Gal-1蛋白與胃癌臨床病理特征以及預后的關系

潘錚旸,武美玲,張 威

潘錚旸,浙江中醫藥大學第二臨床醫學院 浙江省杭州市 310053

武美玲,浙江省人民醫院胃腸外科 浙江省杭州市 310014

張威,浙江中醫藥大學第二臨床醫學院,浙江中醫藥大學第二附屬醫院胃腸外科 浙江省杭州市 310053

0 引言

胃癌(gastric cancer,GC)是最危及生命的惡性腫瘤之一,也是全球癌癥相關死亡的第三大原因[1].我國屬胃癌高發區,41-60歲者約占2/3,男女之比約為3.6:1,每年約有40萬胃癌新發病例,同時約有30萬人死于胃癌,死亡率據各種腫瘤前列,嚴重威脅人民的生命健康[2].雖然隨著腫瘤治療的發展,胃癌的治療也取得了一定的療效.大多數患者在診斷時通常處于晚期,因此失去了手術的機會,5年生存率低于5%[3].因此,迫切需要發現新的分子靶點對于評估患者預后并且進行早期干預至關重要.

半乳糖凝集素-1[(Galectin-1,Gal-1),由LGALS1基因編碼]是一種14 kda的凝集素,是半乳糖苷家族的成員,與β-半乳糖苷具有親和力[4].它們通過與細胞表面的乙二醇偶聯蛋白結合介導細胞間或細胞外成分的通訊[5].Gal-1在許多腫瘤細胞中廣泛表達,如前列腺癌、乳腺癌等[6,7],同時又是間質癌癥相關成纖維細胞旁分泌的一種可溶性蛋白[8,9],可以影響腫瘤細胞的粘附、遷移、侵襲、腫瘤誘導的血管生成和凋亡[10,11].盡管既往研究表明Gal-1在多種腫瘤組織中表達增高[12],但是在GC組織中少有系統研究,并且GC組織中Gal-1表達與預后意義目前尚不明確.

表1 Gal-1的表達與胃癌患者臨床病理特征之間的關系,n(%)

因此,本研究采用免疫組化GC患者的組織進行染色評估Gal-1的表達水平,收集患者臨床病理參數以及生存情況和生存時間,分析Gal-1與GC臨床病理特征和預后的關系.旨在為后續Gal-1作為GC預后標志物提供依據.

1 材料和方法

1.1 材料 收集2010-2015的84組在浙江省人民醫院GC患者接受R0手術切除患者中獲得GC組織標本及其匹配的癌旁組織樣本,所有患者術前均未行化療或放療,將標本制成福爾馬林固定石蠟包埋組織樣本.所有采樣患者在手術前表示知情并且簽署了書面知情同意書.倫理審批通過了浙江省人民醫院醫學倫理委員會的審批.

同時通過浙江省人民醫院電子病理系統收集臨床資料的信息內容包括: 病人的年齡、性別腫瘤病理分級、臨床TNM分期、腫瘤分化情況、是否伴有血管侵犯、是否伴有神經侵犯、淋巴結轉移數量、腫瘤瘤體直徑最大、是否有遠處轉移、組織學分型、Lauren分型等.

病理學分期根據美國癌癥聯合會(American Joint Committee on Cancer,AJCC)第8版胃癌TNM分期系統進行評估.同時對GC患者進行隨訪,隨訪時間為2015-01/2023-01.隨訪時CT發現復發征象者,行胃鏡檢查和活檢診斷后明確,同時記錄患者復發后診療方法.觀察結局為總生存(overall survival,OS),至隨訪末次時間為止,無失訪病例.

1.2 方法

1.2.1 免疫組化化學染色: 免疫組化采用SP法[13],對常規5 μm的GC以及癌旁組織切片依次放入二甲苯溶液脫蠟以及梯度乙醇溶液進行脫水,切片在每個試劑中浸泡10 min.隨后加入3%的雙氧水浸泡10 min,棄去雙氧水,用冰PBS小心沖洗3遍,每次約5 min;之后再加入0.3 mol/L檸檬酸緩沖液,置于微波爐加熱 3 min后緩慢冷卻至室溫,使抗原的位點充分暴露出來.待冷卻至室溫后,將檸檬酸緩沖液倒掉,水洗3次.甩干玻片表明液體后,將載玻片置于PBS中5 min,洗3次,擦干組織周圍的PBS液,加入山羊血清,封閉非特異性的位點起來.擦干水分,加入適當濃度比例的Gal-1一抗(1:250,#6837-1;Epitomics,Burlingame,CA,USA),于4 ℃保存、過夜.然后組織切片與加HRP標記的二抗(PV-9001,1:1000,北京中杉金橋公司)37 ℃孵育1 h,PBS沖洗后DAB顯色,蘇木素復染3 min,梯度乙醇脫水,中性樹脂封片晾干后鏡下觀察.

1.2.2 結果判定: 免疫組織化學染色完成后,根據染色的強度及范圍協助分析所得結果.根據病理科醫生評分進行劃分: 沒有染色-0分;淺黃色-1分;棕黃色-2分;棕色-3分.陽性細胞百分率的標準: 0-10%-0分,10-25%-1分,26-50%-2分,51-75%-3分,76-100%-4分.最終結果為陽性細胞數乘以染色強度.當免疫組化評分小于等于6分時,為低表達,當免疫評分高于6分時為高表達[14].

統計學處理 采用SPSS 23.0軟件進行數據處理和統計學分析.采用卡方χ2檢驗或Fisher精確檢驗探討高、低Gal-1表達組之間各個臨床病理參數的分布是否具有差異性.通過單因素及多因素Cox回歸比例風險模型確定GC患者預后相關因素.采用Kaplan-Meier生存分析法比較高、低Gal-1表達組的生存差異.本實驗中所有檢驗均為雙側概率,P＜0.05為差異有統計學意義.

2 結果

2.1 臨床特征 84例GC患者平均年齡為58.13歲±11.23歲,其中男性52例,女性32例.按腫瘤部位賁門部腫瘤占10例(11.9%),胃體部腫瘤占31例(36.9%),胃竇部腫瘤占42例(51.2%).按組織學分型乳頭狀腺癌占4例(4.8%),管狀腺癌65例(77.4%),粘液腺癌2例(2.4%),印戒細胞癌13例(15.5%).根據第8版胃癌臨床TNM分期: TNM分期Ⅰ+Ⅱ期32例(38.1%),TNM分期Ⅲ+Ⅳ期52例(61.9%).84例GC患者中58例(69.1%)GC患者行術后輔助治療,26例(30.9%)患者未行術后輔助治療.并且84例GC患者中59例(70.2%)于術后復發,其中7例(11.9%)未行復發挽救治療,52例(88.1%)患者中按行復發挽救治療方式分為手術治療14例(23.7%),全身藥物治療28例(47.5%),手術聯合全身藥物治療10例(16.9%),具體數據詳見表1.

2.2 IHC染色GC組織中Gal-1蛋白表達 Gal-1蛋白在GC組織中主要表達與腫瘤間質成分,在腫瘤細胞中不表達或微弱表達.Gal-1蛋白陽性染色為棕黃色,定位于間質細胞胞膜或胞質中,染色范圍呈片狀、彌漫性分布(圖1A-C),同時癌旁組織未見陽性染色(圖1D).在84例GC組織中,共有42例為Gal-1蛋白IHC染色陽性,GC組織中Gal-1陽性表達率為50%(42/84).

圖1 不同分化水平胃癌組織與癌旁組織中Gal-1表達(放大倍鏡x400).A: Gal-1在低分化GC組織中表達;B: Gal-1在中分化GC組織中表達;C: Gal-1在高分化GC組織中表達;D: Gal-1在GC癌旁組織中表達.Gal-1: 半乳糖凝集素-1;GC: 胃癌.

2.3 GC組織中Gal-1蛋白表達與其臨床病理特征相關性根據上述評分將所有患者分成Gal-1高表達組與低表達組,探究其表達與常見臨床病理參數之間的關系,如年齡、性別腫瘤病理分級、臨床 TNM 分期、腫瘤分化情況、是否伴有血管侵犯、是否伴有神經侵犯、淋巴結轉移數量、腫瘤瘤體直徑最大、是否有遠處轉移、組織學分型、Lauren分型、是否術后行輔助治療、是否術后復發以及復發后挽救治療方式等.發現Gal-1表達跟浸潤深度(χ2=8.896,P=0.031)、淋巴結轉移(χ2=11.433,P=0.001)、遠處轉移(χ2=5.126,P=0.024)以及TNM(χ2=7.269,P=0.007)分期具有相關性.但是與性別、年齡、分化程度、Lauren分型、組織學分型、腫瘤部位、術后行輔助治療、術后復發以及復發后挽救治療方式無明顯相關性(P＞0.05,表1).

2.4 Gal-1蛋白表達與GC患者預后的關系 Gal-1高表達患者5年OS率為21.4%,低表達組5年OS率為52.38%,高表達Gal-1組OS率顯著低于Gal-1低表達患者,差異具有統計學意義(P＜0.001,圖2).

圖2 Kaplan-Meier生存分析Gal-1表達與胃癌患者總生存的關系.Gal-1: 半乳糖凝集素-1.

單因素和多因素Cox回歸顯示Gal-1高表達(HR=2.484 95%CI=1.323-4.667,P=0.005)、腫瘤直徑(HR=1.828,95%CI=1.024-3.264,P=0.041)、有遠處轉移(HR=9.551,95%CI=3.902-23.379,P＜0.001)、術后復發(HR=7.488,95%CI=3.077-22.514,P＜0.001)是GC患者不良OS的獨立預測因子(表2).

3 討論

半乳糖凝集素是由LGALS1基因編碼.這是一個聚糖結合蛋白(凝集素)家族,對含β-半乳糖苷的N-聚糖具有親和力[12].該家族的一個成員是Gal-1,它具有特定的結構特征.它作為分泌蛋白能夠結合和交聯細胞表面的糖綴合物,包括細胞外基質的不同整合素和糖蛋白,從而調節細胞粘附、遷移、存活和信號傳導[15-17].研究證明,Gal-1蛋白在多種腫瘤的發生發展發揮著重要作用.如Tsai等[16]發現Gal-1在肝癌中可作用于腫瘤細胞糖基化膜受體如TNFR1結合以調節TNF-α/JNK/c-Jun/ATF2下游信號傳導,從而影響腫瘤細胞的粘附、遷移、侵襲.除此之外,Paz發現[18]在癌細胞攝取Gal-1通過與腫瘤細胞溶質或核蛋白(如H-Ras,FXOP3和Gemin4)相互作用,可以調節信號轉導、基因轉錄,從而影響導致細胞周期調控發生紊亂,致使腫瘤的發生、發展.Gal-1在黑色素瘤中還通過作用于黑色素瘤細胞粘附分子,抑制Th1型細胞,從而有助于腫瘤免疫逃避程序[19].目前國內外少有對此分泌蛋白的進一步研究報道,但是在GC中少有系統研究,與臨床病理相關性上缺少大樣本量的分析.因此本文通過觀察Gal-1在GC中的表達并且分析與臨床病理特征的關系,為GC探求潛在的治療靶點提供依據.

本研究結果顯示,Gal-1蛋白在GC組織中主要表達與腫瘤間質成分,在腫瘤細胞中不表達或微弱表達.這與Spano等[20]在肝癌中免疫組化的結果相一致.為了進一步研究Gal-1對GC患者的影響,收集患者臨床病理參數以及生存情況和生存時間,進行統計學分析后,發現Gal-1表達跟浸潤深度(χ2=8.896,P=0.031)、淋巴結轉移(χ2=11.433,P=0.001)、遠處轉移(χ2=5.126,P=0.024)以及TNM(χ2=7.269,P=0.007)分期具有相關性,單因素和多因素Cox回歸顯示Gal-1高表達(HR=2.484,95%CI=1.323-4.667,P=0.005)、腫瘤直徑(HR=1.828,95%CI=1.024-3.264,P=0.041)、有遠處轉移(HR=9.551,95%CI=3.902-23.379,P＜0.001)、術后復發(HR=7.488,95%CI=3.077-22.514,P＜0.001)是GC患者不良OS的獨立預測因子.并且Gal-1高表達患者5年OS率為21.4%,低表達組5年OS率為52.38%,高表達Gal-1組OS率顯著低于Gal-1低表達患者.以上結果提示Gal-1可作為預測GC進展和預后的有效標記,且Gal-1表達于晚期GC患者以及細胞惡性生物學行為較高的GC患者.但其生物學作用及其可能涉及的分子通路具體作用機制還有待于進一步揭示.

4 結論

總之,間質中Gal-1表達可能參與了細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲以及免疫抑制等過程,在GC的進展和轉移中發揮了重要的作用.Gal-1的高表達與GC的惡性程度轉移以及疾病進展程度顯著相關,可作為評價GC患者進展和預后的重要指標,為早期預防和評估GC惡性腫瘤進展提供新的思路和理論依據.

文章亮點

實驗背景

胃癌(gastric cancer,GC),是最常見的消化道惡性腫瘤之一,發病率占世界惡性腫瘤第五位,同時為第三大導致死亡的癌癥相關惡性腫瘤.因此,探究其評估預后指標以及治療靶點對GC患者預后至關重要.

實驗動機

目前,半乳糖凝集素-1(Galectin-1,Gal-1)蛋白在組織的表達對胃癌患者的進展以及預后相關性少有報道.

實驗目標

明確Gal-1在GC中的表達及對預后的影響,為早期預防和評估GC惡性腫瘤進展提供新的思路和理論依據.

實驗方法

采用免疫組化(immunohistochemistry,IHC)對84名不同GC患者的組織進行染色評估Gal-1的表達水平,收集患者臨床病理參數以及生存情況和生存時間,統計學分析Gal-1與GC臨床病理特征和預后的關系.

實驗結果

Gal-1在GC組織中間質成分中高表達,Gal-1的高表達與GC的惡性程度轉移以及疾病進展程度顯著相關且與GC預后負相關.

實驗結論

Gal-1在GC的進展和轉移中發揮了重要的作用,可作為評價GC患者進展和預后的重要指標.

展望前景

Gal-1在GC中具有較大臨床意義,進一步揭示其生物學作用及其可能涉及的分子通路具體作用機制具有重大前景.