miRNAs對食管癌發生發展的影響及中醫藥的干預作用

李晨輝，彭孟凡，孔小莉，白明*，苗明三*（.河南中醫藥大學，鄭州 450046；.黃淮學院，河南 駐馬店 463000）

食管癌是常見惡性腫瘤，統計顯示，其患病率和死亡率在全球惡性腫瘤中分別居第七位和第六位[1]。早期的食管癌癥狀不明顯，且病灶局限，影像學檢查檢出率及準確性有限，腫瘤標志物檢測（CYFRA21-1、CEA、SCCA、p53蛋白抗體等）的特異性與靈敏度也不高，不利于早期食管癌的診斷和治療[2]。MicroRNAs（miRNAs）是由18～24個核苷酸組成的內源性非編碼小分子RNA，是近年來腫瘤檢測標志物和腫瘤研究領域的一大熱點。miRNAs可通過與長鏈非編碼RNA（lncRNA）、環狀RNA（circRNA）、信使RNA（mRNA）、蛋白分子等相互作用，參與調控細胞的增殖、周期、分化、凋亡等生理過程，介導包括食管癌在內的多種惡性腫瘤的發生與發展[3]。

中醫藥在食管癌的防治、預后等方面效果明顯，可增強臨床療效，提高患者生活質量[4]。近年來，中醫藥通過miRNAs干預腫瘤進展的研究日益增多，因此，文章就miRNAs在食管癌發生發展中的雙重調控機制及中醫藥經miRNAs干預食管癌的作用機制進行系統綜述，旨在為食管癌的臨床診斷、治療和預后評估等提供新思路。

1 miRNAs的概述

miRNAs是在動物、植物和一些病毒中發現的一類非編碼RNA，第一個人類miRNAslet-7于2000年被發現，目前已有2000多種人類miRNAs在數據庫中被注釋[5]。miRNAs可通過與特定的功能蛋白形成RNA誘導沉默復合體（RNA-induced silencing complex，RISC）來調控細胞的生物過程，其調控途徑主要為與mRNA堿基、靶片段互補配對，抑制靶基因翻譯，以及調控靶基因啟動子CpG島（CpG island）的甲基化來影響靶基因的轉錄[6]。miRNAs在惡性腫瘤中發揮著重要作用，miRNAs既可作為促癌基因參與食管癌的發生，誘導腫瘤細胞放化療抵抗，減弱臨床治療效果，促進腫瘤細胞無限增殖、侵襲和轉移等多種惡性生物學行為；又可作為抑癌基因降低食管癌的發生率，阻斷其惡性發展[7]。部分參與的miRNAs如表1所示。

表1 部分miRNAs對食管癌的影響Tab 1 Impact of part of miRNAs on esophageal cancer

2 miRNAs對食管癌發生發展的影響

2.1 miRNAs對食管癌動物模型的影響

體內動物實驗表明，過表達miRNAs-200c的Eca109細胞皮下成瘤的腫瘤的體積和重量與Eca109細胞相當，放療可以降低皮下瘤的體積和瘤重。miRNAs-200c可通過抑制細胞周期蛋白B1（Cyclin B1）、細胞分裂周期基因cdc2（cell division cycle gene，cdc2）和促進P21蛋白表達抑制體內腫瘤進展，具體表現為，過表達miRNAs-200c的Eca109細胞皮下成瘤的腫瘤的體積和重量經放射治療后均顯著低于Eca109細胞皮下瘤[8]。Yang等[9]發現，與順鉑抵抗食管癌細胞株OE19/CDDP相比，過表達miR-181a-5p的細胞株OE19/CDDP具有更小的腫瘤體積和瘤重，且經順鉑治療后，后者腫瘤體積減小和瘤重降低更為顯著。Li等[10]發現，過表達miR-29c的細胞株KYSE410FR皮下成瘤能力較KYSE410弱，且經氟尿嘧啶（5-FU）治療后，前者皮下瘤體積顯著減小，表明miR-29c可在體內水平促進腫瘤細胞對5-FU的敏感性，增強抗腫瘤效果，且該作用是通過靶向結合FBXO31mRNA進而升高腫瘤組織cleaved caspase-3、p-p38和降低Ki67蛋白實現的。Wu等[11]發現，順鉑干預可抑制食管癌細胞Eca109的皮下成瘤能力，減小腫瘤體積和降低瘤重。與順鉑比，干擾Eca109細胞miR-10b表達后聯合順鉑治療更能顯著減小腫瘤體積和降低瘤重。

2.2 miRNAs對離體食管癌的影響

2.2.1 miRNAs對食管癌細胞的影響 分化抑制因子3（ID3）在食管癌中扮演致癌基因的角色，可通過激活ERK/MAPK通路誘導食管癌細胞增殖、遷移、侵襲等惡性生物學行為[12]。體外實驗表明，miRNAs-340-5p能通過結合ID3 3'-UTR端在轉錄和翻譯水平降低ID3表達，從而抑制食管癌Eca109細胞增殖、遷移和侵襲[13]。GEPIA數據庫中臨床數據表明，lncRNA DLEU2在食管癌組織中高表達，并與患者不良預后相關，還可在體外促進食管癌細胞Eca-109和KYSE-150惡性表型。miR-30e-5p可通過內源性結合lncRNA DLEU2解除其對轉錄因子-7（E2F7）的正調控作用，抑制食管癌細胞增殖、遷移和侵襲，增加細胞凋亡[14]。

相反，部分研究表明miRNAs在食管癌中發揮抑癌作用。miR-301a-3p參與多種腫瘤的發病，包括食管癌，其在正常食管黏膜細胞系Het-1A中的表達顯著低于食管癌細胞Eca109和TE-1，過表達miR-301a-3p則可顯著增強Eca109細胞增殖能力和克隆形成率，該作用是通過miR-301a-3p靶向PTEN基因的3'-UTR端，進而抑制PTEN/PI3K/AKT通路實現的。而抑制miR-301a-3p表達，則可抑制PTEN/PI3K/AKT通路、降低Bcl-2蛋白、升高Bax蛋白，從而抑制Eca109細胞的增殖[15]。高棟才[16]發現，食管癌TE-1細胞中miR-103a-2-5p的表達低于KYSE-150細胞，在TE-1細胞中過表達miR-103a-2-5p可增加其增殖、侵襲和遷移能力，而敲低KYSE-150細胞miR-103a-2-5p可抑制其增殖、侵襲和遷移能力。進一步研究表明，與高水平miR-103a-2-5p的外泌體共培養也可促進食管癌細胞TE-1和KYSE-150的增殖、侵襲和遷移。

2.2.2 miRNAs對腫瘤相關巨噬細胞的影響 腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）是在腫瘤組織中浸潤的巨噬細胞，具有異質性，常具有M1型和M2型兩種分化狀態，一般而言，M1型具有抗腫瘤作用，M2型具有促腫瘤作用?，F有研究表明，miRNAs在巨噬細胞的分化和活性維持中具有重要作用。miR-21-5p在EC109及其外泌體中高表達，同時miR-21-5p可由外泌體作為傳遞介質，被巨噬細胞攝取，抑制巨噬細胞吞噬功能，促進巨噬細胞增殖和極化為M2型。EC109 細胞轉染miR-21-5p mimic與巨噬細胞共培養可增加轉化生長因子-β（TGF-β）、白細胞介素（IL）-10、CD206 mRNA、CD209 mRNA等M2型巨噬細胞標志物表達，促進其向M2型極化。此外，抑制M2型巨噬細胞miR-21-5p可抑制其表型M2型。而且外泌體miR-21-5p誘導的M2型巨噬細胞可通過釋放TGF-β，進而激活食管癌細胞TGF-β/Smad2/EMT通路，促進其遷移、侵襲能力[17]。

相反，miR-34a、miR-543、miR-765等可通過抑制巨噬細胞M2型極化，發揮抗食管癌作用。如蓋宇等[18]發現，miR-34a在M2型巨噬細胞中的表達顯著低于M1型，過表達miR-34a可顯著降低M2型巨噬細胞標志物CD206、CD163、CCL18、CCL22等的表達，抑制巨噬細胞向M2型極化。將過表達miR-34a的M2型巨噬細胞與食管癌細胞共培養后，可顯著抑制EC109細胞的遷移能力，增加其早期和晚期凋亡率。過表達circRNA TCFL5可通過誘導巨噬細胞向M2型極化促進食管癌細胞Eca109和KYSE150的增殖、侵襲和遷移，而miR-543 mimics則可通過靶向結合circRNATCFL5，抑制巨噬細胞向M2型極化，最終抑制食管癌細胞的惡性生物學行為[19]。lncRNA RP11-465B22.8參與食管癌的發生和發展，在食管癌組織中高表達。在食管癌細胞TE-1和KYSE150中轉染miR-765 mimics可通過靶向吸附lncRNA RP11-465B22.8減弱其對M2型巨噬細胞的極化作用，消除其對食管細胞增殖、遷移和微管形成的增強作用[20]。

2.2.3 miRNAs對食管癌細胞放療抵抗的影響miRNAs通過調節細胞凋亡、與放射相關的通路和細胞周期進程等方式，參與對腫瘤細胞放射敏感性的調控。其中，調控細胞周期是miRNAs影響腫瘤細胞對放療敏感性的主要方式。研究表明，相比正常KYSE150細胞，放療抵抗性食管癌KYSE150細胞（KYSE150R）的細胞周期在G0/G1期受阻、Cyclin D1蛋白水平降低，而miR-193b水平升高。免疫熒光素酶報告實驗表明，miR-193b可通過靶向結合Cyclin D1的3'-UTR端使細胞阻滯于G0/G1期，進而降低食管癌細胞的敏感性[21]。

相反，miRNAs-200c在放療抵抗食管癌患者腫瘤組織及Eca109細胞中低表達，過表達miRNAs-200c可通過下調Cyclin B1、P21和升高P21蛋白誘導細胞周期阻滯，尤其是G2/M期和亞G1期阻滯，從而增強Eca109細胞放射敏感性[8]。miRNAs-30a-3p在EC9706和EC109細胞株中表達顯著低于食管正常上皮細胞，并與腫瘤細胞的放射敏感性有關，即miRNAs-30a-3p可通過靶向食管癌細胞 IGF-1R的3'-UTR端降低IGF-1R mRNA和蛋白表達提高EC9706和EC109對射線的敏感性，從而降低基質金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9蛋白表達，使細胞阻滯于G1期，抑制細胞增殖，降低EMT標志蛋白N-cadherin和vimentin表達，升高E-cadherin蛋白表達，發揮抑制腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移能力[22]。過表達miR-301a介導的WNT1抑制能通過降低轉錄因子4（TCF4）和Cyclin D1的mRNA表達干擾細胞周期，從而增強KYSE150R細胞對放射線的敏感性，抑制細胞活力和侵襲能力。反之，干擾miR-301a可降低放射敏感性KYSE150細胞對放射線的敏感性，增強其增殖和遷移能力[23]。

2.2.4 miRNAs對食管癌細胞化療抵抗的影響食管癌在診斷時多處于中晚期，錯過手術治療的最佳時機，臨床多采用化療結合放療的手段進行治療。然而，在持續性治療中，機體常產生一定的耐藥性，腫瘤細胞對藥物的敏感性降低，難以維持治療。miRNAs作為腫瘤治療的新興靶點，在食管癌化療抵抗中發揮重要作用。彭潔[24]研究發現，紫杉醇處理的耐藥食管癌TE-1細胞中18個miRNAs上調，28個miRNAs下調。沉默miR-378d后的細胞系 TE-1、KYSE150較對照組細胞均有顯著的5-FU和順鉑耐藥性，表現為細胞半數致死量升高、克隆形成能力增強、細胞骨架重排（肌動蛋白絲骨架以及更延展的形態）、以TE-1細胞系差異最顯著。雙熒光素酶基因報告表明，沉默miR-378d而導致的細胞化療藥物抵抗是由于miR-378d水平降低，其靶向結合AKT基因的3'-UTR抑制AKT-β-catenin通路作用減弱而導致的。miR-29c在5-FU耐藥食管癌細胞（KYSE150FR、KYSE410FR）水平較親本細胞KYSE150、KYSE410顯著降低，過表達miR-29c可逆轉KYSE150FR和KYSE410FR細胞對5-FU的耐藥性，抑制細胞增殖和活性。相反，敲低miR-29c可進一步加重KYSE150、KYSE410細胞對5-FU的抵抗性，增強細胞活力和增殖能力[10]。

相反，miR-21在食管癌細胞株TE-1和Eca109/CDDP（順鉑抵抗細胞株）中表達顯著高于正常食管上皮細胞Het-1A，且在順鉑抵抗的癌細胞株中表達更高。過度表達miR-21可降低食管癌細胞對順鉑的敏感性，抑制miR-21可增強TE-1對順鉑的敏感性，雙熒光素酶報告證實，miR-21降低食管癌細胞對順鉑的敏感性是通過靶向程序化細胞死亡4（PDCD4）基因的3'-UTR端進而抑制其轉錄和翻譯產物實現的[25]。較之正常食管上皮細胞和組織，miR-10b在食管癌細胞EC109、TE10和組織中高表達，且miR-10b介導的PPARγ抑制能通過激活AKT/mTOR/P70S6K信號通路，增強腫瘤細胞的順鉑抵抗。干擾miR-10b表達可增強腫瘤細胞對順鉑的敏感性，從而抑制EC109和TE10細胞活力和克隆形成能力、降低順鉑的半抑制濃度（IC50）值、抑制Bcl-2蛋白表達、升高Bax蛋白表達，最終促進腫瘤細胞凋亡[11]。

綜上，部分參與的miRNAs對食管癌的影響的匯總情況見表1。

3 中醫藥經miRNAs干預食管癌的作用機制

食管癌屬中醫學“噎膈”范疇，是“風、癆、臌、膈”四大頑癥之一?！耙酢辈∫驈碗s，體虛外感、七情內傷、飲食不節等致氣、痰、瘀、熱交阻，津氣耗傷，食管梗阻成病。中醫藥防治食管癌以辨證論治為主，在應用方面涉及單味中藥及有效成分、中藥復方等，多從清熱解毒、化痰散瘀、益氣活血、解毒散結等方面入手，結合手術、放療或化療，以降低術后不良反應、減輕放化療抵抗和相應不良反應的發生率[26]。

3.1 中藥單味藥及提取物

藤梨根是獼猴桃科植物中華獼猴桃植物的干燥根，首次記載于《開寶本草》?，F代研究表明，藤梨根活性成分對多種惡性腫瘤有防治作用，其抗腫瘤機制主要包括抑制腫瘤細胞增殖生長、誘導細胞凋亡、阻滯細胞周期，抑制腫瘤血管生成等[27]。研究顯示，藤梨根提取物在一定濃度范圍內可以上調miR-451的表達水平，從而對細胞株內CDKN2D、AKT、BCL-2等DNA表達基因進行調節，腫瘤細胞的分裂多停留在DNA合成前期，進而削減細胞的侵襲能力，促使腫瘤細胞凋亡速度加快[28-29]。

毛葉香茶菜是一種少見的中草藥，其活性提取物表諾多星（epinodosin，EP）是具有抗腫瘤活性的五環二萜類化合物。李亞妹[30]發現，EP在4種食管鱗癌細胞中均可誘導miR-143-3p的表達，降低靶向基因Bcl-2的表達量；此外，還可顯著抑制MAPKs信號通路蛋白p-ERK1/2、p-JNK、p-p38的表達，抑制MAPKs信號通路的激活，抑制食管鱗癌細胞的增殖、遷移與侵襲。

南蛇藤是我國傳統中藥，在我國分布廣泛，其根、莖、葉均可入藥，具有活血、解毒、祛風、消腫的功效。于耀洋等[31]將miR-302體外轉染至食管癌TE-1細胞，與南蛇藤提取物（COE）聯合作用于TE-1細胞，發現COE和過表達miR-302可抑制PI3K/Akt信號通路的激活，從而抑制TE-1細胞增殖、侵襲和遷移，且兩者聯合使用效果強于單一因素作用。提示COE聯合miR-302能夠協同抑制食管癌TE-1細胞增殖、侵襲和遷移。

丹參酮ⅡA（tanshinone IIA，TSⅡA）是丹參的主要有效成分之一，向文杰[32]發現將其與硒-甲基硒代半胱氨酸（se-methylselenocysteine，MSC）聯合使用能顯著上調抑癌基因miR-203a-3p的表達水平，且相比于同等劑量的丹參酮ⅡA差異有統計學意義，miR-203a-3p能調控GATA6從而抑制ESCC細胞的增殖和侵襲，而MSC顯著有效地放大了丹參酮ⅡA對腫瘤細胞增殖活力的抑制能力，miR-203a-3p很有可能是發揮該作用的重要因子。

3.2 中藥復方

啟膈散記載于《醫學心悟》，為治療“噎膈”之名方，臨床常用于食管癌的治療，其藥方含丹參、沙參、川貝母、茯苓、砂仁、郁金，為行氣化痰法代表方劑。miR-133a/PI3K/Akt等信號通路是影響食管鱗癌發生、發展的重要信號通路。研究顯示，啟膈散能通過調控食管癌EC9706細胞miR-133a/PI3K/Akt信號環路甲基化，促進miR-133a在腫瘤細胞的表達，抑制PI3K/Akt信號通路的激活；下調哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的蛋白表達，抑制食管癌EC9706細胞的增殖[33-34]。啟膈散與順鉑聯用在抑制食管癌細胞EC9706增殖方面具有協同作用，其機制可能與抑制miR-21表達從而升高PDCD4和PTEN基因表達相關[35]。

六君子湯作為健脾和胃的經典代表方，臨床應用廣泛，是治療和輔助治療食管癌的有效方藥，其搭配營養管理能夠減輕患者放化療毒副作用，改善患者的營養和免疫狀態[36]。miR-34a/STAT3/IL-6R反饋環在多種類型腫瘤中存在，與癌癥的侵襲與轉移、免疫抑制等相關，六君子湯可通過提高miR-34a的表達，逆轉IL-6R/STAT3信號通路介導的miR-34a抑制，從而抑制免疫檢查點PD-L1的表達，抑制免疫逃逸，調節機體免疫反應，介導腫瘤的發生發展，參與腫瘤微環境免疫抑制[37]。

消癌解毒方是國醫大師周仲瑛教授結合多年臨床經驗總結而形成的有效驗方，抗腫瘤效果顯著，該方與化療藥聯用，有提高腫瘤化療療效的作用。丁艷[38]發現，食管癌患者血清中miR-223-3p和miR-151a-5p高表達，并與淋巴結轉移和腫瘤浸潤深度有關，中藥消癌解毒方聯合放療可降低患者血清中miR-223-3p和miR-151a-5p水平，減輕臨床癥狀，提高生活質量。

綜上，不同中藥抑制食管癌的作用機制歸納總結見表2。

表2 不同中藥通過miRNAs抑制食管癌的作用機制Tab 2 Mechanism of different Chinese medicines in inhibiting esophageal cancer via miRNAs

4 總結和展望

食管癌發病隱匿、早期癥狀不典型，是導致其確診時已處于中晚期的主要原因，因此有必要尋找敏感性高的生物標志物，以便在食管有癌變趨勢或腫瘤早期進行干預，降低食管癌發病率和減緩惡性進展速度。miRNAs在基因表達調控中起著至關重要的作用，更是腫瘤診斷、治療和預后的潛在標志物和治療靶點。中醫藥作為我國傳統醫學中的特色，可調控相關miRNAs影響Bax/Bcl-2、ERK/MAPK、AKT/mTOR/P70S6K、PTEN/PI3K、TGF-β/Smad2/ EMT等信號通路，腫瘤微環境中巨噬細胞與腫瘤細胞交叉通路等參與食管癌的發生發展，為臨床治療提供新方法、新思路。