麻石清肺合劑HPLC指紋圖譜的建立及7種成分含量測定

王博，吳茱萸，裴媛，于曉濤，王瑞（漯河市中心醫院，河南 漯河 462000）

麻石清肺合劑來源于《傷寒論》“麻杏石甘湯”[1]，由麻黃、厚樸、甘草、苦杏仁等中藥組成，具有清肺熱、化濁痰的功效，主要用于肺炎、慢性支氣管炎等肺病患者痰熱郁肺證。中藥飲片由于產地不同、炮制加工方式不同等多方面因素的影響，導致品質參差不齊[2]。中藥復方制劑受制劑生產多個環節的影響，加之其本身成分的復雜性，其質量的均一穩定直接影響藥效，因此對其進行整體質量控制尤為重要[3]。指紋圖譜能夠對中藥及中藥復方中化學成分進行系統、整體的表征，呈現專屬性強、穩定性高等特點[4]，在中藥材、飲片及復方制劑的品質評價中得到了廣泛應用[5-7]。結合化學模式識別，可以簡化數據結構，更加直觀深入地評判樣本的質量，篩選差異化合物[8]。本文將通過HPLC法建立麻石清肺合劑指紋圖譜，聯合聚類分析等多元統計方法對其進行分析，同時測定麻石清肺樣品中鹽酸麻黃堿等7種成分的含量，為麻石清肺合劑全方位的品質評價提供基礎。

1 材料

1.1 儀器

HPLC色譜儀（Agilent科技公司，1260型），電子天平（日本島津公司，AUW-120D型），CJ-020S型超聲機（深圳市超潔有限公司），超純水過濾系統（密理博公司）。

1.2 試藥

對照品鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、甘草苷、和厚樸酚、厚樸酚（中國食品藥品檢定研究院，批號分別為171241-201809、171237-201510、111610-201908、110730-201915、110729-202015，純度均大于95%），苦杏仁苷（批號為DST190829-004）、甘草酸（批號為MUST-19052407）（純度均大于98%，成都曼思特公司）。乙腈（色譜純，美國TEDIA公司）；磷酸（色譜純，天津科密歐公司）；水為自制超純水。

12批麻石清肺合劑為漯河市中心醫院自制（批號分別為20220120、20220217、20220314、20220407、20220428、20220518、20220613、20220705、20220801、20220906、20220929、20221018，編號S1～S12）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX SB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相A為0.1%磷酸-水溶液，B為乙腈，梯度洗脫，洗脫程序見表1；檢測波長210 nm；流速1.0 mL·min－1；柱溫30℃；進樣量5 μL。

表1 梯度洗脫方法Tab 1 Gradient elution method

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 精密稱取各對照品適量，加50%甲醇分別配制成鹽酸麻黃堿292.600 μg·mL－1、鹽酸偽麻黃堿175.480 μg·mL－1、苦杏仁苷1248.000 μg·mL－1、甘草苷192.000 μg·mL－1、甘草酸298.080 μg·mL－1、和厚樸酚14.826 μg·mL－1、厚樸酚25.338 μg·mL－1的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取麻石清肺合劑100 μL，加80%甲醇900 μL稀釋10倍，搖勻后用0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按麻石清肺合劑處方工藝制備缺麻黃、厚樸、苦杏仁、甘草的陰性樣品，并稀釋10倍制備陰性樣品溶液。

2.3 麻石清肺合劑HPLC指紋圖譜的建立

2.3.1 方法學考察 取S1麻石清肺樣品100 μL制備成供試品溶液，連續6次進樣考察精密度；平行制備6份麻石清肺樣品S1供試品溶液，進樣檢測考察重復性；取麻石清肺樣品S1供試品溶液，放置0、3、6、9、12、24 h分別進樣測定，考察樣品24 h內穩定性。結果精密度試驗、重復性試驗、穩定性試驗得到的各共有峰相對保留時間RSD均小于1.8%，相對峰面積RSD均小于3.0%。

2.3.2 指紋圖譜的構建 取12批麻石清肺合劑供試品溶液，進樣檢測并采集數據。運用2012版《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》以S1樣品為參照圖譜，生成對照指紋圖譜，見圖1，共標定16個共有峰。得到樣品S1～S12的相似度分別為0.982、0.900、0.986、0.992、0.976、0.937、0.968、0.980、0.989、0.975、0.979、0.991。

圖1 12批麻石清肺合劑的HPLC指紋圖譜Fig 1 HPLC fingerprints of 12 batches of Mashi Qingfei mixture

2.4 化學模式識別分析

2.4.1 聚類分析 將12批麻石清肺合劑的16個共有峰數據導入SPSS 25.0軟件，采用組間聯結法聚類分析，以平方歐氏距離為區間，見圖2。當平方歐氏距離為10時12批樣品分為4類，第1類為S2，第2類為S5、S6，第3類為S3、S12，第4類為S1、S4、S7～11。

圖2 麻石清肺合劑樣品聚類分析樹狀圖Fig 2 Mashi Qingfei mixture sample clustering analysis

2.4.2 主成分分析 對12批麻石清肺合劑中16個共有峰數據采用SPSS 25.0軟件進行因子分析。結果見表2，有4個主成分的特征值大于1，方差貢獻率累計達到85.6%，表明其包含了85.6%的色譜圖信息。峰2、5～7、9、13在主成分1上具有較高的載荷（分別為0.812、0.768、0.875、0.807、0.791、0.750），其代表了主成分1的主要信息；主成分2主要代表了峰1、15、16（分別為0.787、0.967、0.941）；主成分3主要代表了峰3、4、11、12（分別為0.923、0.928、0.513、0.679）；主成分4主要代表了峰8、10、14（分別為0.766、0.880、0.850）。

表2 12批麻石清肺合劑中的主成分特征值及方差貢獻率Tab 2 Characteristic value and contribution rate of 12 batches of Mashi Qingfei mixture

2.4.3 正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）以12批麻石清肺合劑中16個共有峰峰面積為變量，構建12×16的原始數據矩陣，采用SIMCA 14.1軟件進行OPLS-DA分析，結果見圖3、4。8、7（苦杏仁苷）、3（鹽酸麻黃堿）、9、10（甘草苷）、4（鹽酸偽麻黃堿）、6號峰的VIP值均大于1.0，這7種成分可能為麻石清肺樣品的差異性成分。

圖3 正交偏最小二乘判別分析得分矩陣圖Fig 3 OPLS-DA score plot

圖4 麻石清肺合劑樣品中16個共有峰的VIP圖Fig 4 VIP of 16 common peaks of Mashi Qingfei mixture

2.5 多成分含量測定

2.5.1 色譜條件 色譜柱為Agilent ZORBAX SB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相A為0.1%磷酸-水溶液，B為乙腈，梯度洗脫程序見表3；流速1.0 mL·min－1；柱溫30℃；進樣量5 μL。檢測波長：0～47 min，210 nm（鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷）；47～75 min，237 nm（甘草苷）；75～95 min，251 nm（甘草酸）；95～125 min，210 nm（和厚樸酚、厚樸酚）。

表3 梯度洗脫方法Tab 3 Gradient elution method

2.5.2 專屬性考察 取混合對照品溶液、S1供試品溶液、陰性樣品溶液適量進樣，得到各色譜圖見圖5，結果顯示陰性樣品不干擾樣品中7種成分的測定。

圖5 對照品溶液、S1供試品溶液和陰性樣品溶液（缺麻黃、苦杏仁、甘草、厚樸）色譜圖Fig 5 HPLC chromatograms of reference solution，S1 sample solution and negative sample solution（without Ephedrae Herba，Armeniacae Semen Amarum，Glycyrrhizae Radix Et Rhizoma，or Magnoliae Officinalis Cortex）

2.5.3 線性關系考察 精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，分別用50%甲醇稀釋成系列對照品溶液，進樣并記錄各濃度下色譜峰面積。以峰面積為縱坐標（Y）、各成分的質量濃度為橫坐標（X）進行線性擬合。同時測定鹽酸麻黃堿等7種成分的定量限[LOQ，信噪比（S/N）＝10]和檢測限（LOD，S/N＝3），結果見表4。

表4 7種成分的回歸方程與線性范圍Tab 4 Regressive equations and linear ranges of 7 components

2.5.4 方法學考察 用50%甲醇稀釋“2.2.1”項下混合對照品溶液，稀釋5倍后連續進樣6次考察儀器精密度。取S1樣品溶液6份，平行制備成供試品溶液，進樣測定，并計算7種成分含量考察方法重復性。取S1樣品溶液，制備后于0、2、4、8、12、24 h進樣測定考察穩定性。取S1樣品溶液6份，精密加入含鹽酸麻黃堿63.840 μg·mL－1、鹽酸偽麻黃堿35.096 μg·mL－1、苦杏仁苷265.600 μg·mL－1、甘草苷38.400 μg·mL－1、甘草酸57.960 μg·mL－1、和厚樸酚3.163 μg·mL－1、厚樸酚5.562 μg·mL－1的混合對照品溶液，按“2.2.2”項下方法制備，進樣測定，計算回收率。結果精密度試驗中7種成分的峰面積RSD均在1.0%～1.3%；重復性試驗中7種成分含量的RSD均在0.49%～2.8%；穩定性試驗中7種成分峰面積的RSD均在1.2%～2.8%。7種成分的平均加樣回收率為98.12%～101.55%，RSD為1.8%～2.9%。

2.5.5 含量測定 取12批麻石清肺合劑樣品，制備成供試品溶液進樣，并計算12批樣品中各成分的含量，結果見表5。

表5 7種成分的含量測定結果(n＝3，μg·mL－1)Tab 5 Content of 7 components (n＝3，μg·mL－1)

3 討論

本研究考察了水、甲醇、80%甲醇等不同類型提取溶劑對樣品的影響，發現80%甲醇為提取溶劑時色譜峰響應較大、峰數較多?？疾炝薎nertsil ODS-3 C18、Shimadzu shim-pack GIST C18、Agilent ZORBAX SB C18不同色譜柱，結果顯示Agilent ZORBAX SB C18色譜柱峰形最好。比較210、230、254、280 nm不同檢測波長，發現樣品在210 nm下出峰數目最多，故選擇指紋圖譜的檢測波長為210 nm，同時在多成分含量測定方法中分別選擇化合物各自的最大吸收波長，鹽酸麻黃堿、和厚樸酚、鹽酸偽麻黃堿、厚樸酚、苦杏仁苷為210 nm，甘草苷為237 nm，甘草酸為251 nm，多波長切換進行檢測。同時由于指紋圖譜在210 nm下色譜峰較多，因此其色譜條件梯度變化較緩，時間較長，考慮到后續的多成分含量測定需進行方法學考察及樣品含量的測定，為節約分析時間，在保證7種成分分離度的前提下對色譜條件的梯度進行了調整。

本研究建立了12批麻石清肺合劑的指紋圖譜，相似度以對照指紋圖譜為參考在0.900～0.992，表明這12批樣品質量相對穩定。結合聚類分析、OPLS-DA等化學計量學方法對其進行分析，結果不同批次樣品呈現一定的差異，篩選出7個共有峰VIP值大于1，分別為8、7（苦杏仁苷）、3（鹽酸麻黃堿）、9、10（甘草苷）、4（鹽酸偽麻黃堿）、6號峰。本方中麻黃指標成分為鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿，具有止咳平喘、抗病毒、抗炎等功效[9-10]；苦杏仁中主要成分為苦杏仁苷，在體內緩慢分解為氫氰酸，從而舒張支氣管平滑肌，發揮止咳平喘的作用[11]；甘草中的甘草苷、甘草酸抗病毒、抗腫瘤、免疫保護等活性較強[12-13]；厚樸中的和厚樸酚、厚樸酚具有腸道保護、抗病毒等作用[14-15]；依據本方君臣佐使配伍原理及主要藥效成分選擇此7種成分進行定量。12批麻石清肺合劑的含量測定結果表明不同批次間7種成分含量存在一定的差異，考慮到與所用飲片產地、批次、廠家、制劑加工等因素有關，提示在今后的生產中可以固定飲片產地、廠家，控制生產參數等因素的影響，以保證制劑質量的均一穩定。

綜上所述，本研究所建立的指紋圖譜和含量測定方法穩定可行，聯合模式識別可為麻石清肺合劑的質量評價提供依據。