基于UHPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS的三種基原溪黃草及其干預小鼠肝纖維化的血清化學研究

覃萍，蘇陽靜，陳永苗，鄭瑞瑤，鐘佳妮，葉曉燕，葛躍偉，陳阿麗*（.廣東藥科大學新藥研發中心，廣東省藥物新劑型重點實驗室，廣州 50006；.廣東藥科大學附屬第一醫院，廣州 5006；.廣東藥科大學中藥學院，廣州 50006）

溪黃草是唇形科香茶菜屬的一種多年生草本，其性寒，味苦，主產于黑龍江、江西、廣東、廣西、福建等地，長期以來一直作為民間中草藥被廣泛使用[1]。溪黃草是一種多基原中藥，包括線紋香茶菜Rabdosialophanthoides（Buch.-Ham.exD.Don）Hara、纖花香茶菜Rabdosialophanthoides（Buch.-Ham.ex D.Don）Hara var.gerardiana（Benth）Hara以及溪黃草Rabdosiaserra（Maxim）Hara三種基原。研究表明，溪黃草具有清熱利濕、涼血散瘀的作用，可用于急性膽囊炎、急性黃疸型肝炎等病癥的治療[2]。

肝纖維化是一種肝組織細胞外基質過度沉積（特別是膠原沉積）的病理生理過程[3]。若肝纖維化不能及時治愈，可能會進一步發展為肝硬化，甚至惡化為肝癌。肝纖維化是一個可逆的病理過程，減弱或消除纖維化形成的致病因素可逆轉肝纖維化病理過程[4-5]。

研究表明，溪黃草可以抵抗多種因素引起的肝纖維化，但不同基原溪黃草的化學成分差異大，各企業采用的基原也無統一標準[6-7]。有學者采用經典的肝纖維化誘導劑四氯化碳對小鼠進行處理，在病理生理學上可使小鼠的肝臟組織與人的肝臟組織具有相似性[8]。本研究分析三種基原溪黃草的藥物化學成分及其口服給藥后肝纖維化小鼠血清中的化學成分，對后續溪黃草藥效物質基礎以及抗肝纖維化研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試藥

50只雄性SPF級8周齡C57BL/6J小鼠[河南斯克貝斯生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK（豫）2020-0005]；線紋香茶菜藥材、纖花香茶菜藥材和溪黃草藥材（廣州白云山和記黃埔中藥有限公司溪黃草GAP基地，由廣東藥科大學田素英教授鑒定為真品）。甲醇、甲酸均為質譜純（美國賽默飛公司）；蒸餾水[屈臣氏集團（香港）有限公司]；其余試劑均為分析純。

1.2 三種基原溪黃草提取物的制備

取三種基原溪黃草藥材適量，粉碎，過80目篩，加入8倍體積的95%乙醇，于80℃水浴中回流提取1.5 h，提取2次，過濾，合并濾液并減壓濃縮，冷凍干燥后得三種基原溪黃草乙醇提取物凍干粉。

1.3 供試品溶液的制備

精密稱取溪黃草凍干粉25 mg、纖花香茶菜凍干粉41 mg、線紋香茶菜凍干粉33 mg（相當于0.5 g藥材量），量取10 mL甲醇置于錐形瓶中，稱定質量，超聲處理30 min后，補重，10 000 r·min－1、4℃離心10 min，取500 μL上清液于5 mL量瓶中，加入甲醇至刻度，搖勻，使用0.22 μm微孔濾膜過濾，配制成供試品溶液。

1.4 動物分組與給藥

50只雄性8周齡C57BL/6J小鼠，隨機分成空白對照組、模型組、線紋香茶菜給藥組、纖花香茶菜給藥組、溪黃草給藥組?？瞻讓φ战M腹腔注射橄欖油，其余4組腹腔注射四氯化碳溶液，給藥劑量為1 μL·g－1，一周2次，共8周。準確稱取溪黃草凍干粉257 mg、纖花香茶菜凍干粉421.48 mg、線紋香茶菜凍干粉339.24 mg（相當于5.14 g藥材量），分別溶解于10 mL羧甲基纖維素鈉溶液，配制成供試藥液?？瞻讓φ战M以及模型組小鼠每日灌胃羧甲基纖維素鈉溶液，各給藥組給予供試藥液，給藥劑量為5.14 g·kg－1，連續給藥8周。末次給藥12 h后摘眼球取血，并用1.5 mL EP管收集，4℃條件下4500 r·min－1離心12 min，取血清，保存于－80℃冰箱。

1.5 血清樣品的制備

將血清樣本從－80℃冰箱中取出解凍，渦旋混勻，取100 μL置于EP管中，加入400 μL提前預冷的甲醇，充分渦旋2 min，冰水浴超聲30 min后，10 000 r·min－1、4℃條件下離心10 min。取上清液，氮吹濃縮，殘留物加入80 μL的80%甲醇復溶，0.22 μm的微孔濾膜過濾，得到血清化學樣品。

1.6 UHPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS檢測條件

采用Shim-pack GIST-HP C18色譜柱（2.1 mm×150 mm，3 μm），預柱為Shim-pack GIST-HP C18，流動相為0.1% 甲酸水（A）-甲醇（B）；流速為0.3 mL·min－1；柱溫30℃；進樣量2 μL，梯度洗脫（0～3 min，10%B；3～8 min，10%→35%B；8～30 min，35%→55%B；30～35 min，55%→65%B；35～56 min，65%～95%B；56～58 min，95%；58～63 min，95%→10%；63～65 min，10%B）。采用電噴霧離子源（ESI），正、負離子模式下進行Fullscan及MS/MS掃描，MS/MS采用數據依賴型（DDA）數據采集，掃描范圍m/z100～1500；毛細管電壓：3.5 kV；鞘氣流速：45 arb；輔助氣體流速：10 arb；毛細管溫度：350℃。

1.7 不同基原溪黃草藥材及血清樣品化學成分鑒定

應用UHPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS技術對三種不同基原溪黃草藥材樣品以及給藥小鼠血清樣品進行分析，包括保留時間、高分辨準分子離子峰、MS/MS碎片離子等，結合對照品比對及文獻報道，進行化合物推定。

2 結果

2.1 UHPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS 色譜圖的采集

以負離子模式為例，采集的三種基原溪黃草藥材樣本及其給藥小鼠血清樣本的色譜圖結果見圖1，鑒定藥物化學成分結果見表1。

表1 鑒定藥物化學成分結果Tab 1 Identification of chemical components

圖1 溪黃草藥材（A）及其給藥組血清（B）負離子模式基峰離子流色譜圖Fig 1 ESI－of based peak chromatogram of Rabdosia serra（A）and the serum of Rabdosia serra administration group（B）

2.2 三種不同基原溪黃草藥材樣品化學成分的裂解規律

2.2.1 酚酸類成分的裂解規律 結果顯示，酚酸類成分主要有香草酸、原兒茶酸和迷迭香酸等。以迷迭香酸為例，在負離子模式下，保留時間為17.61 min，準分子離子峰為m/z359.0778[MH]－，其在裂解過程中丟失一分子丹參素和一分子咖啡酸，前者生成碎片離子m/z197.0454和m/z161.0228，后者生成碎片離子m/z179.0348。此外，丹參素通過中性丟失一分子H2O可生成碎片離子m/z179.0348，該碎片離子再失去一分子CO2，生成m/z135.0446。碎片離子m/z133.0295則推測為m/z161.0228通過中性丟失一分子CO生成。此裂解規律與文獻報道一致[19]，因此推測該結構為迷迭香酸，其質譜裂解規律見圖2。

2.2.2 黃酮類成分的裂解規律 結果顯示，黃酮類成分主要有夏佛塔苷和蘆丁等。以蘆丁為例，在負離子模式下，保留時間為17.03 min，準分子離子峰為m/z609.1470[M-H]－，其在裂解過程中丟失一分子糖苷，生成碎片離子m/z301.0347。該碎片離子通過發生RDA反應裂解生成m/z178.9984，而后通過中性丟失一分子CO生成碎片離子m/z151.0021，此裂解規律與文獻報道一致[20]。蘆丁質譜裂解規律見圖3。

圖3 蘆丁質譜裂解規律Fig 3 Proposed fragmentation pathways of rutin

2.2.3 二萜類成分的裂解規律 結果顯示，二萜類成分主要有horminone、kamebakaurin和maoecrystal A等。其中maoecrystal A是一種有代表性的對映貝殼杉烷類二萜化合物，其3，20-環氧 C-20 位被氧化。Maoecrystal A的保留時間為38.06 min，準分子離子峰為m/z387.1815[M-H]－，其在裂解過程中丟失了一分子CH3COOH，生成碎片離子m/z327.1606，該碎片離子再丟失一分子H2O，生成m/z309.1502，這與其他 C-20 位被氧化的對映貝殼杉烷類二萜的碎裂途徑一致，并且此裂解規律與文獻報道一致[15]。Maoecrystal A的質譜裂解規律見圖4。

圖4 Maoecrystal A質譜裂解規律Fig 4 Proposed fragmentation pathways of maoecrystal A

2.3 三種不同基原溪黃草在給藥小鼠血清中入血成分的鑒定

M1在正離子模式下的準分子離子峰為m/z118.0867[M＋H]＋，推測其分子式為C5H11NO2。在其二級質譜圖中檢測到特征碎片離子m/z59.0738，在溪黃草藥材及其血清中均被檢出，結合文獻[9]推測該化合物為甜菜堿。M2在負離子模式下的準分子離子峰為m/z188.9858[M-H]－，推測分子式為C6H6O5S，其特征碎片為m/z109.0283，推測是M2丟失一分子SO3所得。纖花藥材中可檢出原兒茶酸，但在血清中未檢出原型，可能是由于其具有3個羥基易與硫酸結合，因而推測M2為原兒茶酸失去一分子CO2所形成的O-硫酸酯化合物[21]，其在小鼠體內可能的代謝途徑見圖5。M3在負離子模式下的準分子離子峰為m/z179.0343[M-H]－，推測分子式為C9H8O4，其特征碎片離子m/z135.0442可能是前體離子裂解過程中失去一分子CO2所得，且該碎片離子通過丟失一分子CO，進而產生m/z107.0492，推測該結構為咖啡酸，在三種基原溪黃草血清中均被檢出原型。結合文獻，迷迭香酸在體內代謝產物有咖啡酸，因而推測咖啡酸可能是其代謝產物[22]?？Х人岬馁|譜裂解規律見圖6，該裂解途徑與文獻報道一致[23-24]。

圖5 原兒茶酸體內代謝途徑Fig 5 Metabolic way of protocatechuic acid

圖6 咖啡酸質譜裂解規律Fig 6 Proposed fragmentation pathways of caffeic acid

具體三種基原溪黃草給藥小鼠血清中入血成分及可能代謝產物見表2。

表2 小鼠血清中入血成分及可能代謝產物的鑒定Tab 2 Identification of blood components and possible metabolites in mouse serum

3 討論

本實驗采用UHPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS技術研究四氯化碳致肝纖維化小鼠模型中三種基原溪黃草的入血成分。結果在三組藥材中共鑒定出40個化合物，包括二萜、酚酸、黃酮及其他類化合物；在給藥小鼠血清中鑒定出2個入血成分，包括1個有機酸類和1個生物堿類，鑒定出2個可能的代謝產物均為酚酸類化合物。其中，在溪黃草藥材和給藥組血清中分別鑒定出26個和2個化合物；在線紋香茶菜藥材和給藥組血清中分別鑒定出34個和1個化合物；在纖花香茶菜藥材和給藥組血清中分別鑒定出33個和2個化合物。

研究表明，氧化應激是四氯化碳誘導肝纖維化發病的重要機制之一[25]。甜菜堿為生物堿類化合物，具有抗氧化及抗炎作用，能夠抑制肝星狀細胞的活化進而達到抗肝纖維化的效果[24，26]。原兒茶醛與原兒茶酸同為抗氧化、抗炎作用較強的酚酸類化合物，都具有很好的護肝功效[27-29]。在藥材和給藥小鼠血清中均檢出酚酸類化合物咖啡酸，研究發現，其通過激活NRF2/ARE信號通路，提高抗氧化相關基因水平，增強肝細胞清除自由基的能力，改善肝細胞氧化應激，從而達到保肝作用[30]。

綜上所述，以上入血成分及代謝產物在抗炎、抗氧化等方面發揮著重要作用，由此推測這些成分可能是三種藥材發揮作用的潛在藥效物質。雖然三種基原溪黃草藥材中均檢出較多二萜類成分，但未在入血成分中檢出，其原因可能為二萜類成分進入小鼠體內后發生了生物轉化過程，因而難以檢出原型成分[31-32]。

本研究應用UHPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS技術完成了三種基原溪黃草及其給藥后入血成分的初步鑒定，為后續研究溪黃草的藥效物質基礎及其抗肝纖維化作用提供了理論參考。