藥用植物內生菌促藥效成分生物合成的研究進展

曹際釗，都曉偉，李倩，國立東，于丹（黑龍江中醫藥大學藥學院，哈爾濱 150040）

植物內生菌是指存活于植物內部，又不會引發宿主植物表現出明顯感染癥狀的微生物類群，主要為真菌、細菌和放線菌[1]。藥用植物內生菌不僅能夠促進寄主植物的生長，增強寄主植物對各種病原菌和環境脅迫的抗性，還能促進宿主植物化學成分的合成或產生與宿主相同或相似的化學成分[2]，或者對化學成分進行結構修飾，增強其藥理活性[3]。1993年，Stierle等[4]首次從短葉紫杉的樹皮中分離得到一株能夠產生抗腫瘤活性物質紫杉醇的內生真菌安德氏紫杉霉（Taxomyces andreanae），這為生產紫杉醇提供了途徑，從而引發了藥用植物內生菌的研究熱潮。藥用植物內生菌現已成為獲取活性成分的新寶庫[5]。

本文歸納總結了現已報道的藥用植物內生菌種類及其促進藥用植物活性成分生物合成的途徑，包括直接合成生物活性物質、誘導子效應和生物轉化作用，為促進藥用植物內生菌的應用和提升生藥材質量提供參考。

1 藥用植物內生菌種類

內生菌與宿主植物長期進化、共生，形成了穩定的互利關系[6]。來源于內生細菌、內生真菌和內生放線菌的許多菌種均具有代謝產生與宿主相同或相似的活性成分，或促進宿主植物活性成分生物合成，或對宿主植物化學成分進行結構修飾的作用。

1.1 內生真菌

藥用植物內生真菌多來源于雙核菌門子囊菌亞門中的核菌綱、盤菌綱和腔菌綱[7]。根據內生真菌與宿主間的專一性分析，自然界至少有100多萬種內生真菌[8]。研究人員總結了國內外藥用植物內生真菌的種類，從83科212種藥用植物的根、莖、葉、花、果實和葉柄中分離得到的內生真菌多達376屬，涉及子囊菌、擔子菌和無孢類群等。其中子囊菌為植物內生真菌的優勢種群，有372屬，例如鐮刀菌屬、鏈格孢屬、青霉菌屬、毛殼菌屬、木霉屬和擬莖點霉屬等，以鐮刀菌屬真菌的數量最多，現已發現其寄生于100余種藥用植物中[9]。從盾葉薯蕷中分離獲得的一株內生尖孢鐮刀菌（Fusariumoxysporum），利用其滅活菌絲處理盾葉薯蕷的無菌苗可以提高薯蕷皂苷元的含量[10]。來自于鏈格孢屬真菌的植物內生真菌也較為多見，從黃芪中分離獲得的一株內生鏈格孢菌Alternariaeureka20131E1BL1可以修飾環黃芪醇和黃芪醇的結構，生成具有端粒酶抑制作用的新化合物[11]。Kaur等[12]研究發現牛角瓜內生真菌Allternariadestruens代謝生成的酚類化合物AF1和AF2，既可以抗菌又可以抑制α-葡萄糖苷酶的活性，這使其可能在糖尿病的治療中獲得應用。

1.2 內生細菌

藥用植物內生細菌主要來源于芽孢桿菌目、腸桿菌目和假單胞菌目，在這些目中，又以來源于芽孢桿菌屬、泛菌屬和假單胞菌屬的細菌最為常見[13]?，F已發現藥用植物內生細菌可以促進枯草菌脂肽鈉、伊枯草菌素、豐原素等的生物合成[14]。周佳宇[15]研究顯示，內生細菌熒光假單胞菌（P.fluorescens）侵染茅蒼術后，茅蒼術體內含氧倍半萜含量增加，揮發性成分蒼術醇、β-桉葉醇和蒼術酮的積累也顯著提升。不動桿菌（Acinetobacter）是分離自蒼術的另一種內生細菌，其可以通過誘導植物內源激素分子的合成，促進蒼術揮發油的積累，蒼術醇、蒼術酮和蒼術素等主要揮發性化學成分的含量均有所提高[16]。Song等[17]研究發現人參內生細菌芽孢桿菌屬LB5-3誘導人參不定根6 d后，人參總皂苷的含量增加了3倍。

1.3 內生放線菌

在內生菌研究初期，有關內生放線菌的研究較少，直到1999年Caruso等[18]從歐洲紅豆杉（TaxusbaccataL.）中分離得到多株能夠自主產生紫杉烷類物質的內生放線菌菌株，尤其是北里孢菌（Kitasatospora），可以完全依靠自身產生紫杉醇，這一發現使得內生放線菌備受關注。

迄今為止，已從藥用植物中發現了140多個放線菌屬，主要為鏈霉菌屬（Streptomyces）、鏈輪絲菌屬（Streptoverticillum）、游動放線菌屬（Antinoplanes）、鏈孢子囊菌屬（Streptosporangium）、諾氏卡菌屬（Nocardia）、擬諾卡氏菌屬（Nocardiopsis）和小單胞菌屬（Micromonospora）等[19]。藥用植物內生放線菌能產生包括多肽、有機酸、生物堿、醌、萜類等在內的多種次級代謝產物[20-21]。

內生放線菌還可以促進宿主植物生成活性成分。Li等[22]發現一株黃花蒿內生放線菌假諾卡氏菌屬（Pseudonocardia）YIM 63111，其可以通過上調黃花蒿中編碼紫穗槐二烯氧化酶（CYP71AV1）和細胞色素P450還原酶（CPR）基因的表達，從而提高黃花蒿中青蒿素的產量。Zhou等[23]從益智中分離出一株放線菌鏈霉菌屬YIM66017，發現其可顯著提高宿主中2，6-二甲氧基對苯二甲酸、cyclo（Gly-Trp）和具有較強抗氧化性的α-羥基乙酰香草酮的含量。

代表性促進活性成分合成的藥用植物內生真菌，內生細菌及內生放線菌見表1。

表1 代表性促進活性成分合成的藥用植物內生菌Tab 1 Representative endophytes from medicinal plants in promoting the biosynthesis of active substances

2 藥用植物內生菌促活性成分生物合成途徑

藥用植物內生菌促活性成分生物合成的途徑主要包括：① 內生菌直接合成與宿主植物相同的活性成分；② 通過誘導子效應改變宿主植物的基因表達和代謝途徑；③ 通過生物轉化作用對植物化學成分進行結構修飾與改造或提高活性成分的含量。

2.1 內生菌直接合成活性成分或其前體物質

目前已有報道，內生菌能通過自身代謝生成紫杉醇[25]、喜樹堿[32]等多種活性化合物，或者以合成的次生代謝產物作為前體物再通過宿主植物的合成酶系催化生成活性成分，進而影響宿主的次生代謝積累[68]。研究表明，可直接合成活性成分的藥用植物內生菌基本都可以在僅提供菌體生存必要成分的培養基中產生活性成分，并且不必依賴于宿主植物的存在，但若想提高產量還需要增加碳源氮源以及與宿主植物中相同的一些前體物質等[32，69]。

2.1.1 內生真菌直接合成活性成分 可直接合成藥用植物活性成分的內生真菌常見于鐮刀菌屬、鏈格孢屬、曲霉屬等。Kumar等[25]從紅豆杉中分離到可產生紫杉醇的內生煙曲霉（Aspergillus fumigatus），其液體培養基中的紫杉醇含量可達1.6 g·L－1，是目前能夠代謝生成紫杉醇的微生物中最高的。從喜樹中分離篩選得到的一株內生鏈格孢屬Alternariasp.菌株，其發酵液中喜樹堿含量可達227 μg·L－1[70]。從柴龍樹中分離得到的內生真菌FusariumsolaniMTCC9667和MTCC9668，兩者均能產生喜樹堿，并且還可以產生9-甲氧基喜樹堿和10-羥喜樹堿[32]。研究人員從千層塔中分離到一株可產生石杉堿甲的內生真菌膠孢炭疽菌，基因組和轉錄組分析顯示該菌株的聚酮合酶相關基因對石杉堿甲的積累有重要作用[30]。

某些內生真菌活性成分的生成必須依賴于宿主植物。例如，從喜樹樹皮組織中分離出的一株腐皮鐮孢菌（Fusariumsolani），在體外培養條件下其產生喜樹堿的能力隨著傳代次數增加而逐漸下降，優化發酵條件和添加前體物質均不能恢復其合成喜樹堿的能力，但進一步研究發現這株內生真菌能夠自行合成喜樹堿的前體物質β-吲哚基乙胺，然后借助宿主植物中的異胡豆苷合成酶合成喜樹堿[68]。

2.1.2 內生細菌直接合成活性成分 目前，有關內生細菌直接合成皂苷類化合物的研究相對較多，如三萜皂苷、甾體皂苷等。例如，分離自人參的一株內生嗜氣芽孢桿菌（Bacillusaerophilus）PD17-15，其可通過自身代謝產生稀有人參皂苷F2[69]。同樣分離自人參的一株內生細菌農桿菌屬（Agrobacterium）PDA-2，其液體培養基中的稀有人參皂苷Rg3和Rh2含量分別達到62.20 mg·L－1和18.60 mg·L－1[71]。金護定[72]從人參中分離得到81種人參內生菌，從中篩選得到3株具有較強產皂苷能力的菌株，分別為2株節桿菌屬（Arthrobactersp.）LB-2和R2A-2，以及1株毛根農桿菌（Agrobacteriumrhizogenes）PDA-2，其中菌株LB-2可以產生人參皂苷F2、人參皂苷Rh2和原人參二醇PPD，而菌株R2A-2除了可以產生上述三種人參皂苷外，還可以產生人參皂苷Rb1，菌株PDA-2可以產生人參皂苷F2、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg3、人參皂苷Rh2和原人參二醇PPD。

重樓甾體皂苷具有顯著的抗腫瘤活性，趙明等[47]從華重樓中分離到的內生細菌西地西菌屬（Cedeceadavisae）SS01和類芽孢桿菌屬（Paenibacillusdaejeonensis）SS02均能產生重樓甾體皂苷類化學成分。甾體皂苷是襄麥冬的主要活性成分之一，余海忠等[73]從不同生長時期的襄麥冬塊根和須根中分離獲得50株內生細菌，后經純培技術篩選出3株具有明顯產甾體皂苷能力的內生細菌，分別為墨西哥假黃單胞菌（Pseudoxanthomonasmexicana）、山羊葡萄球菌（Staphylococcuscaprae）和磚紅色微桿菌（Microbacteriumtestaceum）。

2.1.3 內生放線菌直接合成活性成分 與內生真菌和內生細菌相似，內生放線菌也具有產生與宿主植物相同活性成分的能力，但研究報道相對較少。Caruso等[18]從歐洲紅豆杉中分離得到多株能夠自主產生紫杉烷類物質的內生放線菌菌株，其中北里孢菌（Kitasatospora）自身就能夠合成紫杉醇。分離自銀樺的內生放線菌Streptomycessp.NRRL 30566可代謝生成kakadumycin，其是一種多肽抗菌藥物，對革蘭氏陽性菌具有很強的抗菌活性，同時對RNA合成酶也表現出抑制活性[74]。

2.2 內生菌介導的誘導子效應

誘導子是能夠誘導植物細胞出現一種或幾種反應，并激發植物特征性自身防御反應的分子。植物能夠通過化學識別系統檢測到誘導子，觸發自身產生信號轉導，進而引起反應應答，導致某些次生代謝物的積累[75]。內生菌作為藥用植物環境的重要組成部分，可起到誘導子的作用，與藥用植物形成長期穩定、互惠互利的共生關系[15，76]。內生菌誘導子幾乎全部為內生真菌，可以快速、特異地誘導藥用植物中特定基因的表達，從而激活一系列特定的次生代謝途徑，促使有效成分的積累。目前內生真菌誘導子的研究主要有菌體和代謝物兩種形式，其中菌體又包括活細胞和菌絲體提取物兩個方面。

2.2.1 內生菌菌體作為誘導子 通常通過直接接種內生菌活細胞于宿主植物組培苗和無菌苗等組織培養基中，以研究內生菌活細胞的誘導子效應對宿主植物的誘導作用。Yuan等[76]通過對蒼術的生根試管苗接種內生真菌，發現蒼術的內生真菌Gilmaniellasp.AL12能夠上調與初級代謝（碳固定，碳水化合物代謝和能量代謝）相關的基因和蛋白質表達，并且AL12還上調了參與萜烯骨架生物合成的編碼β-farnesene synthase和β-caryophyllene synthase基因的表達，這說明內生菌與植物締合可以通過增加能量來源，調控糖酵解、三羧酸循環和增強代謝通量來提高生物活性物質含量，同時發現AL12還可以上調蒼術中編碼L-蘋果酸脫氫酶（MDH）和丙酮酸脫氫酶（PDHE）基因的表達，MDH可以促進蘋果酸與草酰乙酸之間的可逆轉化提高草酰乙酸的含量，然后經過檸檬酸丙酮酸循環將乙酰輔酶A從線粒體中轉運到胞液中，使得丙酮酸和乙酰輔酶A含量升高，表明有更多的前體物質和能量可用于萜類化學成分的生物合成[77]。Li等[37]將石斛內生真菌Mycenasp.MF23接種到石斛組織培養苗中，其可通過調節甲羥戊酸（MVA）途徑相關基因的表達來提高石斛中石斛堿的含量。周佳宇[15]研究顯示熒光假單胞菌（Pseudomonasfluorescens）侵染茅蒼術后誘導茅蒼術體內活性氧（ROS）迸發，同時將不含氧倍半萜氧化成含氧倍半萜。

將宿主植物愈傷組織等置于附有菌絲體提取物誘導子的培養基質中培養已成為提高植物次生代謝物產率的有效策略之一。江曙等[78]從4個產地的明黨參植株中共分離到8屬116株內生真菌，其中使用內生真菌Fusariumsp.菌絲提取物處理的明黨參細胞生長量和多糖含量較非處理組分別提高了31.86%和38.01%。Xu等[36]從丹參中分離得到一株內生真菌易脆毛霉（Mucorfragilis），將丹參毛狀根置于添加該菌絲體提取物的液體培養基中培養，發現毛狀根中編碼乙酰輔酶A硫解酶（AACT）、香葉基二磷酸合成酶（GGPPS）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）的基因表達上調，進而使得丹酚酸、迷迭香酸、硬脂酸和油酸等初級和次級代謝物增多。

目前，利用懸浮細胞培養是快速獲取藥用植物有效成分的途徑之一，而內生菌菌絲體提取物可在此基礎上進一步提高原有活性物質含量，甚至誘導產生新的代謝產物。有研究發現，在蒼術懸浮細胞中只能檢測到β-桉葉醇，但是蒼術內生小克銀桿孢菌（Cunninghamellasp.）AL4的滅活菌絲體作為誘導子可以誘導蒼術懸浮細胞產生揮發油，主要包括蒼術醇、蒼術酮和蒼術素，同時β-桉葉醇的含量也顯著提高，是同期對照組的2.22倍[79-80]。

2.2.2 內生菌代謝物作為誘導子 藥用植物內生菌代謝物能夠誘導促進寄主植物中活性物質的生物合成。內生菌和宿主植物的關系可以被視為一種靈活的、動態的相互作用，內生菌可根據寄主植物的生長變化適應性地改變宿主植物的基因表達或代謝物生成，反之亦然。周佳宇[15]研究發現熒光假單胞菌（Pseudomonasfluorescens）產生的胞外蛋白、胞外多糖及揮發性化合物苯甲醛對蒼術揮發油成分的積累具有促進作用，其中苯甲醛可促進蒼術醇、β-桉葉醇和蒼術酮的積累，胞外多糖可促進β-桉葉醇和蒼術酮的積累，胞外蛋白能促進蒼術醇的積累。夏偉等[81]使用地黃內生真菌草酸青霉（Penicilliumoxalicum）的滅菌發酵液對地黃組培苗進行誘導處理，與對照組相比，經發酵液誘導的地黃組培苗中梓醇和毛蕊花糖苷的含量分別提高了36%和68.2%。

2.3 內生菌的生物轉化作用

微生物繁殖速度快，擁有大量的酶系。藥用植物內生菌可利用其產生的胞內或胞外酶對宿主中的化學物質進行生物轉化，提高生物活性物質的含量或者通過結構修飾及改造生成新的活性物質[82-83]。

2.3.1 內生真菌的生物轉化作用 研究表明，內生真菌可以對宿主植物的活性成分進行羥基化、去糖苷化等修飾。甘草次酸因其水溶性差且長期服用會引起類醛固酮增多癥等問題，大大限制了其臨床應用，對其進行結構修飾是解決該問題的有效途徑。研究發現甘草次酸可被其內生短刺小克銀漢霉（CunninghamellablakesleeanaLendner）生物轉化成3-酮基-7β，15α-二羥基-18β-甘草次酸、7β-羥基-18β-甘草次酸和15α-二羥基-18β-甘草次酸等5個已知產物和1個新化合物（3-酮基-15β-二羥基-18β-甘草次酸）[84]。該轉化過程表現出短刺小克銀漢霉對甘草次酸的羥基化作用，在減輕甘草次酸不良反應的同時還改善了甘草次酸的溶解性。武倫鵬等[46]研究發現內生真菌Fungalsp.GH26能夠高效地將人參皂苷Rb1轉化為藥理活性更強的稀有人參皂苷CK，轉化率高達76.6%。

2.3.2 內生細菌的生物轉化作用 內生細菌對藥用植物活性成分進行生物轉化多與其糖苷水解酶相關。比如，陳賀等[44]通過巴氏醋酸桿菌（Acetobacterpasteurianus）發酵人參，發現發酵物中人參皂苷Rb1、Rb2、Rd和Rg1的含量顯著減少，而稀有人參皂苷CK的含量顯著升高，推測該菌株可以將人參中的人參皂苷Rb1等常量皂苷水解成稀有人參皂苷CK。李粟琳等[55]應用保加利亞乳桿菌（Lactobacillusbulgaricus）、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillusrhamnosus）等菌種成功水解了三七、人參和西洋參中皂苷類成分的糖苷鍵，將常量人參皂苷轉化為稀有人參皂苷Rh1及CK等。Siddiqi等[85]對人參皂苷乳桿菌（Lactobacillus ginsenosidimutans）EMML 3041T菌株進行了全基因組測序，共鑒定出12組糖苷鍵水解酶，其中重組酶（GST-BglL.gin-952）顯示出良好的將人參皂苷Rg1轉化成人參皂苷Rg3（S）的能力。

2.3.3 內生放線菌的生物轉化作用 鬼臼毒素是從鬼臼類植物（如桃兒七、山荷葉等）中分離獲得的具有抗腫瘤活性的化合物，但其強烈的毒副作用限制了其臨床應用。曹松等[86]從桃兒七根莖中分離篩選出一株可將鬼臼毒素轉化為4'-去甲基表鬼臼毒素的內生放線菌Streptomycessp.，推測該內生放線菌可能含有O-去甲基化酶和異構化酶。相較于鬼臼毒素，4'-去甲基表鬼臼毒素的毒性減弱、抗腫瘤活性增強，且其抗腫瘤機制也有所不同，因此4'-去甲基表鬼臼毒素更具有開發前景。

3 展望

藥用植物內生菌為提升藥材質量，獲取生物活性成分提供了新途徑。首先，可利用內生菌介導的誘導子效應調控植物生長來生產優質藥材；其次，利用內生菌可代謝產生與宿主植物相同的活性成分特性直接生產藥效物質，提高活性成分的生產效率，解決自然資源不足的現狀；第三，也可利用藥用植物內生菌的生物轉化作用，通過發酵藥材來獲取藥效物質。內生菌也為篩選具有藥用價值的活性物質或新型化合物提供了新的源泉。然而，現有研究大部分集中在內生真菌上，在內生細菌和內生放線菌方面仍有很大空白需要填補。同時，內生菌可以產生與寄主藥用植物相似或相同的活性成分，有必要明確區分活性成分是由寄主植物產生，還是由內生菌產生，或者是兩者聯合產生，這將為探索藥效物質合成機制提供幫助?？傊?，藥用植物內生菌具有廣闊的應用及開發前景，藥用植物作為內生菌活動的重要場所，是寶貴的內生菌資源庫，其中蘊含的大量具有潛在應用價值的內生菌亟待挖掘。