥色胺（5-HT）、硝普鈉二水合物（SNP，批號分別為67791、84227、133975、HY-B1473、HY-A0119，MCE公司）；黃芩苷（批號：B20570，含量≥98%）、梔子苷（批號：B21661，含量≥98%）（上海源葉生物科技有限公司）；內皮型一氧化氮合酶（eNOS）抗體（批號：ab215717，Abcam公司）；誘導型一氧化氮合酶（iNOS）抗體（批號：BS-0162R，北京博奧森生物技術有限公司）；5-LOX抗體（批號：GB111330-100，武漢賽維爾生物科技有限公司）；白細胞介素1β（IL-1β）、白細胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA試劑盒（批號：0047R2、0190R2、0180R2，江蘇酶免實業有限公司）；轉化生長因子β1（TGF-β1）ELISA試劑盒（批號：EK0514，武漢博士德生物科技有限公司）；白三烯B4（LTB4）ELISA試劑盒（批號：U96-3681E，YOBIBIO）。

1.3 儀器

DMT 630M 離體微血管張力測定系統（丹麥DMT 公司）；Powerlab 生物信號采集處理系統（澳大利亞 ADI 公司）；TH-1000CⅡ智能大流量空氣顆粒采樣器（武漢市天虹有限責任公司）；電泳儀、轉膜儀及化學發光系統（美國 Bio-rad 公司）；Scientz-10N型真空冷凍干燥機（寧波新藝生物科技股份有限公司）。

2 方法

2.1 血管肌張力測定

腹腔注射1%戊巴比妥鈉（50 mg·kg－1）麻醉大鼠后，腹主動脈采血處死，剝離腸系膜組織，浸于預冷的Na＋-PSS溶液中，顯微鏡下分離腸系膜動脈，切成4段，每段2～3 mm，穿入 2 根40 μm 的金屬絲，迅速移至盛有37℃、氧飽和的Na＋-PSS溶液的浴槽中，利用兩端金屬絲固定血管環，平衡 30 min 后，分3次施加1 mN 的預張力，每次間隔10 min；更換5 mL 60 mmol·L－1K＋-PSS 收縮血管，重復兩次，當兩次刺激收縮力均大于5 mN，且無明顯差異時，可用于后續實驗[16]。即分別測定BC/GD對正?；A狀態，5-HT預收縮，以及一氧化氮合酶抑制劑（L-NAME）、環氧合酶抑制劑（INDO）、L-NAME＋INDO 孵育血管后的腸系膜動脈血管的舒張作用。

2.2 PM2.5顆粒采集及混懸液的制備

將 PM2.5顆粒采集器固定于陜西中醫藥大學四號教學樓樓頂，樓高約 20 m。通過采集器將PM2.5顆粒附著于玻璃纖維膜上，將膜裁剪為1 cm×1 cm方塊，置于燒杯中，加入純水沒過，低溫超聲 60 min，洗脫濾膜，1800 目尼龍濾網過篩除去不溶性大顆粒，濾液真空冷凍干燥 3 d，轉移至 60℃ 烘箱繼續干燥 24 h 后，潔凈臺分裝至無菌離心管，－20℃保存。使用前，稱取適量溶于生理鹽水，超聲震蕩15 min，注意現用現配。

2.3 實驗動物分組及給藥

32只大鼠適應性飼養結束后，按隨機數字表法分為對照組、PM2.5組（15 mg·kg－1）、BC/GD低劑量組（30 mg·kg－1）、BC/GD高劑量組（60 mg·kg－1），每組 8 只，采用非暴露式氣管滴注PM2.5混懸液進行染毒[17]，對照組氣管滴注等量生理鹽水，每6日1次，共10次[18]，滴注體積為 1 mL·kg－1。BC/GD為灌胃給藥，給藥周期為1個月，從染毒1個月后開始給藥。染毒期間觀察各組大鼠毛發、精神、飲食、活動狀況。給藥結束后，禁食12 h，1%戊巴比妥鈉（50 mg·kg－1）麻醉，腹主動脈取血處死，取腸系膜動脈進行指標檢測。

2.4 HE染色觀察血管內皮狀態

取出大鼠腸系膜動脈，用預冷的生理鹽水清洗干凈，吸水紙吸干表面多余水分，4%多聚甲醛固定72 h后，經脫水、包埋、切片、脫蠟、染色、制片，光鏡下不同倍數觀察腸系膜動脈內皮組織病理學狀態，選取固定位置拍照。

2.5 ELISA檢測血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1、LTB4水平

腹主動脈血液樣本常溫靜置30 min，3000 r·min－1離心15 min，分裝血清，－80℃凍存，嚴格按照試劑盒說明書測定血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1、LTB4水平。

2.6 化學發光法檢測腸系膜動脈組織ROS水平

取適量腸系膜動脈血管組織，冰上消解后剪碎，用預冷的PBS沖洗，除去細胞碎片，與適量的酶消化液一起，37℃水浴30 min，孵育過程中，使用移液槍吹打細胞，孵育結束后，PBS清洗，300目的尼龍網過篩，收集濾過的細胞，500 r·min－1離心10 min，吸棄上清液，并用 PBS洗 1～2 次沉淀。利用DCFH-DA對細胞沉淀重新懸?。?×106～2×107個·mL－1），在37℃下培養30 min，每3～5 min反轉混合一次，以保證探頭和細胞的完全接觸，收集孵育（探針標記）后的單細胞懸液，1000 r·min－1離心10 min，收集細胞沉淀，PBS再次沖洗1～2次，再次懸浮，并在最佳激發波長 488 nm，最佳發射波長 525 nm處測定熒光度值。

2.7 硝酸還原酶法檢測腸系膜動脈組織NO水平

取適量腸系膜動脈組織與9倍量生理鹽水在冰上機械勻漿，制成10%的勻漿液，3000 r·min－1離心10 min，取上清液進行NO水平檢測。

2.8 Western blot法檢測腸系膜動脈5-LOX、eNOS、iNOS蛋白表達

取腸系膜動脈組織，加入RIPA裂解液提取蛋白并測定蛋白濃度，蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，封閉后加入抗體（1∶1000），4℃孵育過夜；洗滌后加入二抗（1∶5000）孵育，洗滌后加入ECL超敏發光液顯影，采用成像儀攝像、測量，利用Image Pro Plus 5.0軟件分析計算條帶灰度值。

2.9 統計學方法

采用SPSS 26.0軟件進行數據分析，數據采用±s表示，組間差異采用單因素方差分析（One-way ANOVA），P＜0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 BC/GD對基礎狀態血管張力的影響

與二甲基亞砜（DMSO）組比較，BC/GD對內皮完整的基礎狀態的腸系膜動脈血管環無明顯影響（P＞0.05），提示BC/GD對正?；A狀態的腸系膜動脈無舒張作用（見圖1）。

圖1 BC/GD對基礎狀態的血管環張力的影響Fig 1 Effect of BC/GD on vascular ring tension in the base state

3.2 BC/GD對5-HT預收縮的腸系膜動脈血管張力的影響

結果顯示，BC/GD能明顯舒張血管環。提示BC/GD能舒張5-HT預收縮的腸系膜動脈血管（見圖2）。

圖2 BC/GD對5-HT預收縮的腸系膜動脈血管張力的影響Fig 2 Effect of BC/GD on the tension of the mesenteric artery precontracted with 5-HT

3.3 BC/GD舒張血管作用的內皮機制

L-NAME、INDO、L-NAME＋INDO孵育血管30 min后，5-HT預收縮血管，加入BC/GD后監測血管環張力變化，結果顯示，L-NAME、INDO、L-NAME＋INDO均能抑制BC/GD的舒張血管作用，但L-NAME對BC/GD舒張血管的抑制作用較INDO強。提示BC/GD對血管的舒張作用與調節NO表達有關（見圖3）。

圖3 BC/GD舒張血管作用的內皮機制Fig 3 Endothelial mechanism of BC/GD on the vasodilation

3.4 PM2.5對血管內皮功能的影響

ACh是一種內皮依賴性血管擴張劑，通過刺激內皮細胞產生NO；SNP是一種非內皮依賴的血管擴張劑，直接釋放NO來舒張血管[19-20]。為了研究PM2.5對腸系膜動脈血管內皮功能的影響，將內皮完整的腸系膜動脈分別與DMSO、25 mg·mL－1PM2.5、50 mg·mL－1PM2.5、100 mg·mL－1PM2.5共孵育2 h后，加入1×10－5mol·L－15-HT預收縮血管環，穩定后加入ACh舒張血管。結果顯示，與DMSO組比較，50、100 mg·mL－1BC/GD組對ACh的血管舒張效應明顯減弱（P＜0.01）；而各個濃度的PM2.5對SNP的血管舒張效應無明顯影響。提示50 mg·mL－1以上的PM2.5可引起血管內皮損傷，血管舒張效應減弱（見圖4）。

圖4 不同濃度PM2.5對ACh、SNP血管舒張效應的影響Fig 4 Effect of different concentrations of PM2.5 on the vasodilation of ACh and SNP

3.5 BC/GD對PM2.5誘發血管內皮損傷的影響

為了研究BC/GD對PM2.5引起的血管內皮損傷的影響，將BC/GD（1×10－3mol·L－1）與PM2.5共同孵育2 h后，加入1×10－5mol·L－15-HT預收縮血管環，穩定后累加濃度加入ACh舒張血管，觀察對血管舒張的影響。結果顯示，PM2.5組血管舒張效應明顯減弱，加入BC/GD共同孵育后，血管舒張作用明顯增強。提示BC/GD能增強血管舒張效應，對PM2.5造成的血管內皮損傷有保護作用（見圖5）。

圖5 BC/GD對PM2.5誘發血管內皮損傷的影響Fig 5 Effect of BC/GD on vascular endothelial injury induced by PM2.5

3.6 大鼠一般情況

滴注過程中，對照組大鼠毛色有光澤，飲食、行動正常，呼吸順暢平穩，無其他明顯異常狀態，滴注組大鼠在滴注4次后毛色變暗、呼吸急促、變得暴躁，且隨著染毒次數的增多，上述癥狀逐漸加重；飲食未見明顯異常，體重增長情況良好，無明顯異常。而開始灌胃后，上述異常體征得到有效改善，但體重增長相較于未給藥前減緩（見表1）。

表1 大鼠體重變化(g)Tab 1 Changes in body weight of rats (g)

3.7 各組大鼠腸系膜動脈病理學觀察

對照組大鼠腸系膜動脈血管內皮細胞連續、完整，無明顯病理損傷；PM2.5組大鼠腸系膜動脈內皮完整性嚴重受損、出現缺失，內皮皺縮，BC/GD能不同程度改善大鼠內皮損傷程度和完整性（見圖6）。提示BC/GD對PM2.5誘導的血管內皮損傷具有保護作用。

圖6 BC/GD對各組大鼠腸系膜動脈內皮完整性的影響（HE染色，×200）Fig 6 Effect of BC/GD on the endothelial integrity of the mesenteric arteries in rats of each group（HE染色，×200）

3.8 ELISA法檢測血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1水平

與對照組比較，PM2.5組IL-1β、IL-6、TNF-α水平明顯升高（P＜0.01），TGF-β1水平顯著降低（P＜0.01）；與PM2.5組比較，BC/GD高劑量組大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α水平明顯降低（P＜0.01），TGF-β1水平顯著升高（P＜0.01）；BC/GD低劑量組大鼠TNF-α水平明顯降低（P＜0.01），IL-1β、IL-6、TGF-β1水平無明顯差異（見圖7）。

圖7 BC/GD對各組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1水平的影響Fig 7 Effect of BC/GD on the serum IL-1β，IL-6，TNF-α，and TGF-β1 levels of rats in each group

3.9 化學發光法檢測腸系膜動脈中ROS水平

與對照組比較，PM2.5組大鼠腸系膜動脈中ROS水平顯著升高（P＜0.01）；與PM2.5組比較，BC/GD高劑量組大鼠腸系膜動脈中ROS水平顯著降低（P＜0.01）；BC/GD低劑量組大鼠腸系膜動脈中ROS水平與PM2.5組無明顯差別（見圖8）。

圖8 BC/GD對各組大鼠腸系膜動脈ROS水平的影響Fig 8 Effect of BC/GD on the ROS levels in mesenteric arteries of rats in each group

3.10 硝酸還原酶法檢測腸系膜動脈中NO水平

與對照組比較，PM2.5組大鼠腸系膜動脈中NO水平顯著降低（P＜0.01）；與PM2.5組比較，BC/GD高劑量組大鼠腸系膜動脈中NO水平顯著升高（P＜0.01）；BC/GD低劑量組大鼠腸系膜動脈中NO水平與PM2.5組無明顯差別（見圖9）。

圖9 BC/GD對各組大鼠腸系膜動脈NO水平的影響Fig 9 Effect of BC/GD on the NO levels in mesenteric arteries of rats in each group

3.11 腸系膜動脈中5-LOX、eNOS、iNOS蛋白表達和血清中LTB4水平

與對照組比較，PM2.5組5-LOX、iNOS、LTB4水平明顯升高，eNOS蛋白表達顯著降低（P＜0.05）；與PM2.5組比較，BC/GD低、高劑量組大鼠5-LOX、iNOS蛋白表達顯著降低，eNOS蛋白表達顯著上升（P＜0.05）；BC/GD高劑量組LTB4水平降低（P＜0.05）（見圖10）。

圖10 BC/GD對各組大鼠腸系膜動脈中5-LOX、eNOS、iNOS蛋白表達和血清中LTB4水平的影響Fig 10 Effect of BC/GD on the expression of 5-LOX，eNOS，and iNOS protein in the mesenteric artery and the level of LTB4 in the serum of rats in each group

4 討論

PM2.5具有粒徑小、成分復雜、危害大等特點，易通過上呼吸道黏膜到達并堆積在肺部，再通過肺循環進入全身血液循環[21]。多項研究表明，PM2.5已經成為誘發心肌細胞炎性細胞因子水平增加、誘導血管內皮凋亡、凝血功能異常、自主神經功能失衡等心血管疾病不可忽視的重要因素[22]。

血管內皮細胞是附著于血管內皮生長的單層鱗狀細胞，與血液直接接觸，對血液中的異物刺激具有直接反應[23]，正常生理情況下，內皮細胞可感知內外環境的變化并分泌多種血管活性物質來維持機體內環境穩定[24]。黃芩苷為唇形科植物黃芩干燥根中提取的黃酮類物質，具有保肝、利膽、降壓、鎮靜、消炎等藥理活性。梔子苷為茜草科植物梔子干燥成熟果實中提取的環烯醚萜類物質，具有保肝利膽、解熱鎮靜、降壓、抗炎、止血等藥理作用。研究表明，黃芩苷具有濃度依賴性血管舒張作用[25]，但鮮見梔子苷舒張血管的相關報道。本實驗中，BC/GD對基礎狀態的腸系膜動脈血管環張力無明顯影響，但能明顯舒張由5-HT預收縮的血管環，加入一氧化氮合酶抑制劑L-NAME、環氧合酶抑制劑INDO或兩者合用孵育血管環后，均能明顯抑制BC/GD的血管舒張作用，但L-NAME的抑制作用更為明顯，提示BC/GD舒張血管作用與內皮舒張因子NO有關。體內外研究表明，進入血液循環的PM2.5顆?？赏ㄟ^多種途徑引起血管內皮細胞損傷，引起血管舒張功能障礙[26]。本實驗將不同濃度PM2.5與血管環共孵育2 h后，發現50 mg·mL－1的PM2.5能明顯減弱ACh引發的血管舒張，而對SNP引發的血管舒張效應無明顯影響，提示PM2.5引起的血管舒張效應減弱與內皮有關。將BC/GD和PM2.5共孵育血管環2 h后，BC/GD能明顯改善由PM2.5誘導的舒張效應減弱的作用。提示PM2.5與腸系膜動脈血管環共孵育后能通過多種途徑損傷血管內皮，誘發血管內皮功能障礙，而BC/GD對PM2.5造成的血管損傷具有保護作用。

NO是一種具有內皮功能的多效性功能分子，也是機體最強的血管舒張物質，由內皮細胞中的L-精氨酸在鈣-鈣調蛋白依賴性的NOS催化下合成釋放[27]。而NOS具有三種不同的亞型，即在正常狀態下表達的神經元型一氧化氮合酶（nNOS）和eNOS以及在損傷后誘導表達的iNOS[28]。內皮細胞受到PM2.5刺激后，會引起血管通透性增加、NO生成減少，促進血管緊張素Ⅱ等血管收縮介質的表達與釋放，導致內皮功能障礙[29]。而PM2.5由于其復雜的化學組成和粒徑大小，表面通常吸附重金屬（如鉛、鋅、鐵、鎘、鎳、砷和鉻等）和毒害有機物，其中過渡金屬離子可以催化氧化還原反應，在PM2.5表面產生ROS或活性氮[30]。ROS可以直接滅活NO，也可通過耗竭四氫生物蝶呤（BH4），使eNOS的合成受到抑制，NO含量減少，加速內皮功能障礙[31]。為進一步探討BC/GD抗PM2.5暴露致使的血管內皮功能障礙作用及其機制，本研究利用氣管滴注法構建PM2.5染毒模型。在前期的預實驗中選擇7.5、15、30 mg·kg－1三個PM2.5濃度分別滴注1個月、2個月、3個月進行造模濃度和時間的篩選，結果發現，15 mg·kg－1PM2.5滴注2個月能明顯激活NLRP3炎性小體，誘導心肌細胞結構損傷、促進炎癥反應和心肌細胞凋亡[9]；致使腦組織炎性損傷和激活小膠質細胞并向M1型極化，因此，本實驗繼續采用該造模方法。對各組大鼠血管功能性指標進行檢測，結果顯示，PM2.5組大鼠腸系膜動脈內皮嚴重受損，血管中ROS升高，NO降低，而BC/GD組大鼠內皮損傷得到改善；60 mg·kg－1能明顯降低ROS水平、升高NO水平，促進eNOS、抑制iNOS表達。

課題組一直致力于研究5-脂氧酶（5-LOX）/白三烯B4（LTB4）信號通路介導的機體損傷，5-LOX可以催化花生四烯酸（AA）生成白三烯A4（LTA4），LTA4在一系列酶催化反應下可生成半胱氨酰白三烯（CysLTs）和LTB4[32]。LTB4是重要的促炎脂質介質和炎癥趨化因子，主要表達于巨噬細胞、血小板、平滑肌細胞和內皮細胞等細胞中[33]，LTB4可激活LTB1和LTB2兩個受體，從而激活并招募B細胞和T細胞，促進核因子-κB（NF-κB）產生和IL-6、TNF-α等炎癥因子表達，引發炎癥級聯反應，促進細胞凋亡[34]。有研究表明，5-LOX、FLAP和LTA4H在動脈粥樣硬化病變處均處于高表達狀態，因此，本研究繼續選擇該通路對BC/GD改善PM2.5誘導的血管內皮功能障礙機制進行探討。結果顯示，PM2.5組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、LTB4水平顯著升高，TGF-β1水平顯著降低，大鼠腸系膜動脈中5-LOX蛋白表達明顯增加，而60 mg·kg－1BC/GD能明顯下調5-LOX、LTB4、TNF-α、IL-1β、IL-6表達，上調TGF-β1表達。提示BC/GD可通過抑制5-LOX/LTB4信號通路活化，抑制下游炎性介質釋放，降低炎性損傷。

綜上所述，BC/GD可通過抑制5-LOX/LTB4信號通路表達，下調ROS水平，上調eNOS表達，下調iNOS表達，升高血管中NO水平，改善PM2.5誘導的血管內皮功能障礙。