川陳皮素調節AMPK/NLRP3 信號通路對脂多糖誘導的腎小球系膜細胞炎性損傷的影響

羅丹，王燕，丁旭，胡耀（.成都大學附屬醫院血液凈化中心，四川成都 6008；.成都大學附屬醫院腎病內科，四川成都 6008）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病的常見并發癥，包括I 型和II 型，是世界各地終末期腎病的主要原因[1]。糖尿病腎病的特征是系膜細胞增殖、系膜細胞外基質（extracellular matrix，ECM）增厚、腎肥大和隨后的腎小球硬化。除ECM 蛋白積累外，炎癥也是糖尿病腎病的標志，在該疾病的發生和發展中起著重要作用[2]。已有研究[3]報道稱，抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的大鼠腎小球系膜細胞（mesangium cells，MC）ECM 積累和炎癥對于防治糖尿病腎病起到積極效果。

川陳皮素（Nobiletin）是柑橘類水果皮中的一種生物活性物質，據報道其是一種有效的抗炎和抗菌劑[4]。有報道[5]稱，川陳皮素可以改善鏈脲佐菌素-鎘誘導的大鼠糖尿病腎病。川陳皮素可以抑制高葡萄糖誘導的炎癥和ECM 在腎小球系膜細胞的積累[6]。腎小球系膜細胞約占腎小球細胞的1/3，在維持細胞平衡中發揮重要作用，腎小球系膜細胞是體外研究糖尿病腎病的常見細胞[7]。AMP 激活的蛋白激酶（AMPactivated protein kinase，AMPK）/NOD 樣受體蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）信號通路是研究糖尿病腎病的常見通路，有報道[8]稱，通過促進AMPK 表達來抑制NLRP3 炎癥小體活化可以改善糖尿病腎病造成的腎損傷。近期還發現，川陳皮素可以通過調控AMPK 途徑促進自噬來改善NLRP3 炎癥小體介導的炎癥，進而對LPS處理的大鼠小膠質細胞起到保護作用[9]，故推測川陳皮素可能通過調節AMPK/NLRP3通路對LPS誘導的腎小球系膜細胞損傷起到改善效果。

本研究擬探索川陳皮素是否可以通過調節AMPK/NLRP3通路來緩解LPS誘導的腎小球系膜細胞炎性損傷，以期為糖尿病腎病的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥物及試劑 川陳皮素（Nobiletin），純度≥97%，購自美國Sigma-Aldrich 公司，批號：N1538；AMPK/NLRP3 信號通路抑制劑雷帕霉素、LPS、MTT 細胞毒性以及細胞增殖檢測試劑盒、二甲基亞砜（DMSO），購自北京索萊寶生物科技有限公司，批號分別為：R8140、 L8880、 M1020、 D8370； 白細胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、過氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒，購自伊艾博（武漢）科技股份有限公司，批號分別為：E0563h、U0079h、E0133h、E0242h；谷胱甘肽（glutataione，GSH）試劑盒，購自上海齊源生物科技有限公司，批號：QYS-231068；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、細胞凋亡檢測試劑盒，購自北京百奧萊博科技有限公司，批號分別為：SNM203、YT131；兔源一抗AMPK、NLRP3 抗體，購自美國Abcam 公司，批號分別為：ab32047、ab263899。

1.2 主要儀器 Multiskan FC 酶標儀，美國Thermo Fisher 公司；FACSCalibur 流式細胞儀，美國Becton-Dickinson公司。

1.3 細胞培養及分組 大鼠腎小球系膜細胞HBZY-1，購自上海烜雅生物科技有限公司。將購買的HBZY-1細胞接種于DMEM 培養基（10%胎牛血清），置于37 ℃細胞培養箱中培養，分為5組：正常組，DMEM培養基（10%胎牛血清）培養HBZY-1細胞，未做其他任何處理；LPS 組，用100 ng·mL-1的LPS 處理HBZY-1 細胞24 h 后加入DMEM 培養基（10%胎牛血清）24 h[3]；川陳皮素組，HBZY-1 細胞在經過100 ng·mL-1的LPS 處理24 h 后加入40 μmol·L-1的川陳皮素24 h[10]；雷帕霉素組，HBZY-1 細胞在經過100 ng·mL-1的LPS 處理24 h 后加入0.5 μmol·L-1雷帕霉素24 h[11]；川陳皮素+雷帕霉素組，細胞在經過LPS 處理24 h 后，同時加入40 μmol·L-1的川陳皮素和0.5 μmol·L-1雷帕霉素，孵育24 h 后用于后續實驗。

1.4 MTT 法檢測細胞毒性檢測 將HBZY-1 細胞以每孔5×104個細胞的密度接種在96孔板中。培養24 h后，分別用不同濃度的川陳皮素（0、10、20、30、40、50 和60 μmol·L-1）處理HBZY-1 細胞24 h。然后在每個孔中加入25 μL MTT（5 mg·mL-1）溶液，37 ℃培養4 h，再在每孔加入100 μL二甲基亞砜。輕微震蕩后，用酶標儀在570 nm處檢測吸光度值。

1.5 MTT 法檢測細胞增殖 將HBZY-1 細胞以每孔5×104個細胞的密度接種在96 孔板中培養24 h，按“1.3”項下方法處理各組細胞后，向每孔加入20 μL MTT（5 mg·mL-1），并在37 ℃下再孵育4 h。然后小心去除培養基并加入150 μL 二甲基亞砜以溶解結晶顆粒，使用酶標儀在570 nm處測量吸光度值。

1.6 細胞炎性指標、氧化應激檢測 按酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒說明書，測定各組細胞IL-1β、IL-6、TNF-α、CAT、SOD、GSH含量。

1.7 流式細胞術檢測細胞凋亡 將各組HBZY-1 細胞以800 r·min-1（離心半徑10 cm）、4 ℃離心5 min，并用預冷的磷酸鹽緩沖液洗滌2 次。用1 mL 1×Binding Buffer 重懸細胞，按照試劑盒說明各組細胞分別加入5 μL Annexin V-FITC 和PI，孵育15 min（室溫避光），利用流式細胞儀測定各組細胞凋亡率。

1.8 Western Blot 法檢測AMPK/NLRP3 信號通路蛋白水平在RIPA 裂解緩沖液中裂解HBZY-1 細胞。使用蛋白質測定試劑盒進行總蛋白定量。將等體積的蛋白質加載到10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳上進行分離，并轉移到聚偏二氟乙烯膜，封閉1 h 后，在4 ℃下用AMPK（1∶1 000）、NLRP3（1∶2 000）和GAPDH 抗體（1∶1 000）的一抗處理過夜。然后加入二抗（1∶2 000）室溫放置1 h，最后用ECL顯色劑使目的條帶顯色，以ImageJ軟件分析目的條帶的灰度值。

1.9 統計學處理方法 采用Graphpad Prism 8.0 軟件分析，計量資料呈正態分布，以均數±標準差（±s）表示，單因素方差分析和SNK-q檢驗用于比較多組間差異。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 川陳皮素對HBZY-1 細胞的影響 見表1。MTT檢測結果顯示，0、10、20、30、40、50和60 μmol·L-1的川陳皮素對HBZY-1 細胞OD 值無明顯影響（P＞0.05），表明0～60 μmol·L-1的川陳皮素對HBZY-1細胞無明顯毒性。故選用40 μmol·L-1的川陳皮素進行下一步實驗。

表1 川陳皮素對HBZY-1 細胞的影響（±s，n=6）Table 1 Effects of nobiletin on HBZY-1 cells（±s，n=6）

表1 川陳皮素對HBZY-1 細胞的影響（±s，n=6）Table 1 Effects of nobiletin on HBZY-1 cells（±s，n=6）

濃度/（μmol·L-1）0 10 20 30 OD值0.44±0.04 0.45±0.05 0.47±0.06 0.48±0.05濃度/（μmol·L-1）40 50 60 OD值0.46±0.04 0.49±0.07 0.43±0.04

2.2 川陳皮素對LPS 誘導的HBZY-1 細胞增殖的影響見表2。與正常組比較，LPS 組細胞OD 值明顯下降（P＜0.05）；與LPS組比較，川陳皮素組細胞OD 值明顯升高（P＜0.05），而雷帕霉素組細胞OD值明顯下降（P＜0.05）；與川陳皮素組比較，川陳皮素+雷帕霉素組細胞OD值明顯下降（P＜0.05）。

表2 川陳皮素對脂多糖（LPS）誘導細胞增殖能力的影響（±s，n=6）Table 2 Effects of nobiletin on LPS-induced cell proliferation（±s，n=6）

表2 川陳皮素對脂多糖（LPS）誘導細胞增殖能力的影響（±s，n=6）Table 2 Effects of nobiletin on LPS-induced cell proliferation（±s，n=6）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與LPS 組比較，#P＜0.05；與川陳皮素組比較，&P＜0.05

組別正常組LPS組川陳皮素組雷帕霉素組川陳皮素+雷帕霉素組OD值0.49±0.05 0.25±0.04*0.45±0.05#0.10±0.02#0.32±0.04&

2.3 川陳皮素對LPS 誘導的HBZY-1 細胞炎性因子的影響見表3。與正常組比較，LPS組IL-1β、IL-6、TNF-α 含量明顯增加（P＜0.05）；與LPS 組比較，川陳皮素組IL-1β、IL-6、TNF-α 含量明顯降低（P＜0.05），而雷帕霉素組IL-1β、IL-6、TNF-α含量明顯升高（P＜0.05）；與川陳皮素組比較，川陳皮素+雷帕霉素組IL-1β、IL-6、TNF-α含量明顯增加（P＜0.05）。

表3 川陳皮素對脂多糖（LPS）誘導HBZY-1 細胞炎性因子的影響（±s，n=6）Table 3 Effects of nobiletin on LPS-induced inflammatory factors in HBZY-1 cells（±s，n=6）

表3 川陳皮素對脂多糖（LPS）誘導HBZY-1 細胞炎性因子的影響（±s，n=6）Table 3 Effects of nobiletin on LPS-induced inflammatory factors in HBZY-1 cells（±s，n=6）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與LPS 組比較，#P＜0.05；與川陳皮素組比較，&P＜0.05

組別正常組LPS組川陳皮素組雷帕霉素組川陳皮素+雷帕霉素組IL-1β/（pg·mL-1）100.52±13.56 185.63±21.25*119.46±14.46#334.58±41.26#168.34±18.25&IL-6/（pg·mL-1）20.52±2.08 41.71±4.66*24.45±2.79#62.68±6.74#38.41±4.13&TNF-α/（pg·mL-1）40.45±4.05 120.08±13.52*57.78±6.81#239.45±27.91#104.24±11.34&

2.4 川陳皮素對LPS 誘導的HBZY-1 細胞氧化應激的影響見表4。與正常組比較，LPS 組SOD、GSH、CAT 水平明顯降低（P＜0.05）；與LPS 組比較，川陳皮素組SOD、GSH、CAT 水平明顯升高（P＜0.05），而雷帕霉素組SOD、GSH、CAT 水平明顯降低（P＜0.05）；與川陳皮素組比較，川陳皮素+雷帕霉素組SOD、GSH、CAT水平明顯降低（P＜0.05）。

表4 川陳皮素對脂多糖（LPS）誘導HBZY-1 細胞氧化應激的影響（±s，n=6）Table 4 Effects of nobiletin on LPS-induced oxidative stress in HBZY-1 cells（±s，n=6）

表4 川陳皮素對脂多糖（LPS）誘導HBZY-1 細胞氧化應激的影響（±s，n=6）Table 4 Effects of nobiletin on LPS-induced oxidative stress in HBZY-1 cells（±s，n=6）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與LPS 組比較，#P＜0.05；與川陳皮素組比較，&P＜0.05

組別正常組LPS組川陳皮素組雷帕霉素組川陳皮素+雷帕霉素組SOD/（U·mL-1）345.24±34.65 278.76±28.76*340.97±33.65#215.43±22.45#279.98±27.92&GSH/（mg·mL-1）15.34±1.52 12.76±1.34*15.08±1.50#9.32±1.32#12.93±1.39&CAT/（μmol·L-1）5.71±0.53 3.70±0.36*5.35±0.54#1.64±0.16#3.85±0.38&

2.5 川陳皮素對LPS 誘導的HBZY-1 細胞凋亡的影響見表5。與正常組比較，LPS 組細胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）；與LPS 組比較，川陳皮素組凋亡率明顯下降（P＜0.05），而雷帕霉素組凋亡率明顯升高（P＜0.05）；與川陳皮素組比較，川陳皮素+雷帕霉素組凋亡率明顯上升（P＜0.05）。

表5 川陳皮素對脂多糖（LPS）誘導細胞凋亡的影響（±s，n=6）Table 5 Effects of nobiletin on LPS-induced apoptosis（± s，n=6）

表5 川陳皮素對脂多糖（LPS）誘導細胞凋亡的影響（±s，n=6）Table 5 Effects of nobiletin on LPS-induced apoptosis（± s，n=6）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與LPS 組比較，#P＜0.05；與川陳皮素組比較，&P＜0.05

組別正常組LPS組川陳皮素組雷帕霉素組川陳皮素+雷帕霉素組凋亡率/%6.05±0.62 20.38±2.57*7.31±0.71#31.57±3.15#18.36±1.73&

2.6 川陳皮素對LPS 誘導的HBZY-1 細胞AMPK/NLRP3 通路的影響 見圖1、表6。與正常組比較，LPS 組AMPK 蛋白水平明顯下調（P＜0.05），NLRP3蛋白水平明顯上調（P＜0.05）。與LPS 組比較，川陳皮素組AMPK 蛋白水平明顯上調（P＜0.05），NLRP3蛋白水平明顯下調（P＜0.05）；而雷帕霉素組AMPK蛋白水平明顯下調（P＜0.05），NLRP3 蛋白水平明顯上調（P＜0.05）。與川陳皮素組比較，川陳皮素+雷帕霉素組AMPK 蛋白水平明顯下調（P＜0.05），NLRP3蛋白水平明顯上調（P＜0.05）。

圖1 Western Blot 法檢測AMPK/NLRP3 通路相關蛋白表達Figure 1 Western Blot analysis of AMPK / NLRP3 pathway related protein expression

表6 川陳皮素對脂多糖（LPS）誘導HBZY-1 細胞AMPK/NLRP3 通路的影響（±s，n=6）Table 6 Effect of nobiletin on AMPK/NLRP3 pathway in LPSinduced HBZY-1 cells（±s，n=6）

表6 川陳皮素對脂多糖（LPS）誘導HBZY-1 細胞AMPK/NLRP3 通路的影響（±s，n=6）Table 6 Effect of nobiletin on AMPK/NLRP3 pathway in LPSinduced HBZY-1 cells（±s，n=6）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與LPS 組比較，#P＜0.05；與川陳皮素組比較，&P＜0.05

組別正常組LPS組川陳皮素組雷帕霉素組川陳皮素+雷帕霉素組AMPK/GAPDH 0.94±0.09 0.56±0.06*0.89±0.09#0.33±0.03#0.62±0.06&NLRP3/GAPDH 1.09±0.16 1.67±0.18*1.18±0.13#2.51±0.27#1.53±0.16&

3 討論

糖尿病因其發病率迅速上升和巨大的經濟負擔，已成為世界范圍內公認的嚴重公共衛生問題。2019 年，全球糖尿病患病率約為9.3%（4.63 億成年人），預計到2030 年上升至10.2%（5.78 億）[12]。約30%～40%的糖尿病患者患有糖尿病腎病，糖尿病腎病是糖尿病最嚴重的微血管并發癥之一。糖尿病腎病還是終末期腎臟疾病的主要原因，并被認為是一種慢性炎癥性疾病[13]。盡管關于糖尿病腎病的研究已有大量報道，但糖尿病腎病的確切發病機制尚未得到充分解釋。由于LPS誘導的腎小球系膜細胞病理變化與糖尿病腎病的病理特征相似，因此，LPS誘導的腎小球系膜細胞常用于體外模擬糖尿病腎病。川陳皮素是從柑橘類植物中分離出來的多甲氧基類黃酮，有抗炎和抗糖尿病的作用[14]。有報道[15]稱，川陳皮素可改善葡萄糖代謝并減少與妊娠糖尿病相關的炎癥，并且可能是預防妊娠糖尿病的新型療法。有報道[5]稱，川陳皮素可能抑制炎癥反應以及氧化應激改善鏈脲佐菌素-鎘誘導的大鼠糖尿病腎病。以上研究提示川陳皮素可能通過抑制炎癥反應對糖尿病以及糖尿病并發癥（例如糖尿病腎?。┢鸬椒e極影響。本研究用不同濃度0～60 μmol·L-1的川陳皮素處理HBZY-1細胞，結果發現，0～60 μmol·L-1的川陳皮素對HBZY-1 細胞無明顯毒性。我們參考有關研究[3]用100 ng·mL-1的LPS 處理HBZY-1 細胞，結果發現，HBZY-1 細胞的OD 值明顯降低，而川陳皮素處理LPS誘導的HBZY-1細胞后，HBZY-1細胞OD值明顯升高，說明川陳皮素可能對LPS 誘導的HBZY-1細胞生長起到促進作用。

氧化應激和炎癥在糖尿病腎病的發展中起著至關重要的作用，可以通過緩解氧化應激和炎癥來治療糖尿病腎病[16]。有研究報道稱，高血糖會引起ROS的過量產生，導致氧化應激，氧化應激引起一系列代謝和細胞紊亂，包括脂質過氧化、蛋白質氧化和DNA損傷，最終導致腎細胞凋亡[17]；此外，氧化應激還可以通過刺激相關生長因子、細胞因子和轉錄因子的產生來促進炎癥反應，加重腎損傷[18]。SOD 催化O2-轉化為H2O2，H2O2可以在CAT 或GPX 催化的反應中進一步還原為H2O 從而抑制ROS 的產生[19]，而涉及GPX 的反應需要GSH 的氧化[20]。因此，SOD、CAT、GSH 可以直接或間接地反映機體抗氧化水平。炎癥反應通常由氧化應激和ROS 介導，炎癥介質參與或誘導炎癥反應發生，IL-6、IL-1β和TNF-α是糖尿病腎病發生的關鍵促炎因子，抑制IL-1β、IL-6、TNF-α的釋放可以抑制糖尿病腎病進展[21]。本研究發現，LPS 處理后HBZY-1 細胞CAT、SOD、GSH 水平明顯降低，細胞凋亡率、IL-1β、IL-6、TNF-α 含量明顯升高，表明LPS 處理HBZY-1細胞誘導其發生氧化應激，進而促進其細胞凋亡以及炎癥的發生。川陳皮素處理LPS 誘導的HBZY-1 細胞后，HBZY-1 細胞CAT、SOD、GSH水平明顯升高，細胞凋亡率、IL-1β、IL-6、TNF-α 含量明顯降低，表明川陳皮素可抑制LPS 誘導的HBZY-1 細胞氧化應激、炎癥以及細胞凋亡。

AMPK/NLRP3 信號通路是廣泛研究的炎癥通路，上調AMPK/NLRP3 信號傳導可以減輕糖基化終產物誘導的人臍靜脈內皮細胞炎癥和氧化應激損傷[22]。Hou等[23]也發現，增加AMPK活性，同時抑制NLRP3蛋白水平可以減輕糖尿病腎小管上皮細胞氧化應激損傷，進而改善小鼠糖尿病腎病。本研究結果顯示，LPS 處理后，HBZY-1 細胞AMPK 蛋白低表達，NLRP3 蛋白高表達；而川陳皮素處理LPS 誘導的HBZY-1 細胞后，HBZY-1 細胞AMPK 蛋白水平明顯升高，NLRP3 蛋白水平明顯降低，提示川陳皮素可能是通過激活AMPK/NLRP3 信號通路減輕氧化應激和炎性損傷，進而對LPS 誘導的HBZY-1細胞起到改善作用。為了進一步證實川陳皮素可能是通過激活AMPK/NLRP3 信號通路來發揮作用，我們在HBZY-1細胞經過LPS 處理后，同時加入川陳皮素和AMPK/NLRP3 信號通路抑制劑雷帕霉素，結果發現，雷帕霉素與川陳皮素的作用效果相反，雷帕霉素消除了川陳皮素對LPS誘導的HBZY-1細胞的保護作用。

綜上所述，川陳皮素可能通過促進AMPK 的表達來抑制NLRP3表達，從而改善LPS誘導的HBZY-1細胞氧化應激損傷、炎性損傷以及細胞凋亡，今后可通過體內實驗進行進一步研究。另外，川陳皮素是否可以通過上調AMPK/NLRP3 信號通路緩解其他腎病，仍需進一步探究。