CDH1基因對小鼠胃類器官生長和E-caherin表達的作用機制

邵 偉,余友杰,夏海娜,鄭優優,孫展杭,嚴皓哲

邵偉,鄭優優,嚴皓哲,舟山市普陀區人民醫院消化內科 浙江省舟山市 316100

余友杰,舟山市普陀區人民醫院血液腫瘤科 浙江省舟山市 316100

夏海娜,舟山市普陀區人民醫院病理科 浙江省舟山市 316100

孫展杭,舟山市普陀區人民醫院浙江舟山消化病防治研究所 浙江省舟山市 316100

0 引言

類器官是近年來新開發的三維細胞培養系統,由原代組織的成體干細胞或胚胎干細胞/誘導多能干細胞組成,細胞嵌入富含層黏連蛋白的細胞外基質中,可模仿天然的細胞外微環境[1].類器官培養不僅比動物模型的操作簡便,而且研究人員可直接進行動態監測并進行研究[2].胃類器官是消化系統中一種重要的組成部分,因其能對胃干細胞驅動上皮細胞增殖和分化過程準確的表現出來,在癌癥領域的研究中有重要的意義.過去研究發現[3],胃類器官的生長和發育受到多種因素的調控.鈣黏蛋白1(cadherin-1,CDH1)是依賴性鈣離子的細胞黏附分子之一,也是編碼E-鈣黏蛋白(E-cadherin)的重要基因,在維持細胞間粘附和上皮細胞架構方面起重要作用[4].有學者研究發現[5],CDH1基因突變可能介導彌漫性胃癌的發生發展,可能是導致慢性胃癌的主要危險因素之一,而CDH1對胃類器官生長的作用機制尚不清楚.E-cadherin作為腫瘤抑制基因,沉默突變和E-cadherin表達下調可導致細胞顯示出低分化、強侵襲性、喪失極性和間充質表型[6].研究發現[7],E-cadherin基因突變可介導彌漫性胃癌發生發展,且和患者生存預后密切相關.除此之外,在胃類器官中E-cadherin可作為一種形成標志.但CDH1對胃類器官生長和胃類器官中E-cadherin表達的作用尚未見相關報道.因此,本研究旨探究CDH1對小鼠胃類器官生長和E-cadherin表達的機制.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物: 采用CRISPR/Cas9基因敲除技術獲得CDH1-/-C57BL/6品系小鼠10只(賽業生物科技有限公司),經PCR驗證CDH1-/-小鼠基因型,選擇6 wk-8 wk齡,體質量20 g-22 g的野生型(WT)C57BL/6品系小鼠10只作為實驗對照組.野生型C57BL/6購自北京華皁康生物科技有限公司,許可證號SCXK(京)2020-0004.將所有小鼠統一飼養在特定病原體(SPF)、且具有獨立通氣設備系統的小鼠籠中,維持室溫恒定22 ℃-26 ℃,相對濕度40%-70%,光照12 h/黑暗12 h,自由飲食.此研究已通過倫理委員會批準(2021002KY).

1.1.2 試劑和儀器: Advanced DMEM/F12(美國Corning公司);胃泌素1(Gastrain1,上海MedChemExpress公司);N2、B27、青鏈霉素(美國Thrmofisher公司);小鼠E-cadherin抗體(美國R&D公司);HRP標記的山羊抗兔IgG(北京百奧博萊科技有限公司);MTT檢測試劑盒(上海澤葉科技有限公司);蛋白質印跡配膠試劑盒、蛋白提取試劑盒(杭州開泰生物技術有限公司);離心機(型號: Centra 3C,美國國際設備公司);il60型CO2培養箱(上海一恒科學儀器有限公司);CKX-41型倒置顯微鏡(上海光學儀器六廠).

1.2 方法

1.2.1 小鼠胃類器官培養: 小鼠均禁食24 h后處死,解剖后獲取全胃,使用剪刀將其與胃腸道的其余部分分離,后將胃放入10 cm的培養皿的蓋子中,使用鑷子輕輕按壓胃組織,排出所有凝結的乳汁.使用一個新的無菌鑷子,在4個分開的30 mm的細胞培養皿中洗滌胃組織4次,每個培養皿中含有100 L的PBS和慶大霉素50 g/mL,后將洗滌過的胃放入1.5 mL的Eppendorf管中,管中含有100 L的PBS和50 g/mL的龍膽米星.使用一把新的無菌剪刀,將胃組織在Eppendorf管中剪碎成1 mm左右的組織塊.將得到的組織塊用5 mmol/L的EDTA冰上溫和消化20 min-30 min,離心并棄掉上清液,用Matrigel包裹并重懸胃組織,接種于24孔板中.按照200個/孔的密度接種組織于24孔板中,其中Matrigel體積25 μL/孔.將24孔板置于5%CO2、37 ℃培養箱中,20 min待Matrigel膠完全凝固后,將完全培養基加入到24孔板中,750 μL/孔,再次將孔板置于5%CO2、37 ℃培養箱中培養,每天統一時間觀察細胞的狀態,2-3 d換液1次.當觀察到小鼠的胃類器官的體積有明顯變大時,且小鼠的胃類器官直徑明顯大于400 μm時,對小鼠的胃類器官進行傳代.將膠原酶Ⅳ加入到孔板的每孔中,孵育孔板于37 ℃環境中,10 min吹打細胞一次,并觀察類器官形態變化,當發現多數的細胞均分散開,并形成5-10個細胞組成的粘連形成時消化細胞,離心機細胞后收集上清液,用Matrigel包裹胃組織并重懸,將組織接種于24孔板中,加入750 μL完全培養基/孔,將孔板置于5%CO2、37 ℃的培養箱中繼續培養.

1.2.2 免疫熒光染色: 將小鼠的胃類器官置于4%甲醛溶液中固定,將流水沖洗組織后用乙醇脫水,用石蠟包埋組織,后用石蠟切片機切成組織薄片,厚度為4 μm,將組織切片用二甲苯脫蠟3次,10 min/次,將組織置于乙醇中水化,脫掉二甲苯后乙醇梯度脫水,將組織切片用高溫高壓抗原修復,后用3%H2O2冷卻組織切片10 min,用PBS洗滌切片1次,在室溫的環境中孵育一抗E-cadherin(1:200)2 h,后置于4 ℃環境中,孵育切片過夜;加入熒光標記的二抗(1:200),在37 ℃環境中孵育二抗30 min,核用DAPI染色,封片后將組織切片置于熒光顯微下,觀察組織中E-cadherin表達.

1.2.3 MTT檢測細胞活力: 將胃類器官溶解消化成單細胞,用Matrigel包裹細胞,以2000個細胞/孔的密度接種細胞于24孔板中,將500 μg/mL的MTT溶液加入到24孔板中,10 μL/孔,孵育孔板4 h;后將甲醛晶體置于100 μL DMSO中溶解,于490 nm處測定吸光度A490,計算胃類器官細胞活力.根據MTT試劑盒檢查操作,分別于生長的第1 d、3 d、7 d時檢測.

1.2.4 蛋白質印跡法檢測細胞中E-cadherin蛋白表達: 將胃類器官消化并制成單細胞懸液,用RIPA裂解細胞,并用BCA法測定細胞中總蛋白濃度.熱水煮沸蛋白樣品(終濃度為2 μg·mL-1)10 min,后于-20 ℃冰箱中保存蛋白樣品.去50 μg的蛋白樣品,加入上樣緩沖液混勻,于沸水中變性.將蛋白樣品用SDS-PAGE分離后轉移到PVDF膜上,用脫脂牛奶(5%)封閉1 h;用含1 mL/吐溫的Tris緩沖鹽溶液(TBST)洗膜,將膜與一抗(1:1000)在4 ℃下孵育過夜,然后用清洗劑沖洗干凈PVDF膜.將二抗(1:1000)加入膜中,在室溫的環境中孵育二抗2 h.將ECL發光液加入到細胞中顯影曝光,用Image Lab軟件分析E-cadherin蛋白條帶的灰度值.

1.2.5 RT-PCR檢測細胞中E-cadherin mRNA表達: 將胃類器官消化并制成單細胞懸液,將TRIzol裂解液加入到細胞中裂解,按照試劑盒說明書提物組織或細胞中總RNA,將組織或細胞中總RNA逆轉錄為cDNA.根據PCR試劑盒說明書操作,配制10 μL的反應體系(2×SYBR mix 5 μL、cDNA 0.4 μL、上下游引物各0.4 μL、參比染料羅丹明X0.4 μL、DEPC水3.4 μL).實時熒光定量PCR反應程序為: 95 ℃預變性30 s,(變性95 ℃ 5 s,延伸60 ℃ 30 s)×40個循環,采用β-actin為內參,用2-△△CT法計算基因表達量水平.E-cadherin引物序列,上游引物: 5’-TCACATCCTACACTGCCCAG-3’,R: 5’-AGTGTCCCTGTTCCAGTAGC-3’;GAPDH引物序列,上游引物: 5’-TCAAGAAGGTGGTGAAGCAGG-3’,R:5’-TCAAAGGTGGAGGAGTGGGT-3’.

統計學處理 實驗數據采用Graphpad priam 8.0軟件進行統計學分析.數據以均值±標準差(mean±SD)表示.不同組間數據采用重復測量方差和單因素方差(one-way ANOVA)分析,各組間兩兩比較采用LSD-t檢驗,實驗結果以P＜0.05表示差異有統計學意義.

2 結果

2.1 小鼠胃類器官構建 在光學顯微鏡下可見,培養基中小鼠胃部組織不斷的進行生長與分裂,從第0 d開始組織在24 h內形成囊性結構,然后經歷快速生長階段.器官樣細胞擴展為大的3D球形結構,到第5 d后開始出芽并逐漸形成胃類器官(圖1),由此可見,胃類器官初步構建.

圖1 小鼠0 d-5 d胃類器官的生長情況.

2.2 小鼠胃類器官特征 免疫熒光染色檢測E-cadherin陽性表達結果顯示,CDH1-/-C57BL/6小鼠胃類器官結構中E-cadherin蛋白被完全染色,而WT C57BL/6小鼠胃類器官中E-cadherin陽性表達增多(圖2),E-cadherin可作為胃類器官成功構建的標志,提示胃類器官成功構建.

圖2 免疫熒光檢測胃類器官中E-cadherin表達.A: CDH1-/-C57BL/6小鼠;B: WT C57BL/6小鼠.DAPI藍色染色,E-cadherin綠色染色.

2.3 CDH1對小鼠類器官生長的影響 和WT C57BL/6小鼠相比,CDH1-/-C57BL/6小鼠胃類器官數量、胃類器官直徑均由明顯減少(P＜0.05);CDH1-/-C57BL/6小鼠胃類器官吸光度值低于WT C57BL/6小鼠,CDH1-/-C57BL/6小鼠細胞活性降低(P＜0.05),提示CDH1基因敲除可以抑制胃類器官生長(圖3).

圖3 CDH1對小鼠類器官生長的影響.A: 小鼠胃類器官數量比較;B: 小鼠胃類器官直徑比較;C: 胃類器官的吸光度值比較.CDH1: 鈣黏蛋白1;E-cadherin: E-鈣黏蛋白.和WT C57BL/6相比,aP＜0.05.

2.4 CDH1對小鼠胃類器官中E-cadherin表達的影響 和WT C57BL/6小鼠相比,CDH1-/-C57BL/6小鼠胃類器官中E-cadherin蛋白和E-cadherin mRNA相對表達量明顯減少(P＜0.05),提示CDH1基因敲除能抑制胃類器官中E-cadherin表達(圖4).

圖4 CDH1對小鼠胃類器官中E-cadherin表達的影響.A: 小鼠胃類器官中E-cadherin蛋白條帶圖;B: 小鼠胃類器官中E-cadherin蛋白表達比較;C: 小鼠胃類器官中E-cadherin mRNA相對量比較.CDH1: 鈣黏蛋白1;E-cadherin: E-鈣黏蛋白.和WT C57BL/6相比,aP＜0.05.

3 討論

胃癌和消化性潰瘍病是胃部常見疾病,主要由慢性幽門螺旋桿菌感染所致,影響全世界約10%的人口的生命健康[8].胃是一個肌肉器官,由賁門、胃底、胃體和胃竇四部分組成,在食物儲存和消化過程中起重要作用[9].胃體是胃酸分泌酸和消化酶的主要部位,胃竇在激素和粘液分泌中發揮重要作用[10].胃是在長期接觸營養物質、毒素和細菌-RIA共同產生的一個有毒的環境,為了確保胃黏膜的完整和功能性,上皮細胞需要持續的自我更新.

隨著類器官培養技術的發現,為研究胃干細胞和胃上皮細胞損傷以及再生的模型提供了更理想的選擇[11].類器官是近年來新開發的一種從原代組織的成體干細胞(AdSCs)或胚胎干細胞(ESCs)/誘導多能干細胞(iPSCs)中獲得的單位細胞培養系統,由于細胞被嵌入在一個富含層黏連蛋白的細胞外基質中,可模仿一個天然的細胞外微環境[12].類器官不僅可表現出衍生器官的生理功能,其培養物中的干細胞還具有出自我更新和無限的增長能力,因此在多種情況下能構成一個接近生理的細胞培養模型.目前類器官被廣泛應用于模擬器官發生、感染、惡性腫瘤等研究[13].盡管胃類器官的研究近年來取得了快速發展,但國內對該領域的研究相對較少.因此,研究CDH1在胃癌和癌前病變的中的作用和機制,利用胃類器官為研究對象,是一個具有潛力的研究方向.

CDH1基因是位于染色體16q22.1上,其與胃類器官疾病有密切的關聯.研究發現[14],CDH1基因的突變與家族性彌漫性胃癌的發生密切相關.CDH1基因的多態性和表達水平的變化也與其他胃類器官疾病,如胃潰瘍和胃息肉的發生和發展有關.研究發現[15],CDH1基因通過調節信號通路的激活和抑制,如Wnt和Src信號通路,來調控細胞增殖和分化,從而影響胃類器官的發育和生長.本研究結果顯示,CDH1基因缺失可抑制胃類器官的生長.E-cadherin是依賴性粘附的鈣黏蛋白家族成員之一,E-cadherin蛋白在上皮細胞中廣泛存在,具有多種生物學作用,如維持細胞骨架、增加細胞流動性、參與細胞間質表型等.有研究表明,侵襲和轉移是E-cadherin在惡性腫瘤中最顯著的生物學特征[16].低表達E-cadherin可對腫瘤的侵襲、轉移及對上皮間質轉化發揮促進作用,還能通過影響多種信號通路從而促進腫瘤細胞的增殖和轉移.Tang等[17]研究表明,E-cadherin對維持Lgr5胃竇干細胞穩態方面起關鍵作用,當E-cadherin的缺失時,Lgr5干細胞池會減少,導致胃竇上皮的穩態受損以及以內胃類器官的生長受到限制.相關研究表明[18],CDH1基因通過轉錄因子和調節子的結合,直接或間接地調控E-cadherin的轉錄和翻譯過程,其對E-cadherin的表達也起著重要的調控作用.CDH1基因突變會導致E-cadherin的表達喪失,進一步促進腫瘤的侵襲和轉移.研究發現[19],CDH1基因的突變或表達水平的異常會導致E-cadherin的表達下調,從而影響胃類器官的形態和功能.研究發現[20],CDH1基因的缺失會導致小鼠除了胚胎期臍帶等細胞外結構外,幾乎所有組織中E-cadherin的表達喪失,這進一步導致上皮細胞分離、遷移和增殖的障礙,從而影響胃類器官的正常發育和生長.本研究結果顯示,CDH1基因敲除小鼠胃類器官中E-cadherin表達明顯受到抑制,因此猜測,CDH1基因敲除抑制胃類器官生長可能和抑制E-cadherin表達有關,但具體的作用機制還需進一步的探究.

4 結論

綜上所述,CDH1基因敲除可對胃類器官生長形成及E-cadherin表達發揮抑制作用.但由于時間和成本等因素,本研究僅得出結論可能和調控E-cadherin表達有關,但具體的作用機制尚未完全明確,使研究結果可能存在一定的局限性,在今后的研究中會增加相關的實驗研究,探究CDH1對胃類器官生長的具體作用.

文章亮點

實驗背景

鈣黏蛋白1(cadherin-1,CDH1)基因是一個編碼E-鈣黏蛋白(E-cadherin)的基因,在細胞間黏附和組織形態維持中起著重要作用.CDH1基因突變與多種癌癥相關,其中包括胃癌.了解CDH1基因在胃類器官發育和胃腫瘤形成中的作用機制對于深入了解胃類器官發育和腫瘤生物學,并且為相關治療策略的研究提供理論依據.

實驗動機

本篇論文的主題是探究CDH1基因敲除對胃類器官生長和形成的影響,特別是E-cadherin的表達變化.通過研究CDH1基因的功能,在解決胃類器官發育和腫瘤形成的關鍵問題上有重要意義,并且對于進一步推動該領域的研究具有重要貢獻.

實驗目標

本文目標是通過CDH1基因敲除模型,探究CDH1基因對胃類器官發育的調控機制,通過實驗結果,提出新的理論和見解,為胃類器官發育和腫瘤研究提供新的思路和方向.

實驗方法

本篇論文采用基因敲除技術來模擬CDH1基因的缺失狀態.通過使用動物模型等實驗手段,觀察CDH1基因敲除對胃類器官生長和形成的影響,并通過蛋白質印跡等方法來分析E-cadherin的表達的變化.這些研究方法具有特色和獨創性,可以為CDH1基因在胃類器官中的功能提供深入了解.

實驗結果

通過CDH1基因敲除實驗,發現CDH1基因敲除能夠抑制胃類器官的生長和形成,并導致E-cadherin的表達顯著降低.這為探究胃類器官發育和腫瘤形成提供了新的線索和理論基礎.

實驗結論

本研究的新發現包括CDH1基因敲除能夠抑制胃類器官生長和形成,以及E-cadherin表達降低等.通過對CDH1基因的功能研究,我們提出了新的理論,恰當歸納了相關知識,并提出了獨到的見解.此外,本研究還提出了一些假設和新的研究方法,通過實驗發現了一些新的現象,并驗證了相應的假設.最后,本研究對臨床實踐可能產生影響,為胃腫瘤的治療策略提供了新的方向和思路.

展望前景

本研究需要進一步探究CDH1基因調控胃類器官發育的詳細機制,并加強與其他信號通路的相互關系研究.未來需探索CDH1基因的潛在調控機制、開發新的治療策略以及進一步研究胃類器官發育和腫瘤形成的相關問題.最佳的研究方法為使用更多的動物模型、組織工程技術和細胞培養實驗等以獲取更詳盡的數據和更準確的結果.