豆科牧草抗逆基因工程研究進展

朱雅欣，伍國強，魏 明

（蘭州理工大學生命科學與工程學院, 甘肅 蘭州 730050）

豆科牧草因其蛋白質含量高、適口性好、能與根瘤菌共生、生物固氮等特點，在我國北方干旱、半干旱地區被廣泛種植，成為當地主導產業之一。優質、高產、抗逆性強的牧草新品種是我國畜牧業發展的基礎，也是改善我國退化草地的需要，關系到國家的糧食安全和生態安全[1]。然而，我國畜牧業集中的西北地區氣候環境惡劣、土地貧瘠，牧草生長面臨著嚴重逆境脅迫。以病原體感染和昆蟲侵害導致的宿主植株生物量減少甚至死亡及食草動物過度啃食導致的植物生長發育遲緩、植被退化的生物脅迫和干旱、鹽堿、冷害、紫外線、重金屬毒害等非生物脅迫為主[2]，其中干旱、鹽堿、極端溫度是影響植物分布、限制農作物產量和威脅糧食安全的主要因素。因此，有必要培育抗逆性強的豆科牧草以滿足我國畜牧業不斷增長的高品質飼草的需求[3]。

傳統育種方法周期長、效率低，難以獲得高品質牧草。采用多種方法修改基因組DNA 序列的基因工程技術可解決這一問題[4]。隨著基因工程的發展，轉基因技術大大縮短了傳統育種的周期，并使人們能夠按照需求將特定基因在不同植物中表達，為豆科牧草的抗逆性遺傳改良提供新思路。例如，苜蓿(Medicago)和大豆(Glycine max)突變文庫的構建和基于CRISPR/Cas9 系統的高效基因組編輯方案的建立為豆科牧草的研究和分子育種提供了關鍵基礎[5-6]。隨著基因工程技術的研究不斷深入，除了作為飼草，牧草相關產品在環保和食品領域發揮著重要作用，包括作為景觀植物、參與土壤修復、功能性食品研發等[7]。因此，利用基因工程技術改良豆科牧草的抗逆性具有重要的現實意義。

1 豆科牧草轉基因技術

1.1 豆科牧草再生體系

優良基因遺傳改良作物的前提是構建高效、成熟的組織培養和植株再生體系。組織培養是利用植物細胞的“全能性”特點，將分離出的植物組織、細胞、原生質體等置于適宜條件下，誘發其形成愈傷組織，并進而獲得完整植株[8]。其主要包括選取外植體、選擇培養基、確定植物生長調節劑的種類及濃度等關鍵技術和環節。一般來說，可用于誘導愈傷組織的外植體有真葉、葉柄、子葉、子葉節、下胚軸和根等；不同物種間甚至同一物種不同品種間，出愈率高、愈傷生長狀況良好的外植體材料也不盡相同[9-12]?？导t霞等[13]研究發現，豆科“牧草皇后”紅豆草(Onobrychis viciaefolia)的上胚軸、真葉和下胚軸均可誘導形成愈傷組織，其中下胚軸愈傷生長松散、芽點多，而真葉形成的愈傷出芽快、玻璃化率低。另外，不同物種間植株再生體系周期差別不大，需要60～70 d。激素在整個再生過程中扮演著重要角色，可在MS、SH、B5 等基本培養基上有選擇地添加生長素和細胞分裂素，探索合適的激素種類、配比和濃度。常用的生長素有2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-dichlorophenoxyacetic acid, 2,4-D)、 萘 乙 酸(naphthlcetic acid, NAA)、吲哚乙酸(3-indoleacetic acid,IAA)等，細胞分裂素有6-糠氨基嘌呤(kinetin, KT)、玉米素(zeatin, ZT)、6-芐氨基嘌呤[N-(phenylmethyl)-9Hpurin-6-amine, 6-BA]、異戊烯腺嘌呤(z-ip)等[14-15](表1)。

表1 不同豆科牧草的再生體系Table 1 Regeneration systems of different legume forages

1.2 豆科牧草遺傳轉化方法

遺傳轉化是植物科學領域功能基因組學研究和分子育種的關鍵技術，可在植物特殊的發育階段或成熟的植物組織培養體系基礎上利用分子生物學工具將重組DNA 導入生物體[16](表2)。開發安全、高效、新穎的遺傳轉化方法已成為基因工程、分子生物學和遺傳育種領域的研究熱點。目前常用的遺傳轉化方法有DNA 直接導入法和農桿菌(Agrobacterium)介導法。

表2 豆科牧草遺傳轉化方法Table 2 Methods for the genetic transformation of legume forages

1.2.1 直 接導入法

外源基因直接導入法是利用基因槍、顯微注射、電激等方式(表2)，把外源目的基因導入受體細胞，繼而得到轉基因植株的方法。Pereira 和Erickson 等[22]采用基因槍法把nptⅡ導入苜蓿，獲得了7 株陽性植株。粒子槍轟擊法在鷹嘴豆(Cicer arietinum)高頻轉化研究中，金微載體因惰性對細胞毒性較小且比鎢載體有更高的轉化效率?；驑尫ㄞD化效率與農桿菌轉化法相比仍需優化，且外源基因導入細胞后存在沉默且拷貝數不穩定的問題。顯微注射法是把基因包裹在重金屬粒子上，脫水后將其高速推進細胞內；具有物種獨立性、操作簡單、基因傳遞量大等優點[18]。電激法在電場脈沖作用下，基因通過瞬時氣孔轉移到細胞質中；具有快捷、經濟、效率高等特點[19]。DNA 直接轉化法早期主要用于單子葉植物以及部分不適合用農桿菌轉化的植物的遺傳轉化，該方法逐漸被農桿菌轉化法取代[23]。

1.2.2 農 桿菌介導法

Horsch 等[24]在植物組織培養技術的條件下創造了農桿菌轉化法。實驗室常用農桿菌菌株有發根農桿菌(A.rhizogenes)和根癌農桿菌(A.tumefaciens)，當農桿菌侵染外植體傷口時，在植物傷口分泌的小分子酚類化合物的誘導下Ti 質粒產生的T-DNA 單鏈分子可進入并整合到植物細胞染色體上。Deak等[25]首次將該方法用于紫花苜蓿遺傳轉化研究并得到首株轉基因紫花苜蓿植株。農桿菌介導法具有效率高、成本低、轉化穩定等優點(表2)。因此，在轉基因牧草的研究中得到了廣泛應用。植物逆境生理與基因工程課題組前期也利用該方法，將甜菜(Beta vulgaris)蔗糖非發酵-1-相關蛋白激酶 2(sucrose non-fermenting-1-related protein kinase 2,SnRK2)基因轉入紅豆草并獲得陽性植株，為培育紅豆草新品種(系)提供新種質材料。

另外，真空滲透、超聲輔助和熱處理等手段也可提高農桿菌的遺傳轉化效率[26-27]。功能性肽聚合物包埋碳納米管載體可克服分子傳遞過程中細胞壁屏障對生物分子的阻礙作用[28]。質體轉化技術則解決了部分植物核基因組不易整合目的基因的問題[29]。外源添加促誘導因子如氧化鐵納米顆粒(iron oxide nanoparticles, IONPs)可提高遺傳轉化效率[30]。納米材料具有物種獨立性、操作簡單、生物相容性、裝載力高、轉化效率高等優勢[16]。隨著生物技術的不斷發展，農桿菌介導法在植物遺傳轉化上的應用將不斷擴大。

2 豆科牧草抗逆基因工程

2.1 豆科牧草抗生物逆境基因工程

病蟲害是牧草生產所面臨的主要生物脅迫，可直接導致牧草的減產甚至死亡。牧草在栽培過程中主要受到葉點霉葉斑病(Phyllosticta)、根腐病(Fusariumsolani)、棉鈴蟲(Heliothis armigera)、蚜蟲(Aphidoidea)等病蟲害的影響。在儲存條件下，馬蹄金甲蟲(Coleoptera)也會造成收獲的農產品大量損失。為了防治害蟲，人們不得不采用化學法來確保牧草產量，但化學農藥對生態環境以及昆蟲種群內抗性演變的影響卻是不可避免的[31]。在使用抗菌劑后，細菌蛋白質的改變、酶的降解以及膜對抗菌劑通透性的改變等會使細菌產生耐藥性。

為抵御生物脅迫，植物在進化過程中產生了特定抗性(resistance, R)蛋白。在感染宿主過程中，病原體產生的效應分子可阻礙植物細胞表面模式識別受體(pattern-recognition receptors, PRRs)識別病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular pattern,PAMP)以抑制植物抗性[32]，此時R 蛋白可為植物提供針對特定病原體效應物的保護。因此，編碼R 蛋白的基因被廣泛用于植物對特定病原體抗性的研究中[33-34]。如，蒺藜苜蓿(M.truncatula)RCT1的表達使三葉草(Frifolium)獲得了對炭疽病(Colletotrichum trifolii)的抗性[35]。但由于病原體進化得相當快，這種由一個基因控制，簡單實現特定抗性的方法很難賦予植物穩定的長期抗性。因此，聚合水稻(Oryza sativa)R基 因 和 數 量 性 狀 位 點(quantitative trait loci,QTL)同時發揮作用增強豆科牧草中R 蛋白耐受性和抗性的研究[36]為豆科牧草R 蛋白的應用提供新思路。除此之外，培育抗病豆科牧草還可從蛋白酶、α-淀粉酶抑制劑、凝集素、幾丁質酶和多酚氧化酶等五大類植物防御肽入手[37]。

2.1.1 生 物毒素

植物在自然界長期進化過程中，產生各種生物毒素，以抵御高等動物或疾病的侵襲，使自己免受傷害。其中，抗菌肽(antimicrobial peptides, APM)作為植物先天免疫系統中的關鍵組成部分，是植物為對抗病原體、適應陸地生活而進化的。APMs 為廣譜抑菌劑，可調節細菌、真菌、原生動物、植物、昆蟲和動物等各種生物的免疫系統，且幾乎無毒副作用[38]。Mustafa 等[39]分析了10 種AMP 與不同多藥耐藥菌株的結合模式，發現蛇皮肽(snakin-1, SN1)抑菌效果最佳。過量表達紫花苜蓿MsSN1的轉基因植株對引起炭疽病的炭疽菌和引起葉斑病的莖點霉均有明顯的抗性，受感染的葉片數顯著低于野生型植株[40]。此外，過量表達異黃酮甲基轉移酶(isoflavone O-methyltransferase,IOMT)基因使得苜蓿受到苜蓿莖點霉侵染后，葉片中抗毒素積累量增加，對該病原體的抗性顯著增強[41]。苜蓿遭受薊馬(Thrips alliorum)危害后，植株體內類黃酮和異黃酮顯著富集[42]，表明過量表達IOMT有望用于薊馬防治。研究表明，外源基因同樣可賦予豆科牧草抗生物脅迫的能力。在紫花苜蓿中異源表達花生(Arachis hypogaea) 白藜蘆醇合酶(resveratrol synthase,RS)基因可使轉基因植株積累白藜蘆醇衍生物(反式白藜蘆醇)，并對真菌莖點霉的抗性顯著增強，且無任何負面形態學影響[43]。這些結果表明，生物毒素的研究為提高豆科牧草抗生物脅迫能力奠定理論基礎。

2.1.2 酶類

植物細胞分泌的幾丁質酶參與植物的生長發育，當植物遭遇真菌感染時，則可消化真菌細胞壁中的幾丁質，是生物防治病害的手段之一[44-45]。Tesfaye 等[46]研究發現，轉基因苜蓿植株地上部和根部分泌物中的幾丁質酶不僅保留對乙二醇幾丁質的裂解活性，而且還顯著抑制苜蓿莖點霉和刺盤孢菌(Sclerotinia sclerotiorum)兩種真菌病原體的孢子萌發。溶菌酶本身是一種天然無毒性卻能夠使目標微生物細胞壁溶解而使其喪失活性的蛋白質，對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都有效[47]。對含有厚肽聚糖的革蘭氏陽性菌，溶菌酶主要通過水解肽聚糖層中存在的N-乙酰壁酸和N-乙酰葡萄糖胺單元之間的β 鍵來使細菌失活[48]；對于革蘭氏陰性菌，通常是存在金屬離子螯合劑的情況下通過破壞外膜的穩定性達到殺菌目的[49]。張靜[12]采用農桿菌介導法將LYZ-GFP雙元基因導入3 個苜蓿品種，并獲得了含有溶菌酶基因的轉基因植株。這些結果表明，過量表達幾丁質酶、溶菌酶等酶類編碼基因可顯著增強豆科牧草的抗病性。

2.1.3 酶 抑制劑

植物分泌酶抑制劑如單寧，抑制昆蟲生長所需的酶的活性。與抗蟲密切相關的縮合單寧能與昆蟲體內的消化酶結合并沉淀蛋白質，抑制消化酶活性，賦予植物抵御蟲害的能力[50]。董文科等[51]將紅豆草OvBAN/bar轉入紫花苜蓿中，盡管轉基因株系拷貝數不同，但與野生型相比均有較高的花青素還原酶活性及縮合單寧含量，對蚜蟲的抑制率高達78%～93%。由此表明，提高酶抑制劑含量可顯著增強轉基因植株的抗蟲性。

另外，豆科牧草害蟲之一的棉鈴蟲對蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)編碼的δ-內毒素敏感。從菜豆(Phaseolus vulgaris)中分離出來的α-淀粉酶抑制劑基因αAI1，能有效控制布魯氏菌[52]。αAI1可抑制綠豆象(Callosobruchus chinensis)和四紋豆象(Callosobruchus maculatus)腸道中淀粉酶活性，攝入該蛋白質會導致布魯氏菌的緩慢生長和死亡，這在轉基因鷹嘴豆進行的昆蟲生物測試中得以印證[53]。過量表達CryIC的轉基因苜蓿對灰翅夜蛾(Spodoptera litura)和小菜蛾(Plutella xylostella)的抗性顯著增強[54-55]。另外，將Cry1Ac轉入鷹嘴豆后，棉鈴蟲和灰翅夜蛾對種子的侵害降低至7%[22,56]。然而，只表達一個cry的轉基因作物可能會導致抗性棉鈴蟲種群的進化。篩選表達更高毒性蛋白的菌株[57]，改進Bt 蛋白表達方式[58]，培育不同cry突變體菌株[59]，可為α-淀粉酶抑制劑在豆科牧草抗蟲害的研究提供更多思路。另外，兼備殺菌和殺蟲特性的CLP基因通過抑制真菌木聚糖酶抑制真菌生長[60]，也已用于轉基因植物開發[61]。

2.1.4 凝 集素

面對生物安全問題，人們賦予毒性水平低的凝集素較高期望。凝集素是不具有酶活性的蛋白質，由一個或多個凝集素結構域組成，具有特異性識別并可逆結合碳水化合物結構，且不改變碳水化合物組成部分的能力[62]。豆科植物凝集素結構域通常含有Mn2+、Ca2+等金屬離子，是唯一需要金屬離子才能發揮活性的凝集素結構域[63]。凝集素具有不同的分子結構、生化和生物物理特性，因而也具有不同的生物學功能，但結構域與其特異性之間沒有明確的相關性[64]。在植物抵抗生物脅迫時，凝集素的凝集活性與識別紅細胞表面的碳水化合物結構有關[65]。豆蚜(Aphis craccivora)是影響鷹嘴豆生長的害蟲之一，它以韌皮部為主要入侵點，吸食植株體內汁液。大蒜(Allium sativum)凝集素基因遺傳改良后的鷹嘴豆在韌皮部特異性啟動子rolC的控制下，可在取食部位特異性地靶向毒素，使豆蚜存活率和繁殖力分別下降到11%～26%和22%～42%[66]。利用位點突變技術，特異性地改變凝集素構象還可提高凝集素毒性，進一步控制豆科牧草病蟲害[67]，也為豆科牧草抗蟲性遺傳改良提供理論支撐。

2.2 豆科牧草抗非生物逆境基因工程

干旱、寒冷、鹽堿等是牧草生長面臨的主要環境因素[68-69]，也是人們培育優良牧草所面臨的重要問題。干旱脅迫可引起滲透脅迫初級信號，鹽脅迫可同時給植物帶來滲透脅迫和離子毒害雙重壓力。干旱和鹽脅迫都能引發氧化脅迫、脂膜破壞、蛋白質及核酸變化等次級信號，從而引起代謝紊亂以至影響植株生長發育[70]。

2.2.1 抗 旱基因工程

大量研究表明，過量表達抗旱基因可顯著提高豆科牧草的抗旱性(表3)。將霸王(Zygophyllum xanthoxylon)ZxABCG11轉入紫花苜蓿后，發達的角質層結構可減少植物表皮的蒸騰作用從而提高苜蓿的抗旱能力[71]。ABP9通過正向調節脫落酸(abscisic acid, ABA)信號來增強植物對多種脅迫的耐受性[72]。過量表達玉米(Zea mays)ZmABP9可使轉基因苜蓿的耐旱性顯著增強[73]。此外，過量表達擬南芥(Arabidopsis thaliana)AtDREB1A可降低轉基因鷹嘴豆在干旱脅迫下的蒸騰作用，增加生物量向地上部的分配，改變生根模式[74]。這些結果表明，轉錄因子對豆科牧草表皮蒸騰作用的調節在植物抵御干旱脅迫過程中非常重要。

表3 豆科牧草抗逆基因工程研究Table 3 Studies on resistance gene engineering of legume forages

4CL 是木質素生物合成途徑中參與苯丙烷代謝的關鍵酶[75]。RVE7 作為一種MYB 轉錄因子，正向調控生物鐘的下游過程，如下胚軸生長和開花[76]。Badhan 等[77]利用CRISPR/Cas9 技術敲除鷹嘴豆原生質體中的4CL和RVE7基因，首次證明CRISPR/Cas9可在鷹嘴豆原生質體中實現精準基因組編輯。Singer 等[78]利用CRISPR/Cas9 誘導苜蓿鱗片啟動子結合蛋白樣8 (MsSPL8)基因突變，在4 個MsSPL8等位基因中得到多達3 個的目標位點產生插入、缺失的基因突變，表現出葉片變小和開花提早等表型變化。等位基因突變劑量可以引起苜蓿的表型梯度，具有最多MsSPL8等位基因突變的植物在節間長度、株高、地上部和根系生物量以及根系長度方面具有顯著減少。這些研究結果為進一步揭示豆科牧草耐旱機理提供理論依據。

2.2.2 耐 鹽堿基因工程

土壤鹽濃度過高情況下，植物被動地吸收大量的Na+，從而使植物體內Na+/K+穩態失衡，進而對植物產生滲透脅迫和離子毒害[79]。高鹽通常會觸發細胞 內Ca2+、活 性 氧(reactive oxygen species, ROS)、ABA 和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)信號途徑[80-82]。被激活的信號分子調節轉錄因子影響植物轉錄組[83]，使植物迅速積累甜菜堿、多元醇、糖和氨基酸等小分子的水溶性化合物，以降低ROS 毒害、維護細胞膜完整[84]。Na+區域化是由液泡膜Na+/H+逆向轉運蛋白實現，由液泡膜H+-ATP 酶(V-H+-ATP 酶)和H+-焦磷酸酶(H+-PPase)為其提供質子驅動力。鹽生植物堿蓬(Suaeda corniculata)編碼V-H+-ATP 酶亞基的基因在紫花苜蓿中異源表達可以提高轉基因植株的耐鹽性[85]。霸王ZxNHX1-PcCLCg轉入紫花苜蓿后，轉基因植株積累更多的Na+、Cl-，增強鹽脅迫下自身的滲透調節能力且耐土壤貧瘠、長勢優良、營養品質高[86]。過量表達堿茅(Puccinellia distans)NHX-CAX的轉基因苜蓿也呈現出類似的結果[87]。另外，過量表達甜菜液泡膜Na+/H+逆向轉運蛋白基因BvNHX的轉基因紅豆草，能夠將細胞質中過多的Na+轉運至液泡中，明顯增強紅豆草的耐鹽性[88]。此外，細胞質中過量的Na+外排也可提高植株耐鹽性。麻冬梅和秦楚[89]通過農桿菌介導將擬南芥AtSOS1轉入紫花苜蓿，轉基因植株通過SOS1 途徑促進植物細胞內的Na+外排，從而減輕鹽堿脅迫對植株的傷害。保護蛋白可使植物細胞免受應激損傷，從而提高植株耐鹽性。在紫花苜蓿轉入水稻金屬硫蛋白基因rgMT后，當rgMT穩定表達時，顯著提高苜蓿的耐鹽性[90]。雖然脫水蛋白(dehydrin protein, DHN)保護細胞免受應激誘導脫水損傷的確切作用機制仍不清楚，但表達無芒隱子草(Cleistogenes songorica)CsDHN和CsLEA的轉基因苜蓿對鹽脅迫的耐受性有所提高[91]。將甜菜絲氨酸蛋白酶抑制劑基因BvSTI導入百脈根(Lotus corniculatus)根后，轉基因植株對鹽脅迫的耐受性顯著強于野生型和其他BvSTI表達較少的株系(表3)[92]。植物逆境生理與基因工程課題組前期研究表明，SnRK2受鹽脅迫的誘導，為解析該基因在植物非生物脅迫響應中的作用提供理論基礎，同時豐富豆科牧草抗逆遺傳改良基因資源[93]。以上結果表明，轉運蛋白、保護蛋白及蛋白激酶對提高豆科牧草耐鹽性起著關鍵作用。

過量表達轉錄因子是培育抗逆作物的手段之一。編碼AP2/EREBP、bHLH、bZIP、HD-ZIP、NAC、ZF、MYB和WRKY家族等蛋白質的轉錄因子已在多種植物中表達，它們在植物響應非生物脅迫中發揮著重要作用[94-95]。苜蓿屬植物也是如此，轉基因植物的許多不同生理反應都發生了改變，包括滲透保護劑含量的增加和脅迫條件下ROS 的減少，根系生長的改善，以及角質層的增厚或者角質層蠟質含量的提高。ABI3/VP1 (RAV)相關的轉錄因子在調節植物生長和抗逆性方面發揮著重要作用，MtRAV3的過表達增強了轉基因截形苜蓿對鹽脅迫的耐受性，并誘導逆境相關基因的表達[96]。MsMYB2L在苜蓿幼苗中的轉錄受到鹽和ABA 的誘導，該基因的過量表達使轉基因植株的脯氨酸和可溶性糖等滲透調節物質合成增強，脂質過氧化程度降低(表3)。因此，MsMYB2L可作為一個用于調控紫花苜蓿耐鹽性的潛在候選基因[97]。Q 型C2H2 鋅指蛋白(C2H2-ZFP)轉錄因子與許多植物生長發育和環境脅迫反應有關。以上結果表明，轉錄因子的異源表達或過量表達可提高轉基因豆科牧草的耐鹽能力。

除了轉錄因子之外，非生物脅迫還可介導調節下游基因表達，如基因甲基化狀態的改變或核小體組蛋白的修飾[98]。轉錄后和翻譯后的調節機制也通過選擇性剪接、應激反應性miRNA 以及蛋白質磷酸化、蘇甲?；头核鼗痆99-101]等在非生物應激反應中發揮關鍵作用。研究表明，miR169、miR408 和miR319 的過量表達顯著增強各種植物對非生物脅迫耐受性[102-104]。最近的研究表明，miR156 的過量表達提高了轉基因紫花苜蓿對鹽堿脅迫的耐受性[105-106]。LcERF056參與調控多種代謝途徑的下游基因，LcERF056的過量表達賦予轉基因擬南芥和百脈根植株更強的耐鹽性[107]。

滲透調節物質不僅維持細胞的滲透壓，而且還保護細胞內酶活性并維持細胞膜穩定性以降低鹽堿脅迫對植物的傷害。半胱氨酸合成酶(cysteine synthase, CSase)家族參與植物生長發育和非生物脅迫抗性，過量表達苜蓿MsCSase的轉基因株系在堿脅迫下其脯氨酸、可溶性糖和半胱氨酸含量增加，谷胱甘肽、H2O2、O2·-含量減少，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和過氧化物酶(peroxidase,POD)活性降低，γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因(CSase下游基因)相對表達量顯著高于野生型[108]?？梢奀Sase 通過調節滲透調節物質和提高抗氧化能力以增強植株的耐堿性。這些結果為苜蓿CSase家族的研究和豐富豆科牧草耐堿性基因資源提供了參考。

2.2.3 耐 寒基因工程

冷脅迫限制植物生長發育和作物的產量，并影響光合作用、代謝、調節和修復等一系列關鍵途徑[109]。低溫會導致細胞膜硬化使蛋白質復合物不穩定并損害光合成；冷凍(≤ 0 ℃)脅迫促進植物組織外質體中冰晶的形成，積累的冰晶可物理破壞細胞膜，導致細胞嚴重脫水，從而對植物造成更嚴重的損害[110]。寒冷脅迫同樣會影響牧草的產量和品質，研究表明低溫除了影響牧草的形態，還會導致其減產，因此植物會改變脂膜成分或積累滲透調節物質以應對寒冷脅迫[111]。擬南芥AtCBF1導入紫花苜蓿后，轉基因植株經寒冷處理后葉片長度縮短，但生長速度、產量以及蛋白質含量較野生型均有所提高(表3)[112]。由此表明，冷誘導轉錄因子也可提高紫花苜蓿的抗寒能力。

2.2.4 抗重金屬離子基因工程

土壤中的重金屬對作物產量和食品安全構成嚴重威脅[113]。選育吸收富集金屬離子的牧草品種用作土壤環境改良，而對金屬離子吸收較差的品種可用作牧草栽培。García 等[114]將烏頭葉豇豆屬(Vigna aconitifolia)的Δ1-吡咯啉-5-羧酸合酶基因(VaP5CS)轉入截形苜蓿中發現，轉基因植株的脯氨酸含量比野生型不僅提高對鎘(cadmium, Cd)的耐性，而且還通過固根提高了Cd 的植物穩定性。由促代謝、植物螯合素生物合成相關基因的相對表達可知，抗氧化機制和NADPH 循環參與應對Cd 脅迫。表明轉基因株系中的Cd 反應機制可能被組成性激活。鎘耐受性的增加并不完全是由于脯氨酸的積累，還和脯氨酸代謝、植物螯合素(phytochelatins, PCs)生物合成、抗氧化機制和NADPH 循環相關的幾個重要基因的上調有關。過量表達紫花苜蓿MsWRKY19顯著提高轉基因植株對Cd 的耐受性，且MYB過表達的轉基因植株耐鋁脅迫能力也顯著增強[115-116]。

外源添加促防御因子也可有效達到減少重金屬離子吸收。碳點(C-dots)具有非凡的性質，是近年來新興的研究領域。Chandrakar 等[117]通過分析鷹嘴豆的生理、生化和分子特性，評估C-dots 在降低砷(arsenic, As)毒性的有效性。結果表明，As 在很大程度上降低了鷹嘴豆的發芽率、生長、生物量和細胞膜穩定性。As 被生長中的種子吸收，最終導致細胞死亡。ROS、應激標記物(丙二醛)、防御酶(谷胱甘肽-S-轉移酶和吡咯啉-5-羧酸合成酶)活性和非酶抗氧化物(脯氨酸和谷胱甘肽)含量在As 脅迫下增加。As 處理導致鷹嘴豆中NADPH 氧化酶和防御相關基因的表達上調。外源施用C-dots 改善了鷹嘴豆的萌發和生長，增強了防御相關基因的表達，提高了脯氨酸和谷胱甘肽的含量，從而導致ROS 和丙二醛水平顯著降低。這些結果表明，C-dots 可能通過減少As 的吸收，誘導酶和非酶抗氧化系統相關基因表達，從而降低As 對生物量的毒性影響。

3 展望

我國豆科牧草生產遭受干旱、鹽漬化、低溫、重金屬等逆境脅迫，利用基因工程技術改良其抗逆性是有效手段之一。盡管目前豆科牧草抗逆基因工程研究已經取得了一定進展，但還存在諸多問題。如，基因轉化效率低、重復性差、隨機性大，如何構建豆科牧草高頻再生的遺傳轉化體系仍然是亟待解決的難題；優異多基因聚合改良豆科牧草品質和抗性研究相對薄弱；轉基因豆科牧草大多停留在試驗階段，進入生產應用前的安全性評價還需加強和重視。鑒于此，今后我國豆科牧草抗逆基因工程研究應該集中在以下幾個方面：1) 采用基因組測序新技術融合生物信息學方法，對我國主要豆科牧草品種進行基因組測序，為培育自主知識產權牧草新品種奠定基礎。2) 充分利用基因組、轉錄組、蛋白組和代謝組等組學手段，追蹤豆科牧草相關物種間基因的關聯性，挖掘候選優異抗逆基因，豐富豆科牧草基因資源。3) 在高頻再生的遺傳轉化體系基礎之上，建立高效基因編輯體系，加快豆科牧草基因功能的研究。4) 加強與國際轉基因作物管理機構的合作，建立和完善我國轉基因牧草的安全性評價和監管體系，促進轉基因牧草研發和商業化發展。這些研究將有助于我國飼草產業高質量、可持續發展，促進農牧民增收、助力鄉村振興。