海馬過表達Ephrin-B3對顳葉癲癇大鼠突觸重塑的影響

李莉莉 劉田田 張 敏 劉恒方

1）鄭州大學第五附屬醫院，河南 鄭州 450015 2）鄭州大學第一附屬醫院，河南 鄭州 450052

顳葉癲癇（temporal lobe epilepsy，TLE）是一種中樞神經系統常見病，其發病機制非常復雜，既往研究表明興奮和抑制失衡是其主要致病因素［1］，而興奮和抑制失衡常常會引起神經元的異常放電，導致癲癇的發作［2-5］。TLE 主要病變部位在海馬［6］，海馬中發生神經元的丟失及新生突觸重塑形成的異常神經環路是癲癇患者發生自發性癇性發作的病理基礎［7］，離子型通道在神經元的異常放電中起著關鍵作用，參與到神經元突觸的可塑性調節中［8-10］，是既往主要的研究方向。酪氨酸蛋白激酶B3（Ephrin-B3）是一種蛋白質，在神經系統中屬于軸突導向蛋白［11］，在海馬中廣泛分布，近年來發現B3（Ephrin-B3）具有抗癲癇作用［12-13］，其可能參與到神經元之間的突觸連接和突觸可塑性的調節，然而，Ephrin-B3是如何參與到顳葉癲癇的發病方式目前尚不清楚。研究顯示，Ephrin-B3可與離子型受體NMDA亞單位NR2B形成復合體參與到突觸的長時程增強中［14］。另有研究發現，致癇后急性期海馬PSD95/NR2B 表達下調，提示突觸后密度蛋白95（postsynaptic density protein 95，PSD95），以及離子型谷氨酸受體亞基NMDAR2B（N-methyl-D-aspartate receptor subunit 2B，NR2B）可能參與到癲癇的可塑性調節中，基于此推測Ephrin-B3可能與突觸后蛋白PSD95和NMDA有關［15］。本研究采用慢病毒過表達Ephrin-B3 對實驗大鼠海馬基因進行干預，旨在探討Ephrin-B3在顳葉癲癇模型中過表達對突觸相關蛋白表達的影響，探究其在癲癇的發病機制中所起的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要儀器及試劑選用健康SPF 級雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，6～8 周齡，體質量200～250 g，購自遼寧長生生物技術有限公司，飼養于鄭州大學第五附屬醫院中心實驗室動物房［許可證號：SCXK（遼）2020-0001］，保持每籠大鼠3 只，給予充分的水和飼料，定期更換墊料，大鼠可以自由進行攝食、飲水。動物房內12 h晝夜節律，室溫（24±2）℃。

1.2 主要儀器及試劑主要儀器：大鼠腦立體定位儀（深圳瑞沃德公司），實時熒光定量PCR儀（上海羅氏），電泳及轉膜設備（美國BIO-RAD公司），Western blot化學發光成像系統（美國BIO-RAD公司）。

主要試劑：特異性引物（上海生工）、鼠β-actin抗體（武漢Proteintech公司）、鼠Ephrin-B3抗體（美國Santa Cruz）、兔NMDAR2B抗體（美國Abcam 公司）、PSD95（美國affinity公司）、氯化鋰（美國Sigma-Aldrich公司）、匹羅卡品（上海麥克林）、Efnb3慢病毒（上海吉瑪）。

1.3 分組將實驗大鼠隨機分為空白對照組、癲癇組、空載體組、慢病毒轉染組共40只，每組10只?？瞻捉M不做任何處理，飼養條件同其他各組大鼠。造模以Racine 評分標準達到Ⅳ級及以上，并且持續時間超過30 min 者歸為癲癇組，空載體組于兩側海馬區各注射5 μL 的LV5-NC，慢病毒組于兩側海馬區各注射5 μL 的Efnb3病毒，其中空載體和慢病毒注射組于1周后進行癲癇造模處理，同樣達到Ⅳ～Ⅴ級者再歸于空載體組和慢病毒組。

1.4 顳葉癲癇大鼠的動物模型建立采用氯化鋰-匹羅卡品注射法進行顳葉癲癇的造模方法［16］，在空載體組和慢病毒組海馬注射1 周后開始進行癲癇造模處理，腹腔內給予127 mg/kg 氯化鋰注射，18～20 h后3組腹腔注射35 mg/kg的匹羅卡品，行為學觀察按照Racine分級標準進行，達到Racine分級Ⅳ～Ⅴ級且持續時間超過30 min視為癲癇造模成功組。未達到Ⅳ級及以上者需再次注射，繼續觀察，直至達到致癇成功組。癲癇持續60 min后向大鼠腹腔內注入10%水合氯醛3 mL/kg 終止發作，麻醉30 min 后，各組大鼠分別于腹腔內給予生理鹽水和10%的蔗糖溶液補充電解質及能量。

1.5 慢病毒的注射用10%的水合氯醛麻醉大鼠，固定于腦立體定位儀上，暴露頭骨，以前囟為原點，向下3.5 mm，左右旁開1.8 mm為雙側海馬位置，標記位置，用顱骨鉆于標記點高速鉆孔，待出現落空感時停止鉆孔，使用1 μL體積的微量注射器抽取5 μL 的Efnb3 慢病毒，連接微量注射泵，兩側海馬各注射5 μL，滴度為1×109TU/mL。以0.25 μL/min 速度注射，注射所需時間20 min，注射后留針10 min，緩慢拔針，骨蠟封閉。

1.6 熒光定量PCR按說明書繼續操作，提取海馬組織RNA，逆轉錄為cDNA，按照說明書加樣，避光處理，放入實時熒光定量PCR 儀中檢測腦組織Ephrin-B3、PSD95、NMDAR2B mRNA 的表達水平。相關檢測引物序列見表1。

1.7 Western blot 檢測按說明書提取海馬組織蛋白，SDS-PAGE 100 V 恒壓電泳約1 h，待蛋白樣品電泳至膠底部時停止電泳，電流調至400 mA 轉膜50 min。轉膜成功后，5%的脫脂牛奶封閉1～2 h，一抗4 度過夜，二抗孵育1 h，洗膜3 遍各5 min 后，滴加ECL 顯色試劑并曝光拍照保存。

1.8 統計學分析采用GraphPad Prism 8.0，Adobe Photoshop進行作圖及統計學分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示。進行正態性及方差齊性檢驗后，組間比較選用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 體質量變化比較癲癇組和空載體組體質量分別為（199±32.48）g、（193.2±22.74）g，與對照組的（236.8±14.62）g 相比明顯下降，慢病毒轉染組體質量為（213.4±20.38）g，較癲癇模型組和空載體組體質量略有上升，轉染組較癲癇組（P=0.659 8），與空載體組比較差異無統計學意義（P=0.453 1）。

2.2 癲癇發作潛伏期比較Ephrin-B3 慢病毒過表達組與癲癇模型組相比SE發作潛伏期有所延遲，差異有統計學意義（F=5.898，P=0.047 1），與空載體組相比，潛伏期略有延長，有統計學差異（P=0.019 8）。見表2。

表2 各組大鼠首次驚厥發作潛伏時間比較 （min，±s）Table 2 Comparison of latency timeof the first convulsive attack of rats in each group （min，±s）

表2 各組大鼠首次驚厥發作潛伏時間比較 （min，±s）Table 2 Comparison of latency timeof the first convulsive attack of rats in each group （min，±s）

注：與癲癇組相比，*P＜0.05，與空載體組比較，#P＜0.05。

組別癲癇組空載體組慢病毒組造模SE發作潛伏期22.4±3.91 21.0±5.29 30.2±4.38*#n555

2.3 熒光定量PCR 檢測大鼠海馬組織轉染Ephrin-B3 mRNA表達與對照組Ephrin-B3 mRNA相對表達量（1.022±0.24）相比，空載體組Ephrin-B3 mRNA 相對表達量（0.199±0.04）和模型組Ephrin-B3 mRNA 相對表達量（0.195±0.07）顯著降低（F=25.11，P＜0.000 1）；模型組與空載體組相比差異無統計學意義（P＞0.99），表明手術及載體的注入對實驗未構成影響，可進行單因素的分析；Ephrin-B3 過表達組Ephrin-B3 mRNA 相對表達量（0.706±0.27）與對照組相比無統計學差異（P=0.059 4），與癲癇模型組相比表達水平有統計學差異（P=0.002 7），與空載體組相比差異有統計學意義（P=0.002 9），說明慢病毒轉染成功，可進行后續實驗分析處理。見圖1、圖2。

圖1 各組不同處理后Ephrin-B3的mRNA表達水平Figure 1 The mRNA expression level of Ephrin-B3 after different treatments in each group

圖2 Ephrin-B3、PSD95、NR2B、GAPDH的溶解曲線Figure 2 Dissolution curves of Ephrin-B3, PSD95, NR2B and GAPDH

2.4 熒光定量PCR 檢測突觸受體相關蛋白的mRNA 表達水平慢病毒Ephrin-B3 過表達檢測成功后，檢測各組突觸相關因子PSD95、NR2B 的mRNA 表達變化，Ephrin-B3 過表達組的NR2B mRNA 相對表達水平（1.00±0.06）與模型組相對表達量（0.53±0.07）相比有顯著變化（F=19.51，P=0.001 0），與空載體組相對表達量（0.60±0.08）相比有明顯上升（P=0.003 4），模型組與注射空載體組相比無顯著變化；Ephrin-B3 過表達組的PSD95 mRNA相對表達量（0.90±0.13）比模型組（0.60±0.05）表達增多，差異有統計學意義（F=14.80，P=0.020 3），與空載體組相對表達量（0.57±0.06）相比表達增多（P=0.016 0），模型組與空載體組表達水平無明顯變化，結果顯示Ephrin-B3過表達會引起突觸相關蛋白mRNA 的表達水平升高，見圖2、圖3。

圖3 各組NR2B、PSD95的mRNA相對表達水平Figure 3 Relative mRNA expression levels of NR2B and PSD95 in each group

2.5 Western blotting檢測突觸相關受體蛋白表達水平免疫印跡結果顯示，轉染組Ephrin-B3蛋白表達相對表達量（0.87±0.03）較模型組（0.34±0.14）顯著升高（F=17.72，P=0.003 2），較空載體組相對表達水平（0.32±0.19）顯著升高（P=0.003 4）。與對照組相比，致癇模型組突觸后致密區蛋白PSD95 及突觸后離子型谷氨酸受體NR2B在SE 24 h后表達明顯下降；Ephrin-B3過表達轉染組NR2B 的相對表達量（1.02±0.31）與癲癇模型組（0.50±0.20）相比顯著增多（F=9.755，P=0.019 9），慢病毒轉染組與空載體組相對表達量（0.48±0.23）比較NR2B的蛋白表達量明顯增加，差異有統計學意義（P=0.014 4），致癇模型組與空載體組比較差異無統計學意義；轉染慢病毒組PSD95蛋白相對表達量（0.93±0.10）相較于癲癇模型組（0.69±0.06）顯著增加（F=7.889，P=0.014 5），較空載體組（0.71±0.04）均明顯增加，差異有統計學意義（P=0.025 3），模型組與空載體組PSD95蛋白表達量比較差異無統計學意義（P=0.99）。WB 統計結果顯示Ephrin-B3基因過表達會引起突觸相關蛋白PSD95、NR2B表達量增多。見圖4。

圖4 各組Ephrin-B3、NR2B、PSD95蛋白的表達Figure 4 Expressions of Ephrin-B3, NR2B and PSD95 in each group

3 討論

癲癇是神經系統疾病中的一種慢性常見病，以反復發作為特點［17］，病死率是一般人群的3 倍，其反復的癇性發作會給患者造成極大的心理負擔。焦慮、抑郁、偏頭痛等常成為癲癇患者的共患病，進一步造成患者病情惡化，因此，癲癇的有效治療成為全球亟待解決的問題，而TLE 不僅是常見的局灶性癲癇［18-20］，也是最常見的難治性癲癇［21-23］，且具有反復發作性、短暫性、難治性的特征，其發病率也在逐年增長［24］，成為近年來研究的熱點對象。Eph/Ephrin 雙向信號分子可以發揮多種生理功能［25-26］，既往研究發現，Ephrinb參與到脊髓損傷、外傷性腦損傷、膠質母細胞瘤、腦血管病等的發生與發展［27］，在神經系統中也可以引導樹突和軸突的生長，介導神經發生［28-29］。近年來，Ephrin-B3 在神經系統中的研究逐漸深入［8-13］，Ephrin-B3 作為Ephrinbs 家族蛋白成員之一，可廣泛參與到生物的各項生長發育中，包括細胞遷移、組織發育和突觸可塑性等。研究表明，在匹羅卡品致癇大鼠中增加Ephrin-B3 的刺激物或外源性Ephrin-B3 會抑制癲癇大鼠海馬的神經再生，參與到癲癇的發生發展過程中［30］。但目前關于Ephrin-B3在顳葉癲癇突觸重塑的具體機制并不清楚。

研究發現致癇后急性期、靜止期、慢性期的Ephrin-B3蛋白表達均下調，說明Ephrin-B3在海馬組織的動態變化可能與癇性發作密切相關。此外，海馬PSD-95 位于突觸后膜具有信息整合功能，可以調節谷氨酸受體NMDA在突觸后膜的定位和轉運來控制突觸的可塑性［31］，在敲除PSD95的小鼠中，AMPA/NMDA 的比例降低，突觸興奮性降低［32］。Ephrin-B3具有招募和定位PSD95 的功能，可作為PSD95 的上游信號直接相互結合以控制PSD95在突觸后的定位與表達，進而調控突觸的可塑性［32］。N-甲基-D-天門冬氨酸受體分布于突觸后致密區，受電壓和配體的雙重支配。NR2B是NMDA的受體亞基之一，能明確具體亞基作用，針對具體靶點進行治療，可減輕目前藥物出現的因針對整個谷氨酸受體產生的神經抑制現象［33］。在Ephrin-B3 激活Ephb2 后，Ephb2 可直接與NMDA 相互作用促使其在突觸表面滯留［34］，使突觸后NMDA的亞單位NR2B磷酸化水平增加，從而抑制AMPA受體在突觸后膜的瞄定，突觸后電位減少，導致突觸興奮性降低，誘導LTD 的形成［35］。以上結論均提示Ephrin-B3 可通過在海馬調控突觸后受體NMDA 的NR2B 亞基以及PSD95 誘導突觸LTP 或LTD發生，從而調控突觸可塑性控制癲癇發作。

本研究采用氯化鋰-匹羅卡品點燃的顳葉癲癇大鼠進行腦部海馬區慢病毒Ephrin-B3 注射，應用Western blot和熒光定量PCR技術檢測海馬區轉染病毒后突觸相關受體PSD95、NR2B 的mRNA 及蛋白表達水平的改變，從而檢測酪氨酸蛋白激酶配體Ephrin-B3對突觸可塑性的調節作用，結果發現，慢病毒轉染海馬組織后，組織內Ephrin-B3及突觸相關受體PSD95、NR2B無論核酸水平還是蛋白水平的相對表達量均顯著上調，此外，觀察大鼠的癲癇發作潛伏期亦有明顯上調。本研究中模型組及空載體組相較于未做任何處理的空白對照組，結果顯示PSD95 及NR2B的表達水平均顯著下調，提示PSD95、NR2B與TLE的發病有關，與既往研究［14，36］結果一致。上述結果可證明，大鼠海馬過表達Ephrin-B3可通過在癲癇中上調突觸后蛋白PSD95、NMDA的NR2B受體亞基調節癲癇發作時的放電閾值，從而調節突觸的長時程抑制和長時程增強，其原因可能與Ephrin-B3抑制NR2B 在癲癇發作時向磷酸化轉換有關，導致NR2B在細胞膜表達增加，而PSD95 表達增加與Ephrin-B3對其在突觸后的招募有關，PSD95 可促進樹棘突的成熟，與癲癇發作急性期認知功能的恢復有關［37-39］。因此，Ephrin-B3 在TLE 的發作中作為抑制因子發揮保護作用。

過表達Ephrin-B3 基因可以在動物模型中減輕大鼠的癲癇發作，其作用機制可能與控制突觸后蛋白表達有關。因此，Ephrin-B3 有望成為顳葉癲癇新的治療靶點，同時為軸突導向蛋白Ephrin-B3與突觸相關蛋白PSD95和NMDA之間的功能關系提供新的見解。