大規模高生物安全等級車間管道的設計與實施

徐舟

（上海諾狄生物科技有限公司，上海 201613）

現代生物技術的開發和應用可能會帶來生物安全問題，所以采取有效的預防和控制措施，保護人員，環境和生態的安全一直是醫藥行業的重點話題。21世紀以來，經歷了SARS，非典特別是新冠病毒的洗禮，高生物安全等級的大規模疫苗生產車間成為了行業需求。而在獸藥行業，口蹄疫疫苗生產早已采用了大規模懸浮細胞培養，需要生產車間符合BSL3（生物安全等級三級），動物房符合ABSL3 級（動物生物安全等級三級）要求。高生物安全等級生產車間的需求與日俱增。

1 生物安全等級的分類

經典的生物安全等級由美國《微生物和生物醫學實驗室的生物安全》（BMBL）在第一版中提出概念，接著在第三版中根據微生物對人的危險程度將實驗室安全防護等級分為四個級別。我國也采用了類似的分級原則，按照GB 19489 和GB 50346 分級見表1[1]。

表1 我國生物安全等級分級 [1]Tab.1 Biosafety level definition

但WHO 在2020 年更新的《實驗室生物安全手冊》第四版中特別強調了實驗室實際風險不僅受到所操作生物介質的影響，還受到所執行的程序和從事實驗室活動的實驗人員能力的影響，可以在每個個案基礎上平衡安全措施和實際風險[2]。這體現了更加靈活和貼近實際需求的特點，但這需要相關人員有更高的專業水平，做出更合理的風險評估，執行人員也要更有風險意識。

2 大規模高生物安全等級設施的法規要求

對于商業化生產車間，操作的生物介質已經遠遠超過一般實驗室的常規用量，具有設備多，面積大，流程復雜的特點?；诖?，我國農業部于2017 年頒布了《獸用疫苗生產企業生物安全三級防護標準》，針對獸藥高生物安全等級生產設施進行了要求。2020年五部聯合頒布的《疫苗生產車間生物安全通用要求》則對人用藥物大規模生產設施建設提供了依據。對高生物安全等級疫苗車間的布置，維護結構，空調系統，供水供氣，滅活，電力供應，自控等做出了具體要求。

歐美發達國家生物實驗室安全體系建設較早，歐洲口蹄疫設施最低標準第一次頒布于1985 年，最新版本為2009 版，為我國農業部2017 年頒布的三級防護標準提供了一些參考。美國BMBL 第6 版附錄M 專門針對大規模生物安全設施進行了關注。指出大規模設施除了關心生物安全，還需對大型設備和大量化學品的使用進行風險評估。在符合生物安全的同時，還需考慮GMP（藥品生產質量管理規范），GLP（藥物非臨床研究質量管理規范），GCP（藥物臨床試驗管理規范）的要求[3]。

3 高生物安全等級車間內管道設計

高等級生物安全實驗室，車間關于物品出入的幾項原則如下：

● 不得帶入和防護區內實驗，生產無關的物品。

● 帶出防護區的物品必須保證在防護區內沒有受到污染，若有被污染則必須進行滅活處理。

● 所有廢棄物必須在防護區內清除污染，保證沒有活毒帶出防護區。

這也同樣適用于防護區內管道設計，整體來說，出入防護區的管道系統如圖1 所示。

圖1 穿越防護區管道系統簡圖Fig.Pipe systems crossing containment area

對于自來水，軟化水這些非潔凈水系統，給水管道應設置防回流裝置，防回流裝置應設置在輔助工作區，方便維護的地方。典型的給水原理圖如圖2所示。

圖2 防護區供水系統簡圖Fig.2 Water supplement for containment area

在穿越防護區位置，國內還經常使用套管加填料的形式，高級別生物安全需要在外部再焊接密封鋼板以保證通過防護區的密封性測試，見圖3。

圖3 管道穿越圍護結構簡圖Fig.3 Detail structure of pipe penetration for containment area

預埋成品穿墻器和專業成品穿墻器則更有保障，但成本較高，無論哪種方式，都建議集中布置，盡量減少現場臨時打孔。

對于大型疫苗車間，有毒區病毒培養、收獲、滅活，設備CIP，還會用到大量純化水，注射用水，為了維持防護區用水，建議防護區的純水、注射用水發生器與非防護區分開為獨立系統，設備放在輔助區方便維護。和一般供水系統一樣，純水，注射用水也需設計成只送不回。但純水，注射用水為潔凈系統，需要考慮系統微生物滋生，長管道不循環有悖于這個需求，針對該難點可以考慮如下的方案，見圖4。

圖4 有毒區注射用水供給方案簡圖Fig.4 WFI supply for high hazard area

該方案需在供水閥上集成純蒸汽供氣閥，在靠近儲水罐頂的入口增加自動開關閥和疏水旁路。這樣，當水罐求水結束時，供水閥關閉，罐頂的開關閥也依次關閉，然后純蒸汽閥門開啟，疏水旁通開啟。首先由于蒸汽的高溫，起到了對管道SIP 的作用，防止了微生物在管道的潮濕環境滋生。其次，由于蒸汽的正壓，又充當了管道進入防護區的氣封，防止氣溶膠從有毒區擴散到無毒區。

而對于純水，注射用水分配系統，由于都是循環設計，無法做到只送不回，應該在防護區內設置獨立系統。

對于大型生物反應器，溫控單元還需要接入冷凍水和工業蒸汽等介質。由于冷凍水為閉式系統，只通入設備夾套，并不直接接觸物料，不接觸病毒，可在冷凍水進出防護區的主管上安裝切斷閥。而在靠近進出防護區的低點設置系統排盡閥，以備系統被污染時，排空被污染的介質。排放的介質直接接入防護區內的滅活系統。

工業蒸汽雖然在滅活工序直接接觸病毒，但由于大部分病毒不耐高溫，風險較小?？稍谡羝M入防護區的主管上安裝切斷閥。但在滅活罐這種大用量的用點，應考慮蒸汽大量冷凝時或泄漏時產生的低壓回流風險，在用點主管上需設置壓力檢測，壓力過低時自動切斷用點供氣，待罐內壓力回升時再通入蒸汽。防護區內的蒸汽凝結水為獨立收集系統，最終接入滅活系統和其他廢水統一滅活。

防護區內的排水需與非防護區隔離，為獨立系統，末端與防護區內的滅活系統相連。排水管的通氣管道和防護區內排氣要求類似，應設置雙高效過濾器，并可進行原位消毒和檢漏。防護區內的地漏和開放式排水管還應設置水封或存水彎，深度應根據房間負壓程度進行測試，保證所有情況下都充滿水或消毒液，并定期檢查補充。筆者參與的項目防護區內排水分為生產清洗CIP 排水，SIP 蒸汽凝結水收集系統和生產其他排水，最后都接入滅活系統的收集罐，防護區內不設衛生間，沒有生活排水。系統主管上預留接口，用于給整個系統進行蒸汽滅菌或化學滅菌。

對于滅活后的廢水，最終需送至防護區外的廢水處理系統或危廢暫存。滅活罐工作時，會在內部產生大量氣溶膠，并且有大量高溫蒸汽，一般其出防護區的管道上會安裝雙重切斷閥。本人項目中還在出口管道上設置了蒸汽屏障，即使有微量介質泄漏也會被高溫蒸汽殺死，見圖5。

圖5 滅活廢水蒸汽屏障Fig.5 Steam barrier for decontamination system

對于氣體管道，小型實驗室為氣瓶供給，大型生產車間為液態儲罐，一般都放在防護區外易更換和維護的地方（壓縮空氣需有備用空壓機）。在管道穿越防護區處應安裝防回流裝置。本人項目中在管道進入防護區處還安裝了一個0.22 μm 的過濾器，雖然不能過濾病毒，但可以作為氣溶膠防止的冗余。各工藝用氣點需設置無菌過濾器。

BMBL-6 指出生物和化學反應壓力容器和管線有產生氣溶膠的風險，是大型生物過程獨有的風險因素之一。例如對于滅活疫苗生產，首先要在無毒區進行基礎細胞的培養，待細胞達到一定密度后，將基礎細胞轉移至有毒區進行病毒接種，然后再繼續病毒培養。大型生物反應器一般使用無菌壓縮空氣通過管道進行轉送。病毒培養反應器雖然在工作時為封閉系統，但培養階段內部都有比較高的病毒滴度，會產生高濃度氣溶膠。除了罐頂的切斷閥，一般會在物料管道穿防護區處安裝止回閥。物料傳輸多為潔凈管道，早期ASME BPE（2014 版之前）并不推薦在潔凈管道系統使用止回閥，隨著技術的發展，雖然已出現衛生型止回閥，但仍有容易泄漏的風險，并且很難檢測。針對本問題，可以考慮使用下面的方案，見圖6。

圖6 物料管道氣體屏障簡圖Fig.6 Air barrier for process pipe

其原理是在管道穿越防護區處設置空氣屏障，在輸送管線經過CIP 后，使用潔凈壓縮空氣吹掃并在兩個切斷閥間形成氣封，并實時監測氣封內壓力。

對于大型不銹鋼反應器，其管道系統設計其實為工藝系統設計的一部分，需要考慮設備的各個工序。主要包含SIP 前的泄漏檢測，管道SIP，設備SIP（大罐子還有預熱），SIP 后的吹掃，保壓，物料傳送前的泄壓，物料傳送，物料恒溫操作，設備CIP，物料傳輸后管道CIP。對于接觸活病毒的設備可能還有化學滅活或熱滅活。下面以一個病毒培養反應器為例，講解一下其中的注意事項：

首先，所有接觸物料的管道（包括輔料）使用前都要進行SIP，SIP 前要進行泄漏測試，SIP 后未使用前要保持正壓，如圖7 所示。

圖7 不銹鋼系統SIP 工序簡圖Fig.7 SIP for stainless steel cell culture system

其次，要注意物料橫跨無毒有毒區時，SIP，CIP 和吹掃的介質都需從無毒區通入，并且只送不回，所有蒸汽凝水，CIP 廢水都接入有毒區的滅活系統。如果管道分段，則有毒區，無毒區各段分別進行泄漏測試，SIP，保壓，泄壓和使用后的CIP。交接處一般設在有毒區內，所以無毒區部分還是只送不回。例如前面提到的帶氣體屏障的物料管道，如圖8所 示。

圖8 帶氣體屏障物料管道的SIP 示意圖Fig.8 SIP for process pipe with air barrier

最后，所有設備，管道在物料輸送結束后，需要進行CIP，接觸活病毒的部件在CIP 前還必須進行滅活工序。

4 結束語

總體來說，高生物安全等級內管道宜明敷，方便維護。有接觸物料風險的管道都需設計成只送不回，其穿越防護區圍護結構時尤需注意。防護區內排氣都需兩級高效過濾，并可原位消毒和檢漏。防護區內所有廢水都需接入滅活系統滅活。潔凈系統考慮生物安全的同時還需考慮系統微生物的抑制。進行SIP并作為氣封是一個可行的解決方案。不銹鋼生產系統使用前需將所有有關管道進行泄漏測試，SIP，使用后需進行CIP，接觸活病毒的還需進行滅活。優秀的系統可以實現過程全自動化。